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Introducción
El suelo es uno de los ambientes más impactados por la contaminación ambiental como resultado de las diversas actividades humanas, ya que recibe sustancias químicas que afectan negativamente su funcionalidad.
La operación diaria de industrias o zonas de abastecimiento, el transporte de crudo y derivados, así como las fugas en tanques y tuberías, provocan frecuentemente derrames de combustibles, contaminando la zona superficial del suelo y aún zonas más profundas, con el riesgo consecuente que, a través de su migración, alcancen las capas freáticas de las cuales puede abastecerse la población. Los hidrocarburos presentes en el suelo, además de impedir o dificultar el intercambio gaseoso con la atmósfera, pueden provocar una serie de procesos físico-químicos que podrían ocasionar toxicidad y llevar a la muerte a muchos microorganismos del suelo, principales intermediarios del ciclaje de los materiales (Benavides et al., 2006), además de tener efectos negativos sobre la salud humana por su acción genotóxica (Miranda-Martínez et al., 2007), ya que, al incorporarse a las redes tróficas, alcanzan a todos los niveles de la misma (Galán et al., 2003).
Es importante encontrar soluciones adecuadas para la remoción o el control de estos contaminantes. En este sentido, se han desarrollado en las décadas pasadas tecnologías de remediación físicas, químicas y biológicas. Los métodos físicos y químicos suelen ser adecuados para descontaminar áreas relativamente pequeñas (Escalante Espinosa et al., 2005) pero son costosos, requieren un elevado consumo de energía e impactan negativamente sobre la integridad y funcionalidad del suelo (Garbisu et al., 2007). La biorremediación, implica el empleo de sistemas biológicos para llevar a cabo la detoxificación de contaminantes de origen industrial, utilizando los principios de la ecología microbiana (Miranda-Martínez et al., 2007), siendo estas tecnologías más sustentables.
Dentro de estos procesos de biorremediación se incluyen aquellos que combinan la acción de los microorganismos con las plantas. Este proceso, fitorremediación, incrementa la tasa general de remediación de hidrocarburos totales en distintos tipos de suelos (Huang et al., 2005). El objetivo último de un proceso fitorremediador es la recuperación de la salud del suelo, más allá de eliminar al contaminante o disminuir su concentración hasta alcanzar los límites de la normativa vigente para el caso.
Una serie de propiedades del suelo pueden ser consideradas como indicadoras de su calidad. Es así que tanto la respiración del suelo como el contenido de carbono en la biomasa microbiana son considerados buenos indicadores biológicos de calidad de suelo, dado que los métodos moleculares resultan complejos y caros.
El diésel-oil es una mezcla de hidrocarburos parafínicos, cicloparafínicos, aromáticos y olefínicos, en la que predominan los compuestos con un número de átomos de carbono de entre 10 y 22. En Argentina, el sector agropecuario consumió durante el 2011 1 575 810 000 L (Donato, 2011), lo cual justifica la preocupación por la contaminación del suelo que puede producirse como consecuencia de accidentes, derrames o fugas en tanques de almacenamiento.
El objetivo de este trabajo fue establecer el efecto del agregado de diésel-oil sobre determinados parámetros biológicos del suelo relativamente sencillos, como son respirometría, biomasa microbiana y cociente metabólico. Algunos autores sostienen que dichos paramétros podrían considerarse indicadores para monitorear la biorremediación de suelos (Dawson et al., 2007), ya sea en presencia o ausencia de plantas. Dado que el progreso de la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos habitualmente se monitorea a través de análisis químicos convencionales, lo cual es bastante caro (Maila y Cloete, 2005), nuestra hipótesis fue que el empleo de algunas herramientas biológicas resultaría adecuado para evaluar el proceso biorremediador.
