Introducción
Los hongos son organismos que se caracterizan por ser cosmopolitas, con una gran capacidad de adaptación a diversas condiciones ambientales, tienen la capacidad de crecer a diferentes temperaturas (6‑55 °C) y requieren baja humedad para desarrollarse (Piontelli, 2014). Estos microorganismos tienen afinidad por diferentes sustratos, en particular por los vegetales y sus detritus presentes en el suelo (Abarca, 2000). Los vegetales, así como el suelo pueden ser fuentes infecciosas potenciales para los individuos que, por razones laborales o accidentales, están expuestos a sufrir heridas susceptibles de ser contaminadas con cualquiera de los hongos presentes en el ambiente (López et al., 2012).
La distribución geográfica de las infecciones subcutáneas en seres humanos, en particular las infecciones causadas por hongos llamadas micosis, en el mundo es muy amplia, predominando en los países con clima tropical y subtropical (Rippon, 1988). Las micosis subcutáneas que se presentan con mayor incidencia en México son la esporotricosis, la cromoblastomicosis y el eumicetoma (Padilla-Desgarennes, 1997; Bonifaz, 2001; López-Martínez y Méndez-Tovar, 2007; Vásquez del Mercado et al., 2012; Vargas-Arzola et al., 2012). Otras infecciones micóticas poco frecuentes son la basidiobolomicosis y la conidiobolomicosis (De León-Bojorge et al., 1988; Mayorga-Rodríguez et al., 1996). Las enfermedades mencionadas se adquieren a través de heridas que se contaminan con los agentes causales, afectan la piel y el tejido subcutáneo, son de evolución crónica y generalmente no ponen en riesgo la vida del hospedero pero sí causan discapacidad física progresiva. Estas infecciones se localizan predominantemente en miembros superiores e inferiores, que son partes corporales expuestas tanto a los traumatismos con pérdida de la continuidad de la piel como a la contaminación de las heridas. De no recibir atención médica, en las heridas se puede establecer un agente fúngico o bacteriano y desarrollarse el proceso infeccioso. En el caso de la esporotricosis, se ha reportado también la inhalación de conidios y micelio como otro mecanismo de infección, aunque son pocos los casos reportados con esta modalidad clínica (Aung et al., 2013). La cromoblastomicosis y el eumicetoma generalmente se presentan en hombres, a diferencia de la esporotricosis que tiene una incidencia similar entre hombres y mujeres (Vásquez del Mercado et al., 2012). Estas micosis han sido consideradas ocupacionales por su mayor frecuencia en campesinos, agricultores, floristas, empacadores de loza y horticultores, quienes frecuentemente están expuestos a heridas y están en contacto con las posibles fuentes de infección, rurales o semiurbanas (Rippon, 1988; Choure et al., 2005).
El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia y el número de colonias de agentes potenciales causantes de cromoblastomicosis, esporotricosis y eumicetoma en suelo y plantas, de diferentes municipios del estado de Puebla. Se incluyeron también los agentes causantes de actinomicetoma, patología clínicamente similar al eumicetoma, pero mucho más frecuente en nuestro país. Esta información contribuirá a establecer una correlación entre la microbiota (fúngica y actinomicética) ambiental y la frecuencia reportada de estas patologías en México.
