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Introducción
El uso de firmas espectrales, obtenidas mediante sensores remotos permite obtener información de nitrógeno, área foliar y biomasa que proporciona información del estado fisiológico de la planta. La valoración de estas variables será útil en la agricultura competitiva con productos agrícolas en mercados futuros. Los sensores remotos ópticos proveen información, específica y crítica, debido a su capacidad para medir indicadores biofísicos y detectar su variabilidad espacial (ASD, 1999).
Los cloroplastos contienen 70% del nitrógeno de la hoja (Madakadze et al., 1999), por lo que la clorofila domina las propiedades de reflectancia y transmitancia de la radiación del espectro visible (Ritchie, 2003) y ofrece estrecha correlación con la concentración de nitrógeno del follaje de las plantas en la reflectancia de 550 a 660 nm (Costa et al., 2001). Las formas de reflectancia en el espectro visible por las hojas cambian entre la máxima reflectancia a 550 nm y la mínima a 660 nm, cuando existen cambios de concentración de la clorofila; esos cambios de forma del espectro visible se usan para identificar clorosis asociada a deficiencias de nitrógeno (Carter y Spiering, 2002).
La interacción de la radiación solar con las moléculas foliares de las plantas controlan las reflectancias del espectro visible (VIS) y del infrarrojo (IR). Los componentes bioquímicos (pigmentos, proteínas, carbohidratos aceites, agua), morfología de la hoja (mesófilo) y arquitectura de la planta, influyen en la tendencia de las plantas para absorber, transmitir y reflejar la radiación solar de distintas longitudes de onda corta de 280 a 2800 nm (Curran et al., 2001).
Las radiaciones de longitudes de onda corta, absorbidas por las plantas son reguladas por la interacción molecular dentro del tejido vegetal, donde los electrones de las moléculas absorben longitudes de onda controladas por estructuras y enlaces químicos (Jones, 1997). La clorofila, el principal pigmento fotosintético en las plantas, controla la absorbancia de la luz visible por que la transición de los electrones en sus moléculas ocurre en; 430, 460, 640 y 660 nm, por tanto, la clorofila es un absorbente efectivo del espectro azul (400 - 500 nm) y del rojo (600 - 700 nm) (Curran, 1989).
Los índices de reflectancia de la vegetación son útiles para identificar el estado de salud de un cultivo (Ritchie, 2003).
La clorosis resulta de una absorbancia decreciente de la luz visible por la clorofila y en consecuencia un incremento de la reflectancia del espectro visible, resultando visualmente en el amarillamiento de la planta. La eficiencia de la absorbancia por la clorofila decrece en la región del infrarrojo cercano (NIR). El efecto combinado del decremento de la absorción por la clorofila y la dispersión de la luz por el mesófilo de las hojas muestran el espectro denominado rojo lejano o rojo profundo; este rojo es una línea delgada que incrementa su reflectancia entre la región del rojo e infrarrojo cercano de ese espectro, por las hojas de plantas sanas (Adams et al., 1999).
El uso de niveles críticos de concentración de un elemento en las hojas para el diagnóstico nutrimental, es una herramienta que ha permitido establecer el estado de estrés por deficiencias de nutrimentos en los cultivos. Con base en la tecnología de imágenes digitales, computadoras de alta velocidad, software y sensores remotos ópticos, es posible establecer niveles críticos de reflectancia (NCR), mediante la medición de espectros de reflectancia en la hoja o follaje y con bajo costo.
En este marco teórico, el objetivo de la investigación consistió en establecer NCR para el diagnóstico- pronóstico de la concentración de nitrógeno en el cultivo de pimiento.
Materiales y métodos
Localización
La investigación se realizó de junio a diciembre de 2006 en los invernaderos del Colegio de Postgraduados, ubicado en el km. 36.5 de la carretera México-Texcoco, Montecillo, municipio de Texcoco, estado de México.
Manejo Experimental
El cultivo de pimiento cv. Orion se estableció en un invernadero tipo baticenital.