Materiales y métodos
Se utilizó suelo procedente del Parque José Villarino de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Rosario, ubicada en Zavalla (provincia de Santa Fe, Argentina), recolectado del horizonte A (0-20 cm), originalmente libre de hidrocarburos y que fue artificialmente contaminado con una cantidad de diésel-oil equivalente al 1 y 2% (p/p). El suelo, un Argiudol vértico (Serie Roldán) tenía un contenido de arcilla de 24.1%, limo 71.4% y arena 4.4%, se caracterizó física y químicamente, presentando los siguientes valores: carbono orgánico 3.68% (técnica semi micro Walkley y Black); nitrógeno total, 0.28% (LPE 0112- Kjeldahl semiautomático); fósforo asimilable 44.1 ppm (LPE. 0048- espectrofotometría), Capacidad de Intercambio Catiónico (CIC) de 17.67 cmol kg-1 (LPE. 0036- titulometría) y pH de 6.65 (LPE. 0034- método potenciométrico 1:2.5) (Gomez et al., 2001).
Se utilizaron macetas plásticas donde se colocaron 650 g de suelo sin contaminar (tratamiento testigo) y contaminado con diésel-oil (1 y 2%; n = 10). En cada maceta se sembraron 40 semillas de Spartina argentinensis ó 25 semillas de Melilotus alba. En este caso, y por tratarse de una especie perteneciente a la familia de las Fabaceas que presenta simbiosis mutualistas con Rhizobiáceas fijadoras de nitrógeno y considerando que la presencia del simbionte favorecería el proceso de fitorremediación, se inocularon con un inoculante que contenía bacterias (Synorrhizobium melilotii). El suelo se mantuvo cercano a su capacidad de campo por subirrigación con agua potable, ya que las macetas estaban colocadass dentro de bandejas especiales que recogían el lixiviado, que era nuevamente empleado para regar. El experimento se realizó bajo condiciones de invernadero, con temperaturas entre 10 y 15°C y 11-12 h de luz natural. A los 30 y a los 75 días (finalización del experimento), se tomó suelo de 5 macetas para efectuar análisis microbiológicos.
Respirometría
Se midió la producción de CO2 utilizando frascos de 300 ml de cierre hermético, dentro de los cuales se colocaron 50 g de suelo, con una humedad equivalente al 60% de su capacidad de campo. El CO2 producido se atrapó en una solución de NaOH 0.5 N contenida en un recipiente ubicado en el interior de cada frasco. Los ensayos se realizaron por triplicado en todos los casos (tratamientos contaminados y suelo control sin contaminar, además de "blancos"). La producción de CO2 se evaluó por titulación con ClH 0.5 N, tras añadir 1 ml de solución 0.5 M de BaCl2, empleando fenolftaleína como indicador (Morelli et al., 2000; Silva et al., 2007).
Biomasa Microbiana (BM)
Se estimó como los microgramos de C de biomasa por gramo de peso seco (Anderson y Domsch, 1978) empleando un factor de conversión de 0.45, que caracteriza la abundancia de microorganismos en el suelo. Siguiendo a Jenkinson y Powlson (1976) se cuantificó el C-CO2 producido por muestras de 10 g de suelo fumigadas con cloroformo en un recipiente hermético durante 24 horas, posteriormente desfumigadas convenientemente, inoculadas con 0.2 g de suelo húmedo sin fumigar e incubadas a 28 ºC, durante10 días. Se trabajó con triplicados de cada una de las situaciones y blancos. El contenido de humedad se mantuvo equivalente al 60% de la capacidad de campo durante este período. Se determinó el "Carbono de biomasa microbiana PLUS" (De Polli et al., 2007).
Cociente Metabólico ( q CO 2 )
Se calculó como el cociente entre la respiración basal y el carbono de biomasa microbiana e indica el estado fisiológico (eficiencia energética y de utilización del carbono) de la comunidad microbiana de suelo (Anderson y Domsch, 1993). Este valor es un indicador de la eficiencia de los microorganismos del suelo para descomponer la materia orgánica y, en consecuencia, es un importante parámetro para el funcionamiento del ciclo de los nutrientes en el ecosistema (Anderson y Domsch, 1989, 1990, 1993).
