Sitio de estudio

El experimento se realizó en condiciones controladas en el Laboratorio de Fisiotécnia Vegetal del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR) localizado al noroeste de la Ciudad de La Paz, B.C.S., México, a los 24° 08’ 10.03” N y 110° 25’ 35.31” O, a 7 m de altura sobre el nivel del mar. Se utilizaron semillas de las variedades Napoletano, Emily y Nufar (Seed Company^®, USA), previo al experimento se realizó una prueba de germinación para cada variedad, utilizando la metodología ISTA (2010).

Diseño experimental

Se utilizó un diseño completamente al azar con arreglo trifactorial de 3A × 4B × 4C, donde las variedades de albahaca (Napoletano, Emily y Nufar) fueron el Factor A; el Factor B fueron cuatro concentraciones de NaCl (0, 50, 100 y 150 mM) y el Factor C fueron cuatro dosis del bioestimulante natural FitoMas-E^® (0, 0.5, 1 y 1.5 mL L^-1). Se utilizaron cuatro repeticiones por tratamiento de 30 semillas cada una. Las semillas se desinfectaron previamente mediante la inmersión en una solución de hipoclorito de calcio con 5% de cloro activo durante 5 min. Las semillas, posteriormente se lavaron con agua destilada y se colocaron en cajas Petri (150 × 15 mm) esterilizadas, cubiertas con una lámina de papel de f iltro Whatman^® No. 1, que se utilizó como sustrato. Las cajas Petri se humedecieron con las combinaciones de soluciones de FitoMas-E^® y las concentraciones salinas (NaCl) correspondientes y posteriormente se incubaron en una cámara de germinación (Lumistell^®, modelo IES-OS, serie 1408-88-01) a una temperatura de 25 ± 1 °C, 80% de humedad y 12 h luz continua durante 14 días.

Composición del FitoMas-E^®

Es un fitoestimulante derivado de la industria azucarera obtenido y desarrollado en el Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar. Es una mezcla de sales minerales y sustancias bioquímicas de alta energía, seleccionadas del conjunto más representado en los vegetales superiores, con un contenido de 6.94% de aminoácidos totales (16 aminoácidos) de los cuales, 50% son alifáticos y 30% aromáticos y heterocíclicos, 2.5% de sacáridos, 20% de materia orgánica, 3% de polisacáridos biológicamente activos, 1.5% de lípidos y bases nitrogenadas, 6.5% de nitrógeno total, 5.24% de potasio y 2.7% de fósforo (^{Montano et al., 2007}).

Porcentaje de germinación

La germinación se registró diariamente hasta los 14 días, considerando como semilla germinada cuando la radícula presentó alrededor de 2 mm de longitud. El porcentaje de germinación se determinó a los 14 días. La tasa de germinación se calculó usando la ecuación de ^{Maguire (1962)}: M = n₁/t₁ + n₂/t₂ +…n₃₀/t₁₄; donde n₁, n₂,… n₃₀ son el número de semillas germinadas en los tiempos t₁, t₂,… t₁₄ (hasta los 14 dias)

Variables morfométricas

Para determinar la longitud de la radícula (cm) y parte aérea (cm) se seleccionaron 10 plántulas al azar por cada tratamiento y ambas variables se calcularon con un analizador de imágenes (WinRhizo^® Regent Instruments Inc.). El peso fresco (mg) y seco de la radícula (mg) y la parte aérea (mg), se determinaron mediante una balanza analítica (Mettler Toledo^®, modelo AG204). Los tejidos vegetales divididos en parte aérea y radícula se colocaron en bolsas de papel y se introdujeron en una estufa de secado (Shel-Lab^®, modelo FX-5, serie-1000203) a una temperatura de 70 ºC durante 72 h que se obtuvo la deshidratación completa y se determinó el peso seco.

Análisis estadísticos

Se realizaron análisis de varianza y comparaciones múltiples de medias (Tukey HSD, P ≤ 0.05). En todas las variables, los valores promedio se consideraron significativamente diferentes cuando P ≤ 0.05. Los datos de porcentaje de germinación se transformaron mediante arcoseno (^{Steel y Torrie, 1995}). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa Statistica v. 10.0 para Windows^® (StatSoft^® Inc., 2011).

