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Introducción
La rizósfera constituye un microhábitat donde ocurren numerosas interacciones entre las plantas, que producen una gran cantidad de exudados, y los microorganismos del suelo que pueden ser atraídos o repelidos por la gran variedad de moléculas liberadas por las diversas especies vegetales (Bais et al., 2006). Se estima que del 2 al 5% de las rizobacterias pueden estimular el crecimiento vegetal por medio de diferentes mecanismos (Antoun y Kloepper, 2001). En algunos casos, las rizobacterias estimulan directamente el crecimiento mediante la producción de reguladores, como el ácido indol-3-acético (AIA), la isopentenyladenosina (IPA) y el ácido giberélico (Arshad y Frankenberger, 1991; Patten y Glick, 1996; Parvin et al., 2011); otro mecanismo que favorece el crecimiento vegetal es la solubilización de fosfatos orgánicos e inorgánicos en el suelo por medio de la producción de fosfatasas y de ácidos orgánicos, que aumentan la disponibilidad del fósforo para las plantas (Rodríguez y Fraga, 1999; Paredes-Mendoza y Espinosa-Victoria, 2010; Keneni et al., 2010; Wahyudi et al., 2011). En otros casos, el efecto favorable sobre el crecimiento de las plantas cultivadas es a través de mecanismos indirectos, como las actividades antagónicas de algunas bacterias contra microorganismos fitopatógenos por medio de la producción de antibióticos, enzimas y compuestos volátiles que permiten reducir la incidencia de enfermedades de las plantas cultivadas (Maurhofer et al., 1992; Berg et al., 2000; Mojica-Marín et al., 2009; Rudrappa et al., 2010). En algunos casos, las bacterias benéficas son capaces de estimular los mecanismos de defensa vegetal, como el reforzamiento de la pared celular y la producción de compuestos fenólicos y fitoalexinas. Algunas bacterias tienen la capacidad de inducir la resistencia sistémica (IRS) de las plantas contra bacterias, hongos y virus fitopatógenos. Este mecanismo se caracteriza en que la bacteria benéfica y el organismo patógeno permanecen separados físicamente, la rizobacteria no causa ningún síntoma visible en la planta, ni tampoco un efecto de toxicidad en el patógeno (Van-Loon et al., 1998). En condiciones de escasa disponibilidad de Fe+3, las bacterias benéficas que producen sideróforos compiten ventajosamente con los microorganismos fitopatógenos por este elemento, reduciendo de este modo la disponibilidad de Fe+3 para los microorganismos patógenos y en consecuencia, la incidencia de enfermedades (Leeman et al., 1996, Hernández-Rodríguez et al., 2006). Otro mecanismo por el cual las rizobacterias pueden estimular el crecimiento de las plantas es mediante la actividad de la enzima 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico desaminasa, que hidroliza el 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC), el inmediato precursor del etileno, que reduce la concentración de esta fitohormona y su efecto inhibitorio del crecimiento vegetal (Glick et al., 1998; Sgroy et al., 2009; Wang et al., 2012). Diversos estudios han demostrado que la inoculación de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal ha logrado mejorar el crecimiento de plántulas de tomate, trigo, soya, maíz y otras especies, mediante la combinación de los mecanismos mencionados anteriormente (Chabot et al., 1996; Gutiérrez-Mañero et al., 2001; Singh et al., 2010).