Materiales y Métodos
Este estudio se realizó en 11 municipios que están distribuidos en los cuatro puntos cardinales del estado de Puebla: Atlixco, Chignahuapan, Cholula, Ciudad Serdán, Izúcar de Matamoros, Tecali de Herrera, Tecamachalco, Tehuacán, Tepexi de Rodríguez, Puebla y Zacatlán (Figura 1). Estos municipios fueron seleccionados para contar con zonas representativas de todo el estado y porque en trabajos previos se ha encontrado una alta incidencia de infecciones subcutáneas (Munguía- Pérez et al., 2007). De cada lugar de estudio se obtuvieron 50 muestras, con una distancia entre una y otra de por lo menos 100 m. Cada muestra consistió de 10 g de planta (hojas) y 10 g de suelo (tomados con ayuda de tijeras y cucharillas estériles respectivamente). Las hojas de planta fueron puestas a deshidratar a temperatura ambiente (temperatura diurna: 20 a 29 °C; temperatura nocturna: 12 a 18 °C) durante una semana y después maceradas en un mortero estéril, para obtener fragmentos de aproximadamente 5 mm para colocarlos en respectivos tubos de ensayo; previamente homogenizada la muestra original, se tomó 1 g de material vegetal o de suelo, el cual fue mezclado con 9 mL de agua destilada estéril, para posteriormente hacer diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000. De cada una de las diluciones, 500 mL fueron distribuidos en placas de agar dextrosa Sabouraud (ADS, Bioxon) y Agar Mycosel (BBL; cicloheximida 0.4 g L-1, cloranfenicol 0.05 g L-1). Las muestras fueron incubadas a 28 °C por un periodo máximo de treinta días. Cada tres días las placas fueron revisadas para detectar el crecimiento de hongos y actinomicetos causantes de infecciones subcutáneas. Los diferentes hongos reportados fueron identificados considerando sus características morfológicas, tanto macro- (de las colonias) como microscópicas, utilizando un microscopio óptico (Labomed), considerando el tipo de conidiogénesis de cada aislado (de Hoog et al., 2000). La identificación de los agentes de cromoblastomicosis se determinó inicialmente por la aparición de colonias pigmentadas (de verde oscuro a negro); después se realizó un examen directo, y en los casos sugestivos de los géneros buscados, se corroboró su morfología y conidiogénesis a través de microcultivos. El agente de esporotricosis, se identificó por la presencia de colonias blancas o pigmentadas, con aspecto membranoso, húmedo, o velloso en algunos casos; se realizó un examen microscópico, además de microcultivo. En los casos en que el hongo era morfológicamente compatible con Sporothrix, se indujo la reversión a levadura en agar infusión cerebro corazón (BHI, Bioxon), incubado a 37 °C por cinco días; la reversión a levadura fue puesta en evidencia por examen microscópico. Respecto a la presencia de agentes de eumicetoma, el estudio fue enfocado a los agentes más frecuentes: Madurella spp., Medicopsis (sin. Pyrenochaeta) sp. y Scedosporium sp., por lo que se consideraron las siguientes características de las colonias para su diferenciación: aspecto velloso o algodonoso, de color blanco, gris, marrón claro u oscuro; para determinar el género y la especie de M. mycetomatis, se hizo un sub-cultivo en agar harina de maíz (Bioxon) para inducir la formación de fiálides. Para la identificación de bacterias causantes de actinomicetoma, se consideró inicialmente el crecimiento lento de las colonias, de aspecto céreo, cuyo color fue variable (blanco, amarillo, naranja, rojo); de las colonias sugestivas, se realizó una tinción de Kinyoun y en caso de tratarse de bacterias filamentosas, se procedió a sub-cultivarlas en agar dextrosa Sabouraud durante cinco a siete días a 28 °C, para después realizar diferentes pruebas bioquímicas (producción de caseinasa, ureasa y almidón, asimilación de xantina, hipoxantina y gelatina) en placas del agar respectivo (agar caseína, agar xantina, agar hipoxantina, agar gelatina) para detectar los patrones de hidrólisis y asimilación de los sustratos de acuerdo a Brown-Elliott et al. (2006). Finalmente se identificaron las plantas en cuyo suelo se encontraron los hongos y bacterias de interés.
Resultados y Discusión
Se procesó un total de 1100 muestras, de las cuales se obtuvieron 441 aislados: 281 de hongos y 160 de actinomicetos (bacterias). En los Cuadros 1 y 2 se muestra la distribución por municipio de los aislados fúngicos obtenidos de las dos fuentes (suelo y plantas, respectivamente). De las 11 comunidades estudiadas se recuperaron los agentes etiológicos más frecuentemente reportados como causantes de esporotricosis (Sporothrix sp.), micetoma (Madurella spp. y diversos actinomicetos) y cromoblastomicosis (Fonsecaea pedrosoi, Phialophora verrucosa y Cladophialophora carrionii). El número de colonias obtenido a partir de las diferentes diluciones del inóculo no mostró una diferencia definida. La mayoría de los agentes de cromoblastomicosis, eumicetoma y actinomicetoma se obtuvieron de ADS sin antibióticos; S. schenckii fue recuperado con mayor facilidad y frecuencia de ADS con antibióticos.