Porcentaje de germinación

El porcentaje de germinación (PG) mostró diferencias significativas entre variedades, NaCl, dosis de FitoMas-E^®, las interacciones variedades × NaCl y variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^®. El análisis de la interacción variedades × NaCl mostró que las tres variedades lograron el valor mayor de PG en 0 mM de NaCl (Cuadro 1) y conforme aumentó el nivel de NaCl de moderado a severo, disminuyó el PG, siendo más notable en concentraciones de 100 y 150 mM. En la triple interacción, los resultados mostraron que las tres variedades incrementaron el PG en aquellas semillas a las que se les aplicó FitoMas-E^®, aún con los efectos de concentraciones salinas de moderadas a severas el incremento registrado fue signif icativo (Cuadro 2). Para la interacción variedades × dosis de FitoMas-E^® no se encontró diferencia significativa; sin embargo, el análisis mostró una tendencia de incremento del PG cuando a las semillas que se les aplicó FitoMas-E^® en dosis de 0.5, 1 y 1.5 mL L^-1 (Cuadro 3).

Cuadro 1 Efecto de la interacción de variedades × NaCl en el porcentaje de germinación y variables morfométricas de plántulas de albahaca sometidas a estrés por NaCl y un bioestimulante. 

PG = porcentaje de germinación; LR = longitud de radícula; AP = altura de la plántula; BSR = biomasa seca de radícula. ^†Valores promedio con literales distintas en una misma columna difieren estadísticamente (Tukey HSD, P ≤ 0.05).

Cuadro 2 Efecto de la interacción de variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E® en el porcentaje de germinación de tres variedades de albahaca sometidas a estrés por NaCl y un bioestimulante. 

^† Valores promedio con literales distintas en una misma columna difieren estadísticamente (Tukey HSD, P ≤ 0.05).

Cuadro 3 Efecto de la interacción variedades × dosis de FitoMas-E^® en el porcentaje de germinación y variables morfométricas de plántulas de tres variedades de albahaca sometidas a estrés por NaCl y un bioestimulante. 

PG = porcentaje de germinación; LR = largo de radícula; AP: BFR = biomasa fresca de radícula; BFPA = biomasa fresca parte aérea. BSR = biomasa seca de radícula. ^† Valores promedio con literales distintas en una misma columna difieren estadísticamente (Tukey HSD, P ≤ 0.05).

Efecto de la interacción del estrés salino y FitoMas-E® en la tasa y porcentaje de germinación

El FitoMas-E^® presentó actividad antiestrés al NaCl en las tres variedades de albahaca, esta respuesta se debe a que contiene ácido glutámico, el cual actúa como agente osmótico del citoplasma de las células protectoras (^{Viñals-Verde et al., 2011}). Los resultados observados en el PG se deben a que al aumentar los niveles de NaCl, impiden una imbibición correcta y ocurre una inhibición del crecimiento del eje embrionario por un retraso de la movilización de reservas y a los disturbios de la membrana causado por la salinidad (^{Lamz-Piedra y González-Cepero, 2013}, ²⁰¹⁵). El fenómeno inhibitorio que se presentó en la germinación de las variedades de albahaca Emily, Napoletano y Nufar, se atribuyó a la toxicidad provocada por el exceso de NaCl, al estrés osmótico o a ambos, como lo han demostrado otros estudio (^{Khan y Rizvi, 1994}; ^{Khan y Ungar, 1998}; ^{Song et al., 2005}).