Se realizó un análisis de la variancia para un diseño completamente aleatorizado en arreglo factorial. En los casos en que la interacción resultó significativa se compararon mediante Tukey todas las combinaciones de tratamiento por concentración. Por el contrario, cuando la interacción no resultó significativa se compararon separadamente, mediante Tukey las medias de los niveles de cada factor (Di Rienzo, 2011).
Resultados y discusión
Respirometría
El agregado de diésel-oil no incrementó significativamente la producción de CO2 en suelo sin plantas 30 días después de iniciado el experimento, mientras que sí lo hizo cuando tenía M. alba, sin diferencias significativas entre las diferentes concentraciones de diésel-oil en el suelo (1 y 2% p/p). En cambio, suelos con S. argentinensis con la concentración más baja de contaminante promovieron la respiración. A los 75 días, se produjo un incremento notable en el CO2 producido, siendo todos los valores de suelos contaminados (baja y alta concentración, con y sin plantas) significativamente superiores a los medidos en el momento inicial del experimento, pero con diferencias entre tratamientos. El suelo sin plantas respondió linealmente a la concentración, mientras que los suelos con M. alba y S. argentinensis no presentaron diferencias entre las que contenían 1 y 2% de diésel-oil. En suelo sin plantas, las diferencias entre CO2 liberado a los 75 y 30 días solo fueron significativos para el suelo con mayor concentración del contaminante, mientras que con M. alba no hubo diferencias bajo ninguna condición y con S. argentinensis, el suelo con mayor concentración de diésel-oil presentó mayor diferencia entre las diferentes fechas de muestreo (Figura 1). En el caso del suelo con mayor concentración del contaminante se evidenció un efecto perturbador de éste sobre los microorganismos (Pinto Mariano et al., 2007; de la Garza et al., 2008), para luego producirse una adaptación de la microflora autóctona al diésel-oil al utilizar este hidrocarburo como una fuente de carbono adicional. La presencia de M. alba tendería a producir una más temprana mineralización del diésel-oil en comparación a S. argentinensis, probablemente por aportar una mayor cantidad de nitrógeno al suelo, a través de sus exudados y descamación de células de raíz incorporados al suelo, de allí que no presentara diferencias significativas en la producción de CO2 entre el primer y segundo muestreo.
Figura 1 Actividad respiratoria (mg C- CO2 g-1, en base seca) de la microflora edáfica del suelo en macetas con M. alba, S. argentinensis o sin plantas (suelo) con los siguientes tratamientos: agregado de 0, 1 y 2% de diésel-oil.
Estos resultados coinciden con lo hallado por otros investigadores, como Xu y Johnson (1995), quienes también midieron incrementos en la actividad respiratoria en suelos contaminados con 5% de hidrocarburos y sometidos a diversas situaciones. Cofield et al. (2007) y Serrano Silva et al. (2009), encontraron un incremento de la respiración en suelos contaminados con hidrocarburos policíclicos. Pérez et al. (2008), halló igual tendencia en suelos contaminados con querosene y sin fertilizar y Margesin et al. (2000), en suelos contaminados con diésel, al igual que Tong et al. (2007), quienes demostraron que los suelos tratados con niveles subtóxicos de hidrocarburos provocaron siempre un incremento en la producción de CO2.
De acuerdo a Margesin y Schinner (1997), Kuperman y Carreiro (1997), Insam et al. (1996), Van der Waarde et al. (1995) y Song y Bartha (1990), la medición de la actividad microbiana parece ser un buen indicador del grado de polución en los suelos contaminados. En general el incremento en la respiración, cuando el suelo está contaminado con hidrocarburos, podría indicar una mineralización del contaminante (Margesin et al., 2003; Labud et al., 2007).
