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Introducción
Chlamydia trachomatis es la bacteria que se identifica con mayor frecuencia en las infecciones de transmisión sexual (ITS)1. La incidencia mundial de ITS por C. trachomatis reportada es de 131 millones de nuevos casos por año1. La infección crónica por este patógeno produce diversas patologías en el aparato genito-urinario de mujeres y varones2. En la mujer se desarrolla enfermedad pélvica inflamatoria, infertilidad por factor tubario, embarazos ectópicos y dolor pélvico crónico1. En el varón se desarrolla uretritis no gonocócica, epididimitis y orquitis2.
Las cepas de C. trachomatis están clasificadas en dos biovariedades, el tracoma, que incluye las cepas A-C que producen una infección ocular y las cepas D-K que infecta células de la mucosa genitourinaria, respiratoria y conjuntival y el biovar LGV (linfogranuloma venéreo), que produce infecciones en los nódulos linfáticos inguinales3. Las cepas de ambos biovares se identificaron mediante serología al reconocer diferentes epítopos de la proteína principal de membrana externa (MOMP), que constituye el 60% de todas las proteínas de superficie3-5. El análisis serológico de la MOMP identificó 19 serotipos de C. trachomatis4. Sin embargo, la exploración de la secuencia nucleotídica del gen de la MOMP (ompA) que tiene un tamaño molecular aproximado de 1,194 pb, ha evidenciado la existencia de más de 20 genotipos5-7. Lo anterior es debido posiblemente a la recombinación de genética que ocurre entre las diferentes cepas de Chlamydia, como se demostró para la cepa L2c de C. trachomatis3,6.
Actualmente, los serotipos más frecuentes en el mundo en individuos heterosexuales son D, E y F8,9. Los análisis de las secuencias nucleotídicas del gen ompA del serovar F han reportado que este serovar muestra muy pocas variaciones en la secuencias nucleotídicas (SNP por sus siglas en inglés) con respecto a su cepa prototipo, y a diferencia de lo que ocurre con serotipos G y L2, que muestran un mayor número de SNP9,10. En México, la cepa F es el serovar de C. trachomatis que más frecuentemente se ha identificado en mujeres y hombres con infertilidad11,12. Un estudio previo de cuatro cepas del genotipo F aislada e identificadas en 2011, mostraron que dos de ellas presentaban cambios en su secuencia de aminoácidos en las regiones constantes de la MOMP aumentando su avidez por la molécula HLAB27, molécula de histocompatibilidad asociada al desarrollo de enfermedades autoinmunes como la artritis reactiva, enfermedad que se ha asociado a la infección por este patógeno13. El objetivo de este estudio fue hacer un análisis de la homología y analogía de las cepas F aisladas en México con respecto a otras cepas F identificadas a nivel mundial.
Material y métodos
Enzimas de restricción
Todas las enzimas de restricción empleadas en este estudio fueron de Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, EE.UU.): AluI (Arthrobacter luteus), PstI (Providencia stuarti), HinfI (Haemophilus influenzae Rf), HindIII (Haemophilus influenzae Rd) y TaqI (Thermus aquaticus YT-1).
Genotipo F de Chlamydia trachomatis
Se analizaron siete genotipos del serotipo F de C. trachomatis que fueron aisladas e identificadas en 2011 de muestras endocervicales de mujeres que asistieron a un hospital de tercer nivel por causas de infertilidad. La identificación del serotipo se realizó mediante la secuenciación nucleotídica de un fragmento de 879 pb. El análisis de secuenciación se realizó en el Laboratorio Nacional de Biodiversidad del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México, para ello se empleó un analizador genético ABI-PRISM 310 (PE Biosystem). El producto de 879 pb se obtuvo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada. Todas las condiciones de reacción de la PCR fueron descritas previamente por de Jesús de Haro-Cruz et al. en 201111. Las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron analizadas en el programa Bioedit versión 7.2, y se compararon con secuencias reportadas previamente en el Genbank de The National Center for Biotechnology Information (NCBI). El árbol filogenético se diseñó mediante el programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA Software versión 11.0), mediante el modelo de máxima parsimonia.