La salinidad pospone la iniciación de los procesos de germinación y reduce el número total de semillas germinadas, además influye de manera letal en la germinación, principalmente al disminuir el potencial osmótico de la solución del suelo para retardar la absorción de agua por las semillas y también por la toxicidad al embrión (^{Agüero-Fernández et al., 2016}). Estudios de estrés salino en otras especies apoyan lo que se ha comentado anteriormente. En hortalizas se incrementó la presión osmótica desde -0.33 hasta -0.86 Mpa y la germinación se redujo en 50% (^{Colla et al., 2010}). También se reportan diferencias en la germinación entre cultivares de garbanzo por efecto de soluciones salinas donde se obtuvo un porcentaje de germinación mayor en ILC-482 y Barkla y un potencial de agua de -0.03 MPa (^{Esechie et al., 2002}). En otras variedades de garbanzo se encontró que la germinación de Gokce y AKN-97 fue similar, pero fueron superiores a Uzunlu-99 (^{Kaya et al., 2008}). Las sales alteran el funcionamiento correcto de la membrana y de la pared celular, porque el NaCl afecta la permeabilidad de las membranas plasmáticas e incrementa el influjo de iones externos y el flujo de solutos citosólicos en las células de las plantas. El NaCl también causa un aumento en la conductividad hídrica de la membrana plasmática, lo que afecta el potencial del citosol, la extensibilidad celular, endurecimiento de la pared celular, repercutiendo negativamente en la germinación de las semillas (^{Katembe et al., 1998}). La reducción de la germinación en condición salina se debe al hecho de que la latencia se incrementa en las semillas por estrés salino. El fenómeno inhibitorio ocurrido en el proceso de germinación para todas las variedades de albahaca estudiadas, se atribuye al estrés osmótico o a la toxicidad provocada por exceso de Na⁺. Resultados similares encontró ^{Reyes-Pérez et al. (2013)} al observar que el porcentaje de germinación de las variedades de albahaca Napoletano y Emily, disminuyó en 50 y 100 mM de NaCl. Cuando las semillas de las tres variedades se trataron con FitoMas-E^®, se incrementó el porcentaje de germinación, lo cual se explica por el efecto mitigador del bioestimulante, relacionado con la presencia en su composición química de aminoácidos, entre los que destacan como mayoritarios, alanina, glicina, triptófano, valina, leucina y lisina, algunos de ellos con comprobado efecto en la actividad metabólica de las plantas, además contiene péptidos, carbohidratos y macroelementos (N, P, K), que favorecen el desarrollo rápido de tejidos y órganos en las plantas, forman parte de proteínas y enzimas (^{Viñals-Verde et al., 2011}). Otro aminoácido que contiene este bioestimulante es el L-triptófano, que es importante como precursor de la síntesis de las auxinas, fitohormonas que realizan funciones primordiales en el crecimiento y división celular; además contiene ácido glutámico que actúa como metabolito fundamental en la formación de tejidos vegetales (^{Castillo et al., 2011}).

Variables morfométricas

Para longitud de radícula (LR) se observaron diferencias signif icativas entre variedades, NaCl, dosis de FitoMas-E^®, las interacciones variedades × NaCl, variedades × dosis de FitoMas-E^® y variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^®. El análisis de la interacción variedades × NaCl mostró a Napoletano y Nufar con LR mayor en 0 mM de NaCl y conforme la concentración de NaCl fue mayor, la LR disminuyó signif icativamente para las tres variedades, siendo más acentuado en las variedades Emily y Nufar en 150 mM de NaCl (Cuadro 1). Para la interacción variedades × dosis de FitoMas-E^®, el análisis mostró que las tres variedades incrementaron la LR cuando se aplicó FitoMas-E^®, siendo Napoletano con dosis de 1 mL L^‑1 y Nufar con dosis de 0.5 mL L^-1 las que alcanzaron mayor LR (Cuadro 3).

La interacción variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^®, mostró que Napoletano en 0 mM, con dosis de FitoMas-E^® de 1 mL L^-1 y Nufar en 0 mM de NaCl con las tres dosis de FitoMas-E^® lograron LR mayores. Los resultados mostraron que las tres variedades en estudio incrementaron la LR en aquellas plántulas cuyas semillas se trataron con FitoMas-E^® aún y cuando estas se encontraban sometidas al estrés por NaCl, siendo 0.5 mL L^-1 la dosis más efectiva (Cuadro 4).

Cuadro 4 Efecto de la interacción variedades × niveles salinidad × dosis de FitoMas-E® en variables morfométricas de plántulas de tres variedades de albahaca sometidas a estrés por NaCl y un bioestimulante. 

LR = largo de radícula; AP = altura de la plántula; BFPA = biomasa fresca parte aérea; BFR = biomasa fresca de radícula; BSR = biomasa seca de radícula. ^† Valores promedio con literales distintas en una misma columna difieren estadísticamente (Tukey HSD, P ≤ 0.05).

Para altura de la plántula (AP) se encontraron diferencias significativas entre variedades, NaCl, dosis de FitoMas-E^®, las interacciones variedades × NaCl y variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^®, mientras que la interacción variedades × dosis de FitoMas-E^® no mostró diferencia significativa para esta variable. Al analizar las interacciones se encontró que para variedades × NaCl, la variedad Napoletano en 0 mM mostró altura mayor y conforme las concentraciones salinas fueron de moderadas a severas, disminuyó la AP en las tres variedades, siendo Emily en 150 mM la más afectada (Cuadro 1). En la triple interacción variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^® se observó AP mayor en Napoletano con 0 mM y 1 mL L^-1 de FitoMas-E^®. Para las tres variedades la AP fue mayor en las plántulas tratadas con el bioestimulante, aún y cuando estas se encontraban en estrés salino de moderado a severo (Cuadro 4).