Los diferentes mecanismos que utilizan las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR por sus siglas en inglés) hacen de estos microorganismos una herramienta interesante que se puede integrar a los diferentes procesos de la producción agrícola, como es la nutrición vegetal y el control de plagas y enfermedades. De esta forma se permite un mejor aprovechamiento de la fertilidad natural de los suelos, reduciendo la aplicación de fertilizantes minerales y pesticidas que contaminan el ambiente. En cuanto al uso de biofertilizantes, destacan las bacterias del género Rhizobium, Bradyrhizobium y Mesorhizobium las cuales fijan nitrógeno en simbiosis con diversas especies de leguminosas. En diversos países, principalmente en los desarrollados, se aplican habitualmente biofertilizantes a los cultivos, preparados con microorganismos como Rhizobium, Azospirillum, Bacillus y micorrizas. En países de América Latina como México, Colombia, Brasil, Cuba, Venezuela, Nicaragua y Costa Rica existen muchas experiencias a pequeña y mediana escala, en las que se usan diferentes productos que tienen como base de su funcionamiento a microorganismos nativos. En México, algunas instituciones como el INIFAP y SAGARPA tienen diferentes ensayos con cepas potencialmente útiles como biofertilizantes, los cuales ya se utilizan en ciertas explotaciones tecnificadas como la soya en Argentina y Brasil (Grageda-Cabrera et al., 2012). Un aspecto importante a considerar es que a menudo, las cepas utilizadas como biofertilizantes son introducidas a regiones donde no pueden competir con la microbiota local o no se adaptan a las condiciones del clima y suelo, de ahí la importancia de los trabajos de investigación con microorganismos nativos, adaptados a las condiciones de la región donde se pretendan aplicar (Armenta-Bojórquez et al., 2010). Los objetivos del presente trabajo fueron: i) aislar y purificar bacterias de la rizósfera de plantas de chile habanero, maíz y calabaza cultivadas en la región de Yucatán, y ii) estudiar la capacidad de síntesis del ácido indol-3-acético (AIA) y solubilización de fosfato in vitro, con la finalidad de evaluar el efecto de la inoculación de las rizobacterias seleccionadas en el crecimiento de plántulas de tomate.
Materiales y métodos
Sitio de Estudio
El aislamiento y la caracterización de las capacidades de síntesis del ácido indolacético (AIA) y de la solubilización de fosfato de las rizobacterias se llevaron a cabo en el Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY). Las muestras que fueron colectadas para el aislamiento de las rizobacterias provienen de cultivos de chile habanero, maíz y calabaza de la Comisaría de Dzityá, Municipio de Mérida, Yucatán (21°03' 01" N y 89° 40' 43" O), con una altitud de 7 m. El suelo de origen de las rizobacterias se caracteriza por ser de una textura franco-limosa, pH alcalino (7.96), alto contenido de materia orgánica (19.05%), buena capacidad de intercambio catiónico (39.38 meq 100 g-1), alto contenido de nitrógeno total (l1.26%), fósforo Olsen (22.8 mg kg-1) y potasio intercambiable (656.75 mg kg-1). El agua de riego para el cultivo tuvo un pH alcalino (7.62), conductividad eléctrica de 1.310 mS cm-2, 199.03 mg L-1 de cloruros, 421.36 mg L-1 de sulfatos, 109.81 mg L-1 de calcio, 48.85 mg L-1 de magnesio y 370 mg L-1 de bicarbonatos.