La fecha de siembra fue el 7 de junio de 2006, colocando 200 semillas pre-germinadas por charola de 200 cavidades. Para el riego de charolas se aplicó una lámina de riego promedio de 3 mm d-1. Cuando las plántulas alcanzaron una altura aproximada de 15 cm aproximadamente, se transplantaron a vasos de unicel de 1 L de capacidad que contenían tezontle como sustrato, con una granulometría de 5 a 10 mm e irrigadas a capacidad de campo. Para tal efecto, se colocó una planta por vaso, posteriormente, cuando ésta alcanzó 30 cm de altura, se trasplantó a una bolsa de polietileno negra (30 × 35 cm).
El diseño de tratamientos consistió en 6 soluciones nutritivas con diferentes niveles de nitrógeno: 0, 4, 8, 12, 16 y 20 meq L-1, a partir de la solución Steiner (Cuadro 1). Se generaron 108 unidades experimentales, provenientes de los 6 tratamientos por 3 repeticiones y 6 muestreos. El diseño experimental fue completamente al azar con tres repeticiones.
Solución nutritiva universal de Steiner al 100%, CE = conductividad eléctrica.
Cuadro 1 Diseño de tratamientos.
Los tratamientos se comenzaron a aplicar después del segundo mes después de germinación. El pH de las soluciones nutritivas se mantuvo diariamente en un rango de 5.5-6.5, mediante la adición de H2SO4 1N. Los riegos con solución nutritiva se realizaron por las mañanas y por las tardes durante todo el experimento.
Las soluciones nutritivas se mantuvieron en recipientes con capacidad de 20 L, con su respectiva cubierta para evitar el contacto con los rayos solares, la evaporación del agua y la presencia de algas. La aplicación de los riegos se hizo mediante línea regante con goteros, dispuestos cada 30 cm y por gravedad.
En el Cuadro 2 se indican las fuentes y concentraciones de micronutrimentos adicionados a las soluciones nutritivas.
Medición de Área Foliar
El índice de área foliar (IAF) se midió usando un medidor (LI-COR, Lincolin, NE, USA LI-3100 Area Meter). Cada valor obtenido sobre cada unidad experimental fue el promedio de tres mediciones y expresada como IAF.
El porcentaje de cobertura vegetal verde fue medido con una cámara digital (Canon PowerShot A300, 3.2 Mega-píxeles) colocada a 1 m sobre cada punto del monitoreo (unidad experimental).
Obtención de Reflectancias
La obtención de datos se realizó mediante el sistema pasivo de energía reflejada (espectroradiómetro, cámara digital y escáner), en el cual los sensores de este tipo miden energía en la porción reflectiva del espectro.
Análisis Espectral y Muestreo de Hojas
La medición de la reflectancia de luz en hojas de pimiento se realizó con un espectroradiómetro (Cropscan). El espectrómetro mide tres bandas en la porción visible del espectro (485, 560 y 660 nm) y dos bandas en el rango del infrarrojo (830 y 1650 nm). También se usó una cámara digital y un escáner para la obtención de imágenes.
Esta información se analizó utilizando índices espectrales que han sido correlacionados con el estado de salud de la planta y varias concentraciones de compuestos bioquímicos de las hojas (Cuadro 3).
Análisis Químico de Nitrógeno en Tejido Vegetal
El muestreo de hojas para el análisis químico se realizó cada vez que se midió la reflectancia con el espectrómetro, estos muestreos fueron destructivos y se consideraron 3 repeticiones. Para la cuantificación de nitrógeno se utilizó la técnica de microkjeldahl (Brearen y Mulvaney, 1982).
Análisis Estadísticos
Los índices de vegetación y del IAF, el porcentaje de cobertura vegetal y nitrógeno, se expusieron a un análisis de varianza y modelación usando GLM del programa SAS (ver. 8.2) y Microsoft Excel. Se realizó una prueba de comparación de medias (Tukey, P < 5%) entre tratamientos para la reflectancia y nitrógeno total. Además, se hizo un análisis de correlación entre ellos mediante el programa estadístico SAS para probar la hipótesis propuesta.
Resultados y discusión
Comparación de Índices Espectrales Contra Concentración de Nitrógeno Total para la Identificación de Clorosis
El modelo verde (830 / 560) -1 y la tasa normalizada NDVI560 / NDVI660 se utilizaron para identificar alguna clorosis en el cultivo a priori a la percepción con la vista, ambos índices son simples y presentan un alto coeficiente de determinación al correlacionar con las concentraciones de nitrógeno, mientras que la tasa normalizada también lo tiene con las imágenes digitalizadas de cobertura vegetal. Por efectos de la cobertura vegetal, el índice NDVI560 fue comparado con NDVI660; ambos índice normalizados por la reflectancia del infrarrojo cercano (830 nm) minimizan el efecto de la fracción de la cobertura vegetal sobre la comparación directa de la reflectancia del verde (560 nm) y del rojo (660 nm) (Ritchie, 2003).