Clonación del gen ompA del genotipo F
Para realizar varios análisis y repeticiones con las diversas enzimas de restricción, el producto de amplificación de 879 pb del gen ompA de cada una de las cepas a analizar fue clonado al plásmido pGEM-T easy (Promega Corporation. Madison, WI, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del proveedor, de la siguiente manera: a un tubo Eppendorf se le adicionó 7.5 μl del buffer de ligación, 1 μl del vector (pGEM-T easy), 3 U/μl de ADN ligasa, 5.5 μl del fragmento de 879 pb y la cantidad necesaria de agua desionizada para alcanzar un volumen final de reacción de 15 μl. El tubo se incubó por 2 h a temperatura ambiente y después a 4 °C toda la noche. Posteriormente este vector fue insertado en células de Escherichia coli JM109 competentes, para ello, a un tubo Eppendorf con 100 μl de una suspensión de E. coli se le adicionó 0.5 ml de CaCl2 y 15 μl del vector. Después, el tubo Eppendorf se incubó por 30 min en hielo, posteriormente, el tubo se incubó a 45 °C en baño maría por 45 s y se incubó nuevamente en hielo por 2 min más. Pasado el tiempo de incubación, al tubo Eppendorf se le agregó 400 μl del medio SOC, se mezcló y se incubó por 1 h a 37 °C. Finalmente, la E. coli transformada fue sembrada en placas de agar LB con ampicilina. Las placas se incubaron por 24 h a 37 °C, las colonias resistentes a la ampicilina se consideraron como bacterias que presentaron el vector y la ligación del producto de 879 pb.
Selección de clonas transformadas y purificación del plásmido
La confirmación de la inserción del plásmido se realizó en aquellas colonias que fueron resistentes a la ampicilina. Para ello, se realizó la extracción del plásmido mediante la técnica de miniprep. La extracción e integridad del plásmido se corroboró mediante electroforesis en agarosa al 0.8%. La amplificación del fragmento de 879 pb del gen ompA de C. trachomatis mediante PCR corroboró la presencia del vector.
Amplificación del fragmento de 879 pb
La amplificación del fragmento de 879 pb del gen ompA de las cepas clonadas se realizó utilizando los iniciadores P3 (5´-TTTTGTTGACGACTT CCGTGTTTT-3) y P4 (5-TTTTCTAGATTTTACCTTGTTCAA T/CTG-3-) descritos por Yang et al.14. En cada reacción se utilizó regulador (1X), 3 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTPs, 25 pM iniciadores, 2.5 U deTaq polimerasa y 5 μl del ADN plasmídico de la E. coli transformante. Las condiciones del ensayo de la PCR fueron las siguientes: 35 ciclos de amplificación (que consistió en un minuto a 95 °C, un minuto a 59 °C y un minuto a 70 °C), todo se realizó en un termociclador Techne TC-312 (Scientific Support, Inc., CA, EE.UU.). Los productos de la PCR se visualizaron por tinción con bromuro de etidio en geles de agarosa al 2%. El ADN del serovar L2 (434/Bu; ATCC VR-902B) y D (UW3/CX; ATCC VR-885D) de C. trachomatis se utilizó como controles positivos.
Análisis de RFLP
Los productos de 879 pb del gen ompA fueron sometidos a digestión con diferentes endonucleasas de restricción durante diez horas a 37 °C. La digestión se llevó a cabo en un volumen final de 20 μl. Cada tubo Eppendorf contenía 2 U de la endonucleasa, 8 μl del producto de PCR y 2 μl del buffer de la endonucleasa de restricción (2X), posteriormente se incubó el tubo como se describió anteriormente. Los fragmentos de restricción obtenidos fueron analizados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%11,14. Cuando se utilizaron dos enzimas se agregó 1 μl de cada enzima y 2 μl del buffer compatible para ambas enzimas o el Multi-Core (Promega) y se incubó bajo las mismas condiciones anteriormente descritas. Para observar el patrón de bandas se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% en TBE y revelado con bromuro de etidio al 1%.
Resultados
Análisis de la secuencia nucleotídica del gen ompA
En la Figura 1 se muestra la secuencia nucleotídica del gen ompA de las siete cepas F aisladas en México, estas secuencias fueron alineadas con 16 cepas identificadas en diversos lugares y que fueron reportadas en el GenBank durante 2004 al 2019. En el análisis de alineamiento de 776 pb evidenció (el análisis de este tamaño fue debido a que algunas secuencias del gen ompA reportadas en GenBank son parciales) que el mayor polimorfismo se encuentra en las regiones variables (VS) de este gen. La cepa F-CDC9 (con número de identificación AY535120.1) aislada en 2004 en EE.UU. mostró la mayor variabilidad en las regiones variables 3 y 4 (VS3 y VS4). En cuanto a las cepas mexicanas, solo se observó SNP en la región VS1 en las cepas 24.1 y 203.1, mientras que la cepa 473.1 mostró el mayor número de SNP en la región VS4.
Figura 1 Secuencia nucleotídica del fragmento de 879 pb del gen ompA del genotipo F de Chlamydia trachomatis.