Aislamiento y Purificación
Para el aislamiento de los microorganismos, se seleccionaron plantas sanas de maíz y calabaza de un mes a partir de la germinación (en etapa de crecimiento), y de chile habanero de tres meses después del trasplante (en etapa de producción); raíces de cada una de las tres especies de plantas fueron sacudidas con vigor dejando únicamente las partículas de suelo fuertemente adheridas, en seguida se tomaron fragmentos de raíces colocándolos en matraces con 100 mL de solución salina estéril al 0.85% (NaCl, J.T. Baker), mismos que fueron agitados a 200 rpm durante 1 h en un agitador orbital New Brunswick Scientific Co., G-25 8885. El aislamiento se realizó mediante diluciones decimales seriadas (de 10-1 a 10-6) inoculando a los medios de cultivo en cajas de Petri con 100 µL de las diluciones 10-5 y 10-6. En el aislamiento se emplearon diferentes medios de cultivo para favorecer la diversidad de los microrganismos. Los medios fueron suplementados con 100 µg mL-1 de cycloheximida (SIGMA, Aldrich) para inhibir el crecimiento de hongos. El medio caldo de soya tripticaseína (TSB por sus siglas en inglés, DIBICO) al 10% suplementado con 10 µg mL-1 de penicilina G (SIGMA, Aldrich) o 5 µg mL-1 de Polimixin B (SIGMA Aldrich) se empleó para favorecer el aislamiento de bacterias Gram negativas y Gram positivas, respectivamente. El agar de soya tripticaseína (TSA por sus siglas en inglés, DIBICO) al 10% se empleó para el aislamiento del género Bacillus (Bashan et al., 1993). El medio King B se empleó para estimular el aislamiento de Pseudomonas fluorescens y el medio extracto de levadura-tryptona (TY por sus siglas en inglés, SIGMA Aldrich) se empleó para favorecer el aislamiento de Rhizobium (Herrera-Cervera et al., 1999). Las rizobacterias obtenidas fueron denominadas de acuerdo al medio de cultivo donde fueron aisladas: TSB PEN (caldo de soya tripticaseína agar + penicilina G) TSB POL (caldo se soya tripticaseína agar + polimixina B), TSA (agar de soya tripticaseína), TY (extracto de levadura) y K (King B) y del cultivo: CH (chile habanero), M (Maíz) y C (calabaza). Las bacterias purificadas se conservaron a -20 °C en glicerol estéril al 30%. Se realizaron pruebas de tinción Gram a las nueve bacterias aisladas de chile habanero, que se utilizaron en el ensayo de producción de plántulas de tomate, resultando todas Gram negativas con morfología de cocos.
Síntesis de ácido Indolacético
Todas las rizobacterias aisladas fueron sembradas en el medio de cultivo Czapek suplementado con 2.5 mM de L-Triptófano (SIGMA, Aldrich), ajustando el pH a 7.3 ± 0.2 e incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante 72 h manteniéndolo en agitación a 200 rpm. Los cultivos bacterianos de 72 h fueron centrifugados a 10 000 rpm durante 5 min en una centrífuga Hermle Labortechnik, Z 233 MK. Un mL de sobrenadante se mezcló con un mL de reactivo Salkowski (12 g L-1 de FeCl2 en 7.9 M de H2SO4) y se dejó reposar durante 30 min a temperatura ambiente en la obscuridad (Glickmann y Dessaux, 1995). La presencia de AIA fue determinada por el desarrollo del color rosa y su cuantificación se realizó mediante un espectrofotómetro de luz ultravioleta Marca Thermo Spectronic modelo Génesis 10 a una longitud de onda de 530 nm con una curva estándar de AIA a concentraciones de 0, 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 y 40 µg mL-1.
Solubilización de Fosfatos
La prueba de solubilización de fosfato inorgánico fue realizada mediante el método de Mehta y Nautiyal (2001) en el medio líquido NBRIP-Bromofenol azul en el cual la decoloración del tinte azul indicó la solubilización de fosfato inorgánico. El fosfato tricálcico (SIGMA, Aldrich) se utilizó como fuente de fósforo.