Los resultados de la comparación del NDVI560 con el NDVI660 durante la etapa de crecimiento fueron previsibles porque la reflectancia del verde es sensible a rangos amplios de concentración de clorofila (Cuadro 4), mientras que la reflectancia del rojo es insensible a concentraciones altas de clorofila (Gitelson y Merzlyak, 1998). Desviaciones a partir de la relación entre estos índices para un cultivo sin estrés hídrico pueden presentar cambios de firmas espectrales en NDVI560 debido a cambios en la concentración de clorofila. La regresión lineal de NDVI560 contra NDVI660 para los tratamientos mostraron altos coeficientes de determinación (Cuadro 4).
El comportamiento en cambio de pendientes, mostrados en el Cuadro 4 y Figura 1 se debe a que las deficiencias de nitrógeno se asocian a bajos contenidos de clorofila total. Por tanto, el porcentaje de reflectancia del verde es alto y resulta un valor bajo del NDVI560. El resultado de NDVI660 (valor tendiente a uno) es un caso contrario.
Figura 1 Relación lineal de la tasa NDVI560 / NDVI660 y concentración de nitrógeno total en hojas de pimiento.
El modelo verde es un estimador remoto de la clorofila propuesto por Gitelson et al. (2005). En el Cuadro 5 se representa este modelo ajustado por la expresión y = ax + b, con diferentes niveles de nitrógeno, el cual tiene una alta correlación (r2 > 0.8) y residuales menores de 0.1 (diferencia entre lo observado y lo predicho).
x = N%; y = modelo verde (830nm/560nm)-1; NCR = nivel crítico de reflectancia; DDT = días después del trasplante.
Cuadro 5 Modelo verde para la identificación oportuna de la clorosis.
Aunque ambos índices muestran buen ajuste a las funciones no lineales, estas fueron analizadas como funciones lineales.
El Cuadro 5 establece el nivel crítico de la concentración de nitrógeno total (3%), abajo del cual la planta presentará deficiencia del nutrimento y que se encuentra asociado con índices de reflectancia del modelo verde menores de 1.3 (nivel crítico de reflectancia-NCR).
Los parámetros estadísticos de una regresión lineal se señalan en el Cuadro 5. Por tanto, el uso de este modelo permitirá diagnosticar la concentración de nitrógeno en la fase del crecimiento del pimiento. Actualmente el modelo verde se utiliza en los sensores aéreos y espaciales, como MODIS y MERIS (Gitelson et al., 2005).
Los dos índices tienen comportamiento lineal significativo con diferencias marcadas en sus coeficientes de determinación y residuales. Esto se debe a que la tasa normalizada, propuesta por Ritchie (2003), es un índice que permite identificar deficiencias de nitrógeno a partir de la cobertura vegetal digitalizada; no así el modelo verde ajustado para la estimación de la clorofila usando las longitudes de onda 545-565 nm (Gitelson et al., 2005). Ambos índices de reflectancia vegetal han sido desarrollados para sensores de espectroradiómetros pasivos instalados en satélites. Los resultados presentados en esta investigación con el uso de un espectroradiómetro pasivo, demuestra la factibilidad de establecer niveles críticos de reflectancia confiables (P < 0.05) que coadyuven en el diagnóstico- pronóstico de la nutrición nitrogenada y rendimiento de los cultivos, a escala pequeña de una agricultura de precisión, abierta o protegida.
Identificación de Deficiencia de Nitrógeno a Partir de datos del Espectroradiómetro
La reflectancia de la radiación roja y verde por las plantas es fuertemente influenciada por la absorción de luz de la clorofila, de igual manera la deficiencia de nitrógeno está altamente correlacionada con una reducción en el contenido de clorofila y el incremento de la reflectancia de la radiación del espectro verde (Costa et al., 2001).