Biomasa Microbiana
A los 30 días de establecido el experimento, la biomasa microbiana del suelo sin plantas y del suelo con S. argentinensis tuvieron comportamiento similar, se incrementó en el suelo con mayor concentración de diésel-oil, mientras que en el suelo con M. alba, el agregado de contaminante produjo incremento en la biomasa, aunque no hubo diferencias significativas entre las concentraciones de contaminante empleadas. En el segundo muestreo, a los 75 días, se repitó el comportamiento. En suelo sin vegetación, las diferencias de biomasa microbiana entre 75 y 30 días fueron significativas solo con el agregado de 1% de diésel-oil, mientras que en S. argentinensis el agregado de diésel-oil determinó un incremento de la biomasa sin diferencias entre los suelos con dísimiles concentraciones y en M. alba, la concentración más alta de diésel-oil fue probablemente inhibitoria para los microorganismos (Figura 2). Estos resultados coinciden con Serrano Silva et al. (2009) quienes obtuvieron un incremento en la biomasa microbiana en un suelo con 1% de fuel oil y con Mühlbachová (2008), que trabajó en suelos contaminados con PAHs. Franco et al. (2004), hallaron una disminución del carbono de la biomasa microbiana luego del agregado de diésel, más marcado con las mayores dosis.
Figura 2 Biomasa microbiana de la microflora edáfica (C-BM: µg C de biomasa- CO2 g-1 de suelo, en base seca) en suelo testigo sin plantas (suelo) o con S. argentinensis; M. alba, con los siguientes tratamientos: agregado de 0, 1 y 2% de diésel-oil.
Muchos autores, evaluando estos parámetros en suelos contaminados, obtuvieron resultados diversos, Margesin et al. (2000) demostraron que la contaminación con 10 mg g-1 (0.1%) produjo un incremento significativo de todos los parámetros biológicos del suelo del suelo evaluados en presencia de PAH's: biomasa, respiración, actividad proteásica y recuento de heterótrofos. Sin embargo, en ciertos casos, la presencia de diésel-oil (2% o más) produjo una disminución en la biomasa microbiana, aunque la respiración resultó incrementada (Peña et al., 2007). Para estos autores, los microorganismos supervivientes en un suelo contaminado presentaron un incremento de la actividad metabólica, resultado del uso de microorganismos muertos como sustrato y de la falta de competencia. Los resultados obtenidos por Franco et al. (2004) son interesantes puesto que demostraron que la presencia de crudo producía incremento o disminución de la biomasa microbiana de acuerdo al tipo de suelo que hubiera sido contaminado: en el caso de los Molisoles, este autor encontró un incremento en la biomasa microbiana, posiblemente porque en este tipo de suelo los microorganismos están mejor protegidos frente a los efectos adversos de los derrames de hidrocarburo. Similares fueron los resultados de Labud et al. (2007), para quienes los más desfavorables se encontraron en suelos arcillosos.
La actividad respiratoria y la biomasa microbiana constituyen buenos métodos de ecología microbiana que deberían estar incluidos en el estudio de la calidad del suelo y también cuando se evalúa un proceso biorremediador (Mikkonen, 2012), aunque muchas veces aparecen inconsistencias entre los diversos ensayos (Paton et al., 2005).
Cociente Metabólico
El agregado de diésel-oil incrementó significativamente el cociente respiratorio en todos los casos (suelo con y sin vegetación) y las diferencias fueron proporcionales a la concentración del contaminante (Figura 3). A los 30 días de establecido el experimento no hubo diferencias entre suelo sin vegetación y suelo con M. alba, con cualquier concentración del contaminante. En suelo con S. argentinensis, solo el agregado de 1% de diésel provocó una diferencia inicial significativa en relación al suelo sin contaminar en comparación al suelo sin vegetar.