La biomasa fresca de radícula (BFR) mostró diferencias significativas entre variedades, NaCl, dosis de FitoMas-E^®, las interacciones variedades × dosis de FitoMas-E^® y variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^®. Para la interacción variedades × NaCl no se encontró diferencia significativa. En el análisis de las interacciones, los resultados revelaron que para variedades × dosis de FitoMas-E^®, la BFR mayor correspondió a las plántulas procedentes de semillas tratadas con la dosis de 0.5 mL L^-1 de FitoMas-E^® en las tres variedades (Cuadro 4), por lo que se considera una dosis estimulante para el desarrollo de esta variable. En la triple interacción, los resultados revelaron que las tres variedades incrementaron la BFR en las plántulas procedentes de semillas tratadas con FitoMas-E^®, aún con los efectos del estrés por NaCl de moderado a severo (Cuadro 4).

En la biomasa fresca de la parte aérea (BFPA) los resultados revelaron diferencias significativas entre variedades, NaCl, dosis de FitoMas-E^®, las interacciones variedades × NaCl, variedades × dosis de FitoMas-E^® y variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^®. El análisis de la interacción variedades × NaCl mostró mayor BFPA en Napoletano en 0 mM y conforme la concentración de NaCl incrementó, se apreció una disminución significativa de la BFPA siendo la variedad Nufar en 150 mM la más afectada (Cuadro 1). En la triple interacción, las plántulas de Napoletano en 0 mM con 0.5 mL L^-1 de FitoMas-E^® presentaron valor superior de BFPA, mientras que el análisis de la interacción variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^® mostró que las tres variedades incrementaron la BFPA aún en condiciones de estrés por NaCl (Cuadro 4).

La biomasa seca de radícula (BSR) mostró diferencias significativas entre variedades, NaCl, dosis de FitoMas-E^®, las interacciones variedades × NaCl, variedades × dosis de FitoMas-E^® y variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^®. El análisis de la interacción variedades × NaCl, mostró que Napoletano en 0 y 50 mM presentó una BSR mayor; sin embargo, al incrementar la concentración de NaCl, la BSR disminuyó significativamente hasta llegar a su valor menor en la variedad Emily en 150 mM de NaCl (Cuadro 1); para la interacción variedades × dosis de FitoMas-E^®, los resultados mostraron un incremento significativo de esta variable en las plántulas procedentes de semillas a las que se les aplicó bioestimulante y con la dosis de 0.5 mL L^-1 (Cuadro 3). Al analizar la interacción variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^® se observó que las plántulas cuya semilla se trató con FitoMas-E^®, mostraron un incremento en la BSR aún con el estrés por NaCl y fue Napoletano con la dosis de 0.5 mL L^-1 de FitoMas-E^® en 0 y 50 mM de NaCl la variedad que logró una BSR mayor (Cuadro 4).

Para la biomasa seca de la parte aérea (BSPA) se encontraron diferencias signif icativas entre variedades y NaCl. Para dosis de FitoMas-E^® no se encontró diferencias significativas. Las interacciones variedades × NaCl, variedades × dosis de FitoMas-E^® y variedades × NaCl × dosis de FitoMas-E^®, no mostraron diferencias significativas.

Efecto de la interacción del estrés salino y el FitoMas-E® en las variables morfométricas

El análisis de la interacción variedades × NaCl mostró que la longitud de radícula disminuyó significativamente en las tres variedades conforme se incrementó la concentración de NaCl (Cuadro 1). La reducción en el crecimiento de la raíz en estrés por NaCl, se debe a varios factores, entre ellos a un potencial de agua reducido del medio externo, a la interferencia de los iones salinos con la nutrición de las plantas o a la toxicidad de iones acumulados que conducen a la muerte celular en algunos casos (^{Lamz-Piedra y González-Cepero, 2015}). Los resultados en este estudio coinciden con lo planteado por ^{Batista-Sánchez et al. (2015)} quienes afirman que a nivel de raíces, las sales alteran la absorción de agua por lo que afectan el crecimiento de estos órganos, disminuye considerablemente la cantidad de raicillas adsorbentes, afectando la absorción de agua y nutrientes. La reducción en el desarrollo de la raíz, puede ser por un efecto osmótico, por el NaCl o porque las plántulas no tienen absorción de nutrientes balanceada (^{Bor et al., 2003}).