Agentes de: † Cromoblastomicosis; ‡ Esporotricosis; § Eumicetoma. Madurella sp.: aislados que formaron colonias y micelio similar a M. mycetomatis, pero no formaron esclerotes ni fiálides. ¶ Los números indican número de colonias obtenidas. Los números entre paréntesis indican porcentaje.
Agente de: † Cromoblastomicosis; ‡ Esporotricosis; § Eumicetoma. Madurella sp.: aislados que formaron colonias y micelio similares a M. mycetomatis, pero no formaron esclerotes ni fiálides. ¶ Los números indican número de colonias obtenidas. Los números entre paréntesis indican porcentaje.
De los 281 hongos aislados, 133 (47.3%) fueron recuperados de suelo, y 148 (52.7%) de plantas. En ambas fuentes, el número de colonias más alto correspondió a los hongos Fonsecaea pedrosoi y Cladophialophora carrionii como agentes de cromoblastomicosis, seguidos de Sporothrix schenckii, principal agente causal de la esporotricosis en México; los agentes causales de eumicetoma fueron los hongos menos abundantes. Solamente se obtuvo un aislado de suelo y uno de planta de Rhinocladiella aquaspersa, agente de cromoblastomicosis.
Se muestran imágenes representativas de los aislados fúngicos obtenidos en este trabajo en la Figura 2. Las colonias (Figura 2A-C) y los microcultivos (Figura 2D-F) están crecidos en ADS sin antibiótico; el microcultivo de la Figura 2G, en agar papa dextrosa; fiálides de M. mycetomatis (2H) inducidas en agar harina de maíz.
Geográficamente, los aislados fúngicos fueron más numerosos en el suelo de Cholula e Izúcar de Matamoros, y en las plantas Agave sp. (maguey), Yucca filifera (yuca), Jacaranda mimosaefalia (jacaranda), Eucalyptus camaldulensis (eucalipto), Oreodoxa regia (palma), Cupressus lindleyi (pino), Mamilaria elegans (cactácea), Opuntia sp. (nopal) y Schinus molle (pirúl), de Tecali de Herrera y Zacatlán. De los municipios de Chignahuapan y Ciudad Serdán se recuperó el menor número de aislados fúngicos de suelo y de plantas respectivamente. En los diferentes municipios de donde se obtuvieron las muestras, existen diferentes condiciones climáticas y diferentes tipos de suelo. Es probable que estas diferencias determinen el tipo y número de poblaciones fúngicas y actinomicetos, como se observó en este estudio.
Los 160 agentes de actinomicetoma aislados, de los cuales 96 fueron recuperados de suelo y 64 de plantas se muestran en los Cuadros 3 y 4. De los 96 aislados de suelo (Cuadro 3), 78 (81.2%) correspondieron al género Nocardia, predominando N. brasiliensis (44.8% del total de aislados). Actinomadura madurae representó el 10.4% de los aislados recuperados de suelo.
¶ Los números indican número de colonias obtenidas. Los números entre paréntesis indican porcentaje.
De los actinomicetos aislados de plantas (Cuadro 4), la tendencia de la presencia de Nocardia fue similar al de suelo (84.4% en total); sin embargo, el segundo lugar fue ocupado por A. pelletieri (9.3%), seguido de A. madurae y S. somaliensis (3.1% para cada uno).
El mayor número de aislados bacterianos fue obtenido del suelo de Chignahuapan, Tecamachalco y Tehuacán, y de las plantas de Izúcar de Matamoros, Tecamachalco y Tehuacán.
Las plantas relacionadas con los aislamientos de agentes de cromoblastomicosis fueron: Agavesp. (maguey), Yucca filifera (yuca), Jacaranda mimosaefalia (jacaranda), Eucalyptus camaldulensis (eucalipto), Dahlia coccinea (dalia silvestre), Prosopissp. (rompebotitas), Zea mays (maíz), Rosa centifolia (rosa), Castilleja tenuiflora (mirto), Oreodoxa regia (palma), Cupressus lindleyi (pino), Mamilaria elegans (cactácea), Opuntia sp. (nopal).