En el Cuadro 6 se muestra una función de ajuste lineal de la concentración de nitrógeno total en hojas y la reflectancia de la radiación con longitud de onda 560 nm (verde). El cultivo desarrollado en un medio deficiente de nitrógeno presentó un nivel crítico de reflectancia mayor al 9.5%, asociado con concentraciones menores de 3% de nitrógeno. Cuando el cultivo encontró con suficiente nitrógeno, la reflectancia fue menor a 9.5%.
x = N%; y = reflectancia del espectro verde del radiómetro; NCR = nivel crítico de reflectancia; DDT = días después del trasplante.
Cuadro 6 Comparación de la concentración de nitrógeno de la hoja de pimiento con la reflectancia simple del espectro verde del radiómetro.
En los Cuadros 6 a 9 se presentan resultados de los parámetros estadísticos de la regresión lineal, aplicados a los porcentajes de reflectancia simple del espectro verde (560 nm), obtenidos con el espectrómetro, cámara, escáner y SPAD los cuales establecieron significancia y residuales aceptables para el diagnóstico nutrimental de nitrógeno en plantas de pimiento.
x = N%; y = reflectancia del espectro verde en fotografías (256 es el 100%); NCR = nivel crítico de reflectancia; DDT = días después del trasplante.
Cuadro 7 Comparación de la concentración de nitrógeno de la hoja de pimiento con la reflectancia simple del espectro verde de fotografías.
x = N%; y = reflectancia del espectro verde en escáner; NCR = nivel crítico de reflectancia; DDT = días después del trasplante.
Cuadro 8 Comparación de la concentración de nitrógeno de la hoja de pimiento con la reflectancia simple del espectro verde en escáner.
x = N%; y = lecturas SPAD; NC = nivel crítico; DDT = días después del trasplante.
Cuadro 9 Comparación de la concentración de nitrógeno de la hoja de pimiento con las lecturas SPAD.
Sims y Gamon (2002) explicaron el comportamiento de la relación de la tasa normalizada verde/rojo y la concentración de nitrógeno, señalando que concentraciones relativamente bajas de clorofila fueron suficientes para saturar la absorción luminosa en el intervalo 660 - 680 nm, lo cual reduce la sensibilidad de estas longitudes de onda para diagnosticar situaciones de altos niveles de clorofila. Los datos de este experimento coinciden con esta idea, porque las desviaciones (saturación) ocurren también a contenidos altos de clorofila.
Por último, los factores de reflectancia en 560 nm, mostraron alta correlación con la concentración de nitrógeno de la hoja, en los tres casos estudiados y utilizando un espectrómetro. Otros autores, usando un espectroradiómetro pasivo, señalan a los factores de reflectancia en el intervalo 550 y 660 nm con alta correlación a la concentración de nitrógeno total de la hoja (Fernández et al., 1994) y contenido de clorofila, respectivamente (Adams et al., 1999).
Conclusiones
Las variaciones del espectro de reflectancia visible 560 nm, fueron ocasionadas por alteraciones en la concentración de clorofila relacionadas con concentraciones de nitrógeno total. Por tanto, estos cambios se pueden usar para identificar clorosis en tiempo real y antes de ser percibidos visualmente. El porcentaje de reflectancia del espectro verde (560 nm) es un indicador confiable para diagnosticar el estado de nitrógeno total en el tejido vegetal, ya que un nivel crítico de reflectancia (NCR) del espectro mayor del 9.5, 64 y 21%, para espectroradiómetro, cámara y escáner respectivamente, indica que el cultivo tiene concentraciones menores de 3% de nitrógeno. En consecuencia, es una condición de deficiencia nutrimental respecto a ese elemento. Las lecturas SPAD son un indicador confiable para diagnosticar el estado de nitrógeno total en el tejido vegetal, ya que un nivel crítico (NC) menor de 48.5 indica que el cultivo tiene concentraciones menores de 3% de nitrógeno. En consecuencia, es una condición de deficiencia nutrimental respecto a ese elemento. El modelo verde fue un buen estimador de la concentración de nitrógeno total, mediante firmas espectrales obtenidas con el espectrómetro. Un NCR menor de 1.3 se correlaciona con niveles de concentración menores de 3% de nitrógeno total. La tasa normalizada verde/rojo permitió identificar en tiempo real el estado de la cobertura vegetal digitalizada.