El incremento de la mayoría de las variables morfométricas evaluadas procedentes de semillas tratadas con FitoMas-E^®, se debe a que este bioestimulante contiene quelatos de aminoácidos y de carbohidratos que son de absorción rápida, tienen una movilidad mayor dentro de la planta una vez que se absorben y poseen propiedades estimulantes del crecimiento radicular (^{Ruisánchez et al., 2013}; ^{Batista-Sánchez et al., 2015}). En este estudio, fue evidente la influencia que el FitoMas-E^® ejerció en la longitud de la radícula, lo que confirma la capacidad de estimular los procesos vinculados al crecimiento y desarrollo de las plantas, tal como lo señalaron ^{Castillo et al. (2011)} quienes atribuyen este efecto a los mecanismos de acción bioestimulante, con aminoácidos de acción auxínica, hormonas que intervienen en el crecimiento de las diferentes partes de las plantas. La altura de las plántulas también se incrementó en las tres variedades respecto al control, en aquellas plántulas procedentes de semillas que se trataron con el bioestimulante. Resultados similares obtuvo ^{Viñals-Verde et al. (2011)} con el uso de FitoMas-E^® en plantas de tomate, en las cuales se incrementó la altura de la planta, diámetro del tallo, diámetro del fruto, número de frutos y peso del fruto. Acorde con ^{Castillo et al. (2011)} el bioestimulante contiene serina, aminoácido que interviene en los mecanismos de resistencia de las plantas a condiciones de estrés, ayudando a mantenerla en condiciones vigorosas. La aplicación exógena de FitoMas-E^®, estimula la elongación y la división celular en segmentos de tallos favoreciendo la altura de las plantas, por lo que promueve el crecimiento en general (^{Curbelo et al., 2007}). Se ha demostrado que las afectaciones en el crecimiento y la acumulación de biomasa en las plantas sometidas a condiciones salinas, se mantienen a través de todo su ciclo vegetativo, incluyendo las primeras etapas como la germinación y la emergencia (^{Murillo-Amador et al., 2001}), por lo que es importante realizar estudios de tolerancia a estrés por NaCl en etapas posteriores del crecimiento en Ocimum basilicum. La acumulación de iones salinos en el embrión de la semilla en germinación y luego en la plántula, es una de las causas fundamentales de las afectaciones del crecimiento y acumulación de biomasa, por lo que requiere atención especial durante el período inicial de crecimiento de las plántulas y se caracteriza por las variaciones que ocurren en los procesos del metabolismo de las plantas (^{Khaliq et al., 2014}).

La acumulación de biomasa de los órganos vegetativos, al igual que el crecimiento de las plántulas, dependen de la asimilación de nutrientes, así como de la intensidad de los procesos de división y elongación celular, por lo que en condiciones de estrés salino, el crecimiento de las estructuras vegetativas disminuye significativamente y con mayor intensidad, a medida que aumenta la concentración de sales en el sustrato (^{Kamel-Hessini et al., 2015}). En este estudio fue evidente que las plántulas de semillas tratadas con el bioestimulante FitoMas-E^®, incrementaron significativamente su biomasa, aún en condiciones de estrés por NaCl. Estos resultados se deben a que la planta recibe aminoácidos biológicamente activos de rápida absorción y traslación, lo cual reduce el gasto de energía metabólica para la síntesis de proteínas, favoreciendo un incremento en la síntesis de solutos orgánicos, lo cual beneficia su crecimiento, desarrollo y acumulación de biomasa. También se relaciona con la presencia de ácido glutámico en el FitoMas-E^®, el cual actúa como agente osmótico del citoplasma y en el reajuste del potencial hídrico intracelular. Resultados similares obtuvo ^{Batista-Sánchez et al. (2015)} en la etapa de emergencia de las plantas de albahaca, variedades Emily, Nufar y Napoletano aplicando diferentes dosis de este bioestimulante.

Al parecer FitoMas-E^® promueve la defensa antiestrés, involucra la síntesis de sustancias de estructuras químicas que las plantas elaboran como respuesta a situaciones estresantes, resultado de alteraciones bióticas y abióticas, que de acuerdo con ^{Harborne (1993)}, como respuesta a la salinidad, las plantas o partes de éstas, acumulan polioles, compuestos cuaternarios de amonio y otros compuestos osmóticos en respuesta a este estrés abiótico. Para lograr esto, las plantas movilizan sustancias las cuales desvían de su metabolismo principal con un costo energético elevado. El FitoMas-E^® está compuesto de sustancias complejas como aminoácidos, péptidos, bases nitrogenadas y oligosacáridos, las cuales son estructuras básicas que funcionan como unidades para construir desde el RNA celular, sustancias más complejas tales como vitaminas, enzimas y otras estructuras químicas esenciales en la adaptación y la defensa antiestrés que le permiten a las plantas sometidas a niveles de estrés lograr atenuar los efectos negativos del estrés en el crecimiento y desarrollo (^{Álvarez-Rodríguez et al., 2015}).