Producción de Plántulas de Tomate Inoculadas con Rizobacterias
Este estudio se llevó a cabo en el Instituto Tecnológico de Tizimín, Yuc. Tomando en consideración la capacidad de solubilizar fosfatos y la producción de AIA, se seleccionaron nueve rizobacterias aisladas del cultivo de chile habanero, para estudiar su efecto en la producción de plántulas de otra especie solanácea, en este caso tomate (semilla híbrida Sun 7705, Nunhem) en invernadero. Las rizobacterias fueron cultivadas durante 24 h en el medio líquido TSB, centrifugadas a 10 000 rpm durante 5 min, el sobrenadante fue eliminado y el sedimento celular suspendido en solución de NaCl (0.85%) para ser utilizados como inoculante. Antes de la inoculación, las semillas de tomate fueron desinfectadas en su superficie con etanol al 70% durante 2 min y con cloro comercial (Cloralex(r)) al 50% durante 5 min, aplicando tres enjuagues con agua destilada estéril y se dejaron secar durante 1 h en la campana de flujo laminar. A continuación las semillas se inocularon remojándolas durante 1 h en la suspensión bacteriana. Se utilizaron tres semillas tratadas con cada bacteria, para estimar el número de células inoculadas en cada semilla mediante el método de diluciones decimales seriadas y siembra en cajas de Petri en medio TSA al 10%, resultando un promedio de 3 × 107 UFC por semilla. La siembra se realizó en contenedores de poliestireno de 200 cavidades llenas con sustrato húmedo a base de turba (Sunshine(r)). Después de la germinación, las plántulas fueron regadas de manera manual agregando al agua de riego 1 g L-1 del fertilizante 18-18-18. Las plántulas se colectaron 25 días después de la siembra, evaluando el peso seco de la parte aérea de las plántulas y su altura. El diseño experimental fue completamente al azar, sembrando dos contenedores de 200 cavidades por tratamiento, mismos que fueron rotados de posición dentro del invernadero cada tres días. Se aplicaron 10 tratamientos al cultivo experimental, de los cuales nueve correspondieron a las rizobacterias aisladas de plantas de chile habanero (Cuadro 1) y un testigo sin inocular. Los muestreos se hicieron tomando 20 plantas al azar por tratamiento (10 por cada contenedor). Los datos se sometieron a un análisis de varianza y la comparación de medias fue por el método de la diferencia mínima significativa (dms), utilizando el programa InfoStat versión 2010 (Di Renzo et al., 2010).
Resultados y discusión
Aislamiento y Purificación de las Rizobacterias
Se obtuvieron 83 aislados bacterianos, de la cuales 22 fueron obtenidos de las plantas de chile habanero, 31 de maíz y 30 de calabaza. Del total de aislados, 33 (40%) mostraron capacidad de solubilización de fosfatos (Cuadro 1), y 15 (18%) produjeron diferentes concentraciones de AIA (Figura 1). Trabajos previos han mostrado proporciones variables de bacterias que habitan en el suelo con capacidad de solubilizar fosfatos, por ejemplo, Kucey (1983) encontró un 0.5% de bacterias solubilizadoras de fosfato en relación al total aislado en diferentes suelos cultivados y no cultivados de Alberta, Canadá; Lara et al. (2011) mencionan que las bacterias que solubilizan fosfato representan el 10% de la población microbiana del suelo y De Freitas et al. (1997) obtuvieron un 32% de rizobacterias solubilizadoras de fosfatos de la rizósfera de trigo y chícharo. La mayor proporción de bacterias solubilizadoras de fosfato que se observaron en este trabajo, comparada con las obtenidas en los otros estudios mencionados, podría facilitar la obtención de biofertilizantes capaces de reducir la aplicación de fertilizantes fosfatados al utilizar microorganismos capaces de mejorar la disponibilidad de este nutriente en suelos calcáreos.