Otros cambios de nucleótidos fueron observados en la región VS1 (C78T) de la cepa 24; en la cepa 287 en la región VS3 (C575T); en la cepa 161 en la región VS4 (C830A) y en la cepa 473, en las regiones VS2 (C335T) y VS4 (A710T y C712T); cabe señalar que la cepa 473 mostró varios cambios de nucleótidos en la parte final de la región VS4 a partir del nucleótido 807 (Tabla 1).
Tabla 1 Sitios de mutación en las regiones variables del gen ompA de genotipos F de Chlamydia trachomatis aislados en México
| Cepa | Mutación | Cambio de aminoácido | Cambio en la estructura secundaria | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Región | Posición | Cambio | Posición | Cambio | Posición | Cambio | |
| 24 | VS1 | 78 | C  T |
26 | Thr Thr |
- | - |
| 161 | Sin cambios | - | - | - | - | - | - |
| 203 | VS1 | 78 | C T |
26 | Thr Thr |
- | - |
| 287 | VS3 | 575 | C T |
192 | Thr Ile |
58 | β-plegada vuelta |
| 473 | VS2 | 335 | C T |
112 | Ser Phe |
234 | β-plegada vuelta |
| VS4 | 710 | A T |
237 | Gln Leu |
58 | β-plegada vuelta |
|
| VS4 | 712 | C T |
238 | Pro Ser |
306 | Vuelta β-plegada |
|
| 481 | Sin cambios | - | - | - | - | - | - |
La Figura 2 muestra el árbol filogenético de las cepas analizadas y la posición que muestran las cepas mexicanas, las cuales se agruparon en 2 clados. Las cepas 161 y 214 con asociación con cepas de Asia (Tailandia, Rusia y Japón) reportadas entre 2014 y 2019. Las cepas 24, 203, 287, 473 y 481 con cepas de EE.UU. Sin embargo cabe señalar que la cepa 24 se encuentra más distanciada de la cepa 203.
Mapeo de los sitios de restricción
En la Figura 3A se muestran los patrones del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) obtenidos del gen ompA de las cepas F tratadas con la enzima de restricción AluI, fueron identificados cuatro fragmentos con tamaño molecular aproximado de 350, 275, 100 y 75 pb. Con la enzima de restricción HindIII (Fig. 3B) se observaron dos fragmentos, uno de aproximadamente 700 pb y otro de 179 pb. Con HinfI (Fig. 3C) se evidenciaron tres bandas de aproximadamente 640, 179 y 60 pb, ninguna diferencia fue observada entre las cepas analizadas. En cuanto al uso de dos enzimas de restricción (Fig. 4), se observó que la combinación AluI y PstI (Fig. 4A) formó entre tres y cuatro fragmentos. La cepa 161 mostró cuatro fragmentos cercanos a 350, 250, 100 y 75 pb, mientras que las cepas 24, 214, 473 y 481 identificaron tres bandas de aproximadamente 250, 100 y 75 pb. En cuanto a la combinación de las enzimas HinfI y TaqI, el resultado obtenido fue que todas las cepas formaron dos fragmentos, uno de 450 pb y otros de 150 pb, excepto la cepa 473, que formó un fragmento de 150 pb y otro de 130 pb (Fig. 4B).
Figura 3 Análisis de RFLP del gen ompA de las cepas F tratadas con diferentes enzimas de restricción. A: enzima AluI. B: HindIII. C: Hinfl. El análisis se realizó en gel de poliacrilamida al 8%. Carril 1, marcador de tamaño molecular; carril 2, cepa 24; carril 3, cepa 161; carril 4, cepa 214; carril 5, cepa 473, y carril 6, cepa 481.AluI: Arthrobacter luteus; HinfI: Haemophilus influenzae Rf; HindIII: Haemophilus influenzae Rd; RFLP: polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism).
Figura 4 Análisis de RFLP del gen ompA de las cepas F tratadas con la combinación de endonucleasas. A: enzimas AluI y PstI. B: HinfI y TaqI. El análisis se realizó en gel de poliacrilamida al 8%. Carril 1, marcador de tamaño molecular; carril 2, cepa 24; carril 3, cepa 161; carril 4, cepa 214; carril 5, cepa 473 y carril 6, cepa 481.AluI: Arthrobacter luteus; PstI: Providencia stuarti; HinfI: Haemophilus influenzae Rf; TaqI: Thermus aquaticus YT-1; RFLP: polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism).
Por otro lado, mediante el análisis in silico utilizando el programa NEBcutter® V2.0 se analizó que las enzimas de restricción HinfI y TaqI identificaron que la cepa 473 y la cepa AY535116.1 de EE.UU. tienen patrones diferentes de RFLP en la región VS4 con respecto a los demás genotipos analizados (Fig. 5).