Las plantas relacionadas con los aislamientos de agentes de micetoma principalmente fueron: Jacaranda mimosaefalia, Prosopis sp., Pithecellobiumsp. (guamuchil), Saccharum off icinarum (caña de azúcar), Festiuca tolusensis (pastizal), Baccharis conferta (escobilla), Simsia amplexicaulis (acahual suave), Zea mays, Agave sp., Rosa centifolia, Schinus molle (pirúl) Opuntia sp.
Las plantas relacionadas con los aislamientos de agentes de esporotricosis fueron: Eucalyptus camaldulensis, Rosa centifolia, Zea mays, Curcurbitasp., Stenocereus marginatus (órgano), Cupressus lindleyi, Jacaranda mimosaefalia, Oreodoxa regia (palma).
Los tipos de suelo relacionados con los agentes de micetoma y esporotricosis fueron regosol y vertisol y para los agentes de cromoblastomicosis fueron regosol y feozem. El regosol es un tipo de suelo poco desarrollado y se forma a partir de material no consolidado y en lugares con pendientes acusadas; su capacidad agrícola es baja. El vertisol es un suelo mineral condicionado por el material sobre el que se ha formado; es de color oscuro y contiene abundante arcilla, material que al secarse suele formar grietas verticales, anchas y profundas. El feozem es un tipo de suelo rojizo de las regiones conocidas como praderas o pastizales, con alta saturación de bases y rico en nutrientes; los feozem no perturbados son muy fértiles. Los suelos de los cuales se obtuvieron los aislados de este estudio tuvieron un pH que osciló entre 6.5 y 7.3.
México, por sus condiciones climáticas heterogéneas, es ideal para el desarrollo de una gran diversidad de hongos y bacterias en fuentes naturales. Por su capacidad de crecimiento óptimo a diferentes temperaturas, los hongos se han clasificado en psicrófilos (0-20 °C), mesófilos (0-50 °C) y termófilos (20-50 °C, pero están mejor adaptados a aguas termales y zonas desérticas (Méndez-Tovar, 2012). De acuerdo a datos del INEGI 2006, en el estado de Puebla predominan los climas templados con diversos grados de humedad, con temperaturas que oscilan entre 0 y 29 °C, y una pluviosidad entre 400 y 4000 mm. Algunos ejemplos de la diversidad climática en los municipios incluidos en este estudio son: templado húmedo: Zacatlán; cálido sub-húmedo: Izúcar de Matamoros; semi-cálido sub-húmedo: Tepexi de Todríguez, Cholula, Atlizco, Tecali de Herrera; Templado: Puebla; templado sub-húmedo: Tecamachalco; seco, muy cálido y caliente: Tehuacán. Estas condiciones son altamente favorables para el crecimiento de hongos y bacterias. La abundancia de estos microorganismos en el suelo y plantas con que los humanos interactúan durante sus actividades laborales, podrían explicar parcialmente la frecuencia con que los individuos son infectados por ellos. Así, en este estudio entre los agentes causales de cromoblastomicosis se aisló a F. pedrosoi; como único agente de esporotricosis se aisló a S. schenckii (aunque existen otras especies, en México éste es el principal agente identificado (Madrid et al., 2009); como principal agente de eumicetoma se encontró a Madurella spp.; y como principal agente de actinomicetoma se aisló a N. brasiliensis. La literatura sustenta a estos agentes como las principales causas de la infección respectiva y demostrada por su aislamiento e identificación a partir de los tejidos infectados. En algunos estudios documentan el antecedente de haber sufrido una herida y la aparición de lesiones compatibles con una micosis subcutánea (Dixon et al., 1991; Aguilar et al., 2011).
En un reporte del Centro Dermatológico “Ladislao de la Pascua”, se informa que las micosis subcutáneas atendidas con mayor frecuencia y diagnosticadas en el Laboratorio de Micología fueron la esporotricosis y la cromoblastomicosis (Padilla-Desgarennes et al., 1997). A pesar de que este estudio no es reciente, es representativo del número de casos que actualmente prevalece. Estudios complementarios a éste han sido publicados en años más recientes (Bonifaz et al., 2001; López Martínez y Méndez-Tovar, 2007; Madrid et al., 2009; Vásquez del Mercado et al., 2012; Romero-Navarrete et al., 2014). En un estudio sobre micetomas en México se observó que, de todos los casos conocidos, el actinomicetoma se presenta con una frecuencia de 96.52% (65.58% son causados por N. brasiliensis) y el eumicetoma representa el 3.48% del total (López-Martínez et al., 2013).