Producción de Ácido Indolacético (AIA)
La síntesis de AIA es uno de los mecanismos más importantes de las PGPR para favorecer el crecimiento vegetal. Diferentes estudios han mostrado que la producción de auxinas como el AIA es una propiedad bastante extendida entre las bacterias del suelo. Ahmad et al. (2008) observaron que el 100% de Pseudomonas que aislaron de suelo rizosférico y más del 80% de Azotobacter y de Mesorhizobium ciceri produjeron AIA; en otro estudio, Khalid et al. (2004) mostraron que el 73% de las bacterias aisladas de plantas de trigo sintetizaron AIA. En el presente trabajo se observó la síntesis de este regulador del crecimiento en 15 cepas (18% del total que fueron aisladas) (Figura 1), con un promedio de 2.9 µg mL-1. Las cepas obtenidas de chile habanero produjeron en promedio 1.5 µg mL-1 de AIA, en tanto que las cepas aisladas de maíz y calabaza promediaron 3.3 y 3.5 µg mL-1 de AIA, respectivamente. Múltiples estudios han demostrado la capacidad de diversas especies bacterianas de producir AIA en un amplio rango de concentraciones, sin embargo, no todas las bacterias que producen AIA estimulan el crecimiento de las plantas. Por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens produce hasta 78 µg mL-1 de AIA y otros metabolitos, provocando una alteración en la fisiología de la planta, dando lugar a la enfermedad conocida como "agalla de la corona" cuyos síntomas son tumores en raíces, tallos y ramas en diversas especies vegetales (Liu et al., 1982; Khakipour et al., 2008; Farzana et al., 2009; Zarrin et al., 2009; Wahyudi et al., 2011; Lara-Mantilla et al., 2011). El ácido indolacético estimula la elongación de raíces de haba (Vicia faba) a concentraciones menores de 17.5 µg mL-1, mientras que a concentraciones mayores a 87.5 inhibe drásticamente el crecimiento (El-Antably y Larsen, 1974). Por otro lado, Khalid et al. (2004) aislaron bacterias de la rizósfera de plantas de trigo que sintetizaron AIA a concentraciones de 1.1 a 12.1 µg mL-1 y estimularon el crecimiento de dicha especie vegetal. Igualmente García et al. (2010), aislaron cepas de Azospirilllum que produjeron de 18.02 a 38.02 µg mL-1 de AIA, las cuales estimularon el crecimiento de plantas de arroz. La concentración del AIA necesaria para estimular el crecimiento de las plantas depende de la especie de la misma. Así, mientras para una especie vegetal cierta concentración es adecuada para estimular su crecimiento, para otras, dicha concentración pudiera no tener influencia significativa. El AIA producido por las rizobacterias aisladas en este trabajo podría estimular el crecimiento de cultivos de importancia económica como el tomate y el chile habanero.
Solubilización de Fosfato
Treinta y tres de las rizobacterias aisladas tuvieron la capacidad de solubilizar fósforo inorgánico (fosfato tricálcico) in vitro (Cuadro 1). Diversos trabajos han mostrado que algunas rizobacterias solubilizadoras de fósforo pueden aumentar la disponibilidad de fósforo en el suelo y estimular el crecimiento y la producción de diferentes especies de plantas cultivadas. Sundara et al. (2002) reportaron que la bacteria Bacillus megatherium var. phosphaticum incrementó el fósforo disponible en el suelo dando como resultado un incremento en el rendimiento de jugo y azúcar de caña de azúcar. Otros estudios han reportado resultados similares en el mejoramiento del crecimiento de plantas por la aplicación de las rizobacterias que solubilizan fosfato, como en los casos de lechuga, maíz, canola y tomate (Laheurte y Berthelin, 1988; Chabot et al., 1996; De Freitas et al., 1997; El-Yazeid y Abou-Aly, 2011). Asimismo, se sabe que la estimulación del crecimiento por las PGPR se da principalmente por la combinación de los diversos mecanismos de la fisiología bacteriana. Wahyudi et al. (2011) observaron que cepas de Bacillus sp. aisladas de plantas de soya, que solubilizan fosfato y sintetizan AIA y sideróforos, estimularon el crecimiento de plantas de soya. Walpola y Yoon (2013) reportaron que las bacterias Pantoea agglomerans y Burkholderia anthina que solubilizan fosfato, sintetizan AIA, sideróforos, amonio, cianuro de hidrógeno y la enzima ACC desaminasa, incrementaron el crecimiento de plantas de tomate. En este trabajo, siete de las rizobacterias solubilizadoras de fosfato también sintetizaron AIA (Cuadro 1).