Discusión
Conocer la distribución geográfica y la prevalencia de los genotipos y genovariantes de C. trachomatis en México es de gran importancia desde el punto de vista epidemiológico, ya que se puede conocer la manera en que estos serovares circulan en la población heterosexual mexicana, así como la aparición de nuevas variantes que estén circulando por el mundo. Actualmente se investiga la importancia evolutiva, clínica y epidemiológica de la recombinación genética de las diferentes cepas de C. trachomatis. En 2017, Hadfield et al15. examinaron 563 genomas de esta bacteria, de los cuales detectaron 1,116 bloques de recombinación putativos, lo que abarcó en promedio 7,5 kb de recombinación genética (IC95%: 7.0-8.0 kb) y cubrieron en promedio 246 kb por aislado (23% del genoma) con una r/m media de 0.31. Uno de los puntos de mayor recombinación que se observaron inicialmente fue en el locus ompA15.
El gen ompA ha sido útil para identificar los diferentes genotipos de C. trachomatis. Del 60-70% de los casos de infección urogenital por este patógeno son los genotipos E y F los que han experimentado una recombinación genética reciente y una expansión del linaje con pocas variaciones en el gen ompA16. En la zona conurbada de Ciudad de México (CDMX), el genotipo identificado más frecuentemente es el F seguido del E y D, mientras que en la Ciudad de Guadalajara es el E seguido del F y D11,12,17. En recientes estudios realizados en la CDMX en 202212, el genotipo F sigue siendo el más dominante y no ha variado en su prevalencia (50% son del genotipo F), y como se ha informado, el genotipo F es uno de los que muestran menor variabilidad genética a nivel mundial, tal y como se observa en el árbol filogenético analizado de 777 pb de este estudio, a excepción de la cepa F-CDC9 (AY535120.1), que fue aislada e identificada en 2004 en EE.UU18. y que al parecer no se ha expandido a otras partes del mundo. Sin embargo, es importante señalar que solo se analizaron las regiones VS1-VS4 debido a que varias de las secuencia nucleotídicas del gen opmA reportadas en el Gen Bank son secuencias parciales.
Como se describió anteriormente, solo el 6.3% de las cepas F inscritas en el Gen Bank muestran SNP, y como en México hay un alto porcentaje de individuos infectados por el genotipo F es necesario demostrar si estas cepas muestran variación genética que indique si son clados específicos de México. El análisis de las secuencias nucleotídicas de las cepas 473 y 481 fueron muy similares a las cepas de EE.UU., mientras que las cepas 161 y 214 a cepas de Japón, Rusia, Tailandia y EE.UU. Por último, las cepas 24, 203 y 287 fueron cercanas a las cepas de EE.UU. Aunque, posiblemente, las cepas 24 y 203 son cepas específicas de México al mostrar un SNP en la posición 288 que muestra un cambio de una citosina (C) por una timina (T) (C288T), sin haber modificación en el aminoácido ni con las enzimas de restricción utilizadas en este estudio. Es importante indicar que la cepa 473 mostró mayor polimorfismo en la región VS4 y diferencias en el patrón de RFLP con la mezcla de enzimas HinfI y TaqI, que no se observaron con otras cepas mexicanas, lo que sugiere que posiblemente es una cepa regional.
Se ha informado que la ubicación geográfica de donde se aíslan las cepas está asociada significativamente con la distancia filogenética entre los linajes urogenitales de Chlamydia4,10. Debido a lo anterior hay cierta similitud entre las cepas americanas con las mexicanas, sin embargo también existe relación con cepas japonesas y tailandesas, lo que significa que la globalización social participa de manera sustancial en la importación de cepas de C. trachomatis a diversas regiones de México y del mundo.
Finalmente, se observó que mediante el mapeo con las enzimas de restricción HinfI y TaqI se puede identificar la existencia de genovariantes del genotipo F como se observa con la cepa 473 y la cepa AY535116.1 de EE.UU. que muestran patrones diferentes de RFLP en la región VS4 con respecto a los demás genotipos analizados (Fig. 5). Un estudio realizado en 2019 por Feodorova et al10. demostró la presencia de genovariantes dentro de los genotipos de C. trachomatis. El análisis de SNP del gen ompA (fragmento de 1,156 pb) en muestras de individuos eslavos (E>G>D) y no eslavos (E>G>K) encontró 13 variantes o subtipos del gen ompA, como E (E1, E2, E6), G (G1, G2, G3, G5), F1, K, D (D1, Da2), J1 y H2. A diferencia de este, Feodorova et al10. no encontraron una alta frecuencia del genotipo F como sucede en México, por lo que posiblemente también existen subtipos o genovariantes del genotipo F o se están desarrollando estas. Debido a lo anterior es necesario seguir realizando estudios al respecto.