Figura 3 Cociente metabólico (mg C-CO2 μg-1 C-BM) de la microflora edáfica en suelo en macetas con M. alba, S. argentinensis o sin plantas (suelo) con los siguientes tratamientos: agregado de 0, 1 y 2% de diésel-oil.
La menor biomasa microbiana, asociada con una mayor emisión de dióxido de carbono implica menor conversión del residuo en biomasa y refleja una mayor demanda de energía por parte de los microorganismos del suelo cuando se incorporan contaminantes tóxicos. En consecuencia, el sistema indica cierto grado de estrés frente al contaminante y esto se ve reflejado en su coeficiente respiratorio. El cociente metabólico es un indicador de estrés ambiental, ya que se calcula a partir de parámetros sensibles a los cambios ambientales. Cuando la población microbiana sufre estrés metabólico, pone en marcha mecanismos de defensa, aumentando su respiración por unidad de biomasa. También podría indicar que la microbiota es poco activa por deficiencia en el aporte de sustrato (Anderson, 1994) o por la protección física de éste en los agregados (Van Veen, 1985; Gabos et al., 2011), lo que podría estar sucediendo en los casos de "suelo sin plantas" (en ambas concentraciones), donde no recibe el aporte de materia orgánica fácilmente degradable que proveen las plantas en el caso de los suelos vegetados. El cociente metabólico (qCO2) disminuye a medida que el sistema alcanza su estabilidad (Ebhin et al., 2006).
A medida que se incorpora el contaminante al suelo, los microorganismos demandan mayor energía, presentando una mayor actividad metabólica. En el 2do. muestreo, el cociente metabólico aumentó en todos los casos al incrementarse la concentración de diésel-oil en el suelo, tanto en suelo con como sin vegetación, aunque el efecto de la incorporación de diésel-oil sobre este parámetro es más notorio en suelo con plantas.
Conclusiones
La estabilidad general de los ecosistemas está relacionada con el estado general de salud de la comunidad microbiana del suelo. Una alteración en la actividad de los microorganismos del suelo, tal como se puso de manifiesto en este experimento a través de los cambios en la actividad respiratoria, la biomasa y, consecuentemente, el cociente metabólico, puede ser indicadora de una alteración en el ecosistema, lo cual sucede claramente cuando el suelo está contaminado con hidrocarburos. La incorporación de diésel-oil al suelo provee de sustrato carbonado que podría ser utilizado por los microorganismos cuando las concentraciones son menores, pero no cuando las concentraciones son altas, debido a la naturaleza altamente recalcitrante de este hidrocarburo. Sin embargo, el incremento en la actividad biológica de un suelo contaminado con compuestos orgánicos también predice la capacidad que tienen las poblaciones nativas para lograr que el suelo retorne a las condiciones previas.
Dado que la contaminación modificó las propiedades bioquímicas del suelo evaluadas (producción de CO2 y biomasa microbiana), algunas en relación directa con la dosis y otras no, una sola de estas mediciones, puede no reflejar la gran complejidad del sistema suelo-plantas-microorganismos. Los resultados del presente trabajo tienen el carácter de experimental ya que las pruebas ex-situ llevan intrínsecamente el problema del efecto magnificador (priming) de la manipulación impuesta para reducir la variabilidad (secado al aire, tamizado, mezclado) sobre los parámetros bioquímicos estudiados. No obstante y dado que un suelo contaminado es un ambiente muy heterogéneo por la desigual distribución del contaminante, la realización de baterías de ensayos de ecotoxicidad también debería ser una práctica necesariamente incorporada a los análisis químicos y microbiológicos básicos que un proceso fitorremediador requiere para confirmar su éxito.
A pesar de los aspectos a mejorar que aun presenta, el estudio de la respuesta de las comunidades microbianas a la contaminación del suelo ayuda a comprender cuál es la función que cumplen los microorganismos en relación con la factibilidad de la biorremediación y su efectividad, particularmente en situaciones en las que los recursos técnicos y financieros son limitados.