Efectos de las Rizobacterias Aisladas en el Crecimiento de Plántulas de Tomate
En la producción de plántulas en invernadero, los aislados KCH3 y TSACH2 incrementaron de manera significativa la producción de materia seca de la parte aérea en 42 y 32% respectivamente comparados con el testigo sin inoculación (Figura 2, Cuadro 2). Los otros siete aislados fueron estadísticamente similares al testigo. Se ha documentado que algunas rizobacterias que solubilizan fosfato pueden estimular el crecimiento vegetal. El-Yazeid y Abou-Aly (2011) mostraron que las rizobacterias Paenibacillus polymyxa y Bacillus megaterium var. phosphaticum, inoculadas a plantas de tomate, mejoraron significativamente diferentes parámetros de crecimiento de las plantas (grosor del tallo, número de ramas y área foliar), contenido de pigmentos fotosintéticos, contenido mineral (N, P, K y Mg), contenido total de azúcares, carbohidratos y proteína cruda en las hojas, así como el amarre de frutos, la producción temprana y total de frutos. Otros cultivos que han mejorado su crecimiento y producción al ser inoculados con rizobacterias solubilizadoras de fósforo incluyen la canola (De Freitas et al., 1997), la soya (Fernández et al., 2007) y el maíz (Hameeda et al., 2008).
Figura 2 Efecto de las cepas TSACH2 y KCH3 en el crecimiento de plántulas de tomate en comparación al testigo sin inocular.
Cuadro 2: Crecimiento de plántulas de tomate inoculadas con rizobacterias.
±: desviación estándar; CV: coeficiente de variación; letras distintas en la misma columna difieren estadísticamente (dms, P < 0.05).
En el presente trabajo, la solubilización de fosfatos por los aislados KCH3 y TSACH2, probablemente influyó en la promoción del crecimiento observado en las plántulas de tomate. Las aguas duras y alcalinas de Yucatán con alto contenido de calcio y bicarbonato (pH de 7.62, 109.81 mg L-1 de Ca y 370 mg L-1 de bicarbonatos en las aguas utilizadas en el cultivo experimental), favorecen la precipitación del fósforo aplicado en forma de complejos insolubles de fosfato de calcio (Treder, 2005; Imas, 1999), reduciendo de esta forma la disponibilidad del elemento para las plantas. El uso de rizobacterias solubilizadoras de fosfato, podría contribuir a mejorar la disponibilidad de este elemento para la nutrición de las plantas cultivadas en condiciones de fertirriego como en el presente caso. Asimismo, no se descarta el efecto de algún otro de los mecanismos que no han sido estudiados en las dos rizobacterias referidas, como la síntesis de otros reguladores del crecimiento vegetal y diversos compuestos como el ácido giberélico, las citoquininas y ácidos orgánicos que también estimulan el crecimiento vegetal (Arkhipova et al., 2005; Vikram et al., 2007).
Conclusiones
Se detectó la capacidad de síntesis de ácido indolacético en 15 (18%) rizobacterias del total de microorganismos aislados y 33 (40%) solubilizaron fósforo inorgánico in vitro. El ensayo de producción de plántulas de tomate en invernadero, mostró un incremento significativo en la biomasa de las plántulas inoculadas con los aislados KCH3 y TSACH2, los cuales podrían tener potencial para utilizarlos como biofertilizantes. Es necesario repetir los ensayos para confirmar esos resultados, así como realizar estudios genéticos para la identificación de los aislados bacterianos, pruebas de antagonismo contra microorganismos fitopatógenos, de producción de diversos reguladores del crecimiento vegetal, de sideróforos y demás características que permitan detectar el potencial de aprovechamiento respecto a la capacidad de estas bacterias para mejorar el crecimiento vegetal. Será de gran interés determinar si ambos aislados pueden mejorar el crecimiento del cultivo en etapas más avanzadas que la de plántula, así como el rendimiento.