El número total de aislados recuperados en este trabajo es equivalente a la frecuencia con que estos microorganismos han sido reportados como agentes causantes de infecciones subcutáneas en algunos centros micológicos mexicanos. En primer lugar se encuentran los agentes de cromoblastomicosis seguidos de los agentes de actinomicetoma, esporotricosis y eumicetoma. El agente más frecuente de cromoblastomicosis, tanto aislado de la naturaleza en el presente estudio, como reportado a partir de casos clínicos, es F. pedrosoi (Bonifaz et al., 2001; Lugo-Ayala et al., 2002; Romero Navarrete et al., 2014). Rhinocladiella aquaspersa, otro agente de cromoblastomicosis, fue aislado solo en dos ocasiones (una de suelo y otra de planta) y pocas veces han sido reportados como agentes de infección en México (Badali et al., 2010; González et al., 2013). Esta misma tendencia se observó en el caso del actinomicetoma cuyo principal agente es N. brasiliensis, actinomiceto que también fue aislado predominantemente de fuentes naturales en este estudio. Es altamente probable que la incidencia de los casos de cromoblastomicosis y actinomicetoma esté dada por la virulencia de los agentes causales: hay abundancia de hongos pigmentados en la naturaleza, pero generalmente son de baja virulencia, y esto explicaría su menor frecuencia como causa de infección entre las tres micosis subcutáneas. De los actinomicetos, N. brasiliensis es el agente más frecuente de actinomicetoma y probablemente esto se deba a que este microorganismo es el más virulento de su grupo, pero también el más abundante en la naturaleza. Respecto a S. schenckii sensu stricto, se sabe que es el agente causal de la micosis subcutánea más frecuente en México, y este evento estaría determinado por la virulencia atribuida a este hongo (Barros et al., 2011). Puebla es un estado que ha atraído la atención de diferentes investigadores por las condiciones climáticas, laborales y culturales que favorecen la presencia de diferentes micosis, particularmente la esporotricosis (Espinosa-Texis et al., 2001; Macotela-Ruiz y Nochebuena-Ramos, 2006), cuyo agente causal ha sido demostrado en fuentes naturales (Munguía-Pérez, et al., 2007). La presencia de los actinomicetos en suelo mexicano ha sido previamente reportada en el estado de Morelos. En ese estudio se detectó a N. brasiliensis como actinomiceto predominante (20.8%), seguido de N. asteroides (8.3%), N. otitidis-caviarum (6.2%), A. madurae (2.8%), S. somaliensis (1.1%) y A. pelletieri (0.8%) (Castañón-Olivares et al., 1992). Estudios en otras partes del mundo han sido enfocados al aislamiento de actinomicetos de importancia médica (Reza, 2009; Kachuei, 2012).
Conclusiones
- Se logró determinar la frecuencia de hongos y actinomicetos causantes de infección subcutánea humana, a partir de suelo y plantas de 11 municipios del estado de Puebla. Los autores consideramos que la abundancia de un microorganismo en el suelo y plantas está parcialmente relacionada con la frecuencia de esta infección en los humanos. Si un agente infeccioso específico es más abundante que otros, es más probable que los pacientes en riesgo desarrollen una infección por ese agente. La abundancia de los principales agentes de micosis subcutáneas en fuentes naturales es equivalente a la frecuencia con que se aíslan esos microorganismos a partir de zonas corporales infectadas en el humano. Los hongos y actinomicetos aislados con mayor frecuencia en este estudio corresponden con los mismos microorganismos identificados a partir de las lesiones humanas de esportoricosis, cromoblastomicosis, actinomicetoma y eumicetoma en estadísticas nacionales.
- La importancia del presente trabajo radica en que probablemente es el primer reporte sobre el aislamiento integral de agentes de micosis subcutáneas a partir de fuentes naturales en México.