Los hongos silvestres de Ensenada, Baja California, han sido estudiados por varios autores, tanto sus aspectos taxonómicos como ecológicos (^{Ayala y Guzmán, 1984}; ^{Ayala et al., 1988}; ^{Moreno et al., 1993}; ^{Candusso et al., 1994}; ^{Moreno y Ayala, 1996}, ²⁰⁰³, ²⁰⁰⁷). Sin embargo, solo se conoce su distribución en la zona mediterránea californiana.

Uno de los atributos más relevantes que se ha documentado en hongos silvestres, son sus propiedades medicinales como antimicrobianas, antifúngicas, antioxidantes y anticancerígenas Entre los principios activos anticancerígenos, bioquímicamente están representados por lectinas, β-glucanos, ergosteroles y argininas, que actúan en la estimulación del sistema inmunológico, antiproliferación, angigénesis y daño celular (^{Novaes et al., 2007}, ²⁰¹¹).

El presente estudio tiene como objetivo analizar el efecto citotóxico de extractos orgánicos de hongos silvestres de Ensenada, Baja California, sobre líneas celulares epiteliales de cáncer de pulmón (ATCC: NCI-H-460). Para lo cual se realizaron recolectas de cuerpos fructíferos de hongos en la región de Ensenada, en áreas con encino (Quercus agrifolia Nee.), durante los meses de noviembre a marzo del año 2012 al 2013, periodo en el que se presentó la mayor precipitación pluvial en la zona. Las especies obtenidas fueron caracterizadas y deshidratadas para su conservación. Todo el material fue descrito macroscópicamente en fresco y para el análisis microscópico se empleó material deshidratado, para lo cual se hicieron cortes finos y se montaron con hidróxido de potasio (KOH) al 5%, rojo de Congo y azul de algodón de lactofenol. El material fue identificado microscópicamente con base en bibliografía especializada (^{Earle, 1905}; ^{Breitenbach y Kränzlin, 1991}; ^{Moser y Ammirati, 1997}; ^{Ayala y Moreno, 2007}; ^{Bojantchev y Davis, 2011}). Los ejemplares identificados se depositaron en el herbario BCMEX de la Universidad Autónoma de Baja California.

De cada ejemplar identificado se prepararon extractos etanólicos, para lo cual se tomó una muestra de cuerpo fructífero deshidratado y se cortó en pequeños trozos (aprox. 1 cm³⁾ y se colocaron por separado en recipientes de vidrio con etanol. Se dejaron extraer por aproximadamente dos semanas, se filtraron al vacío y el líquido se concentró hasta sequedad mediante destilación a presión reducida en un rotoevaporador (HEIDOLPH(r), modelo Collegiate) a una temperatura no mayor a 35 oC. El sólido resultante se recuperó con 5 mL de etanol en viales a peso constante y de nuevo se concentraron a sequedad en el rotoevaporador y se pesaron. De cada extracto se hicieron diluciones a una concentración de 0.1 mg/mL con agua destilada.

Una vez preparadas las diluciones para el bioensayo, se cultivaron las células epiteliales de cáncer de pulmón en medio comercial "Roswell Park Memorial Institute Medium" (RPMI, SIGMA # R0883) suplementado con suero fetal bovino (SIGMA # 12133C) y antibiótico (SIGMA # A5955) en una campana de flujo laminar. Las células fueron resuspendidas en medio fresco de RPMI. Se tomó 1 mL de esta suspensión y se le añadió 5 μL de azul de metileno y 85 μL de amortiguador de fosfatos salino pH 7.0 para su cuantificación en una cámara Neubauer bajo un microscopio óptico a 400X. Enseguida se ajustó la concentración a 500,000 células por mililitro (^{Becerril-Espinosa et al., 2012}).

Para la valoración de citotoxicidad se colocaron 5,000 células en cada uno de los 96 pozos de la placa, se les añadió 100 μL del medio RPMI y 20 μL de cada extracto etanólico, por triplicado. Como control positivo se empleó sulfóxido de dimetilo (DMSO) y como control negativo se empleó el mismo método pero sin extracto. Los cultivos se incubaron por 24 horas en un ambiente de CO₂ al 5%. Posteriormente, se valoraron las células viables en proliferación, añadiendo 20 μL del reactivo CELLTiter 96(r) a cada pozo y dejándolas reposar de 3 a 4 h. Enseguida se realizó la lectura de las placas observando su absorbancia a 495 nm en un lector ELISA (Thermo Scientific(r)). Finalmente se calculó el porcentaje de mortalidad de células de cáncer de pulmón, empleando las absorbancia obtenidas utilizando las siguientes formulas:

% de mortalidad = (Abs del DMSO / Abs de la muestra)*100

% de sobrevivencia = 100 % de mortalidad

Donde Abs = Absorbancia, Abs del DMSO = 0.2440

Se obtuvieron un total de 35 extractos etanólicos a partir de los cuerpos fructíferos secos correspondientes a 26 especies de hongos, los cuales fueron recolectados en 17 diferentes localidades, principalmente de bosques de encino (Tabla 1). Es importante recalcar que la cantidad de extracto que se obtuvo, dependió directamente de la biomasa de los basidiomas, de tal manera que a mayor biomasa mayor extracto obtenido.

Tabla 1 Especies estudiadas, datos de colecta y cantidad de extracto obtenido 

Localidades: 1. Arroyo San Miguel. 2. Arroyo Villas del Prado. 3. Cañón Doña Petra. 4. El Gallo. 5. El Junco. 6. El Salto. 7. Ejido Uruapan. 8. Las Chichihuas. 9. La Misión. 10. Las Lomas. 11. Parque Revolución. 12. Presa Emilio López Zamora. 13. Rancho la cascada. 14. San José de la Zorra. 15. La Misión. 16. UABC Sauzal. 17. Zona Urbana.

Aunque se lograron recolectar 35 muestras, solo de 18 extractos de 15 especies fue posible evaluar su efecto citotóxico, ya que la poca solubilidad que presentaron en agua destilada, impidió que se registraran datos confiables de absorbancia. Lo anterior debido a que estos extractos contienen en su mayoría substancias apolares como ácidos grasos, que pueden ser utilizado en otros estudios, para evaluar otro tipo de actividades como: antibacteriales o cardiotónicos.

Se consideraron bioactivos aquellos extractos que produjeron un porcentaje de mortalidad mayor al 50% en los cultivos celulares de cáncer de pulmón, sin que esto signifique que aquellas que presentaron un porcentaje menor no la tengan, ya que como se puede observar en la Figura 1 hay una gran bioactividad en las muestras seleccionadas. De tal manera que A. xantho dermus Genev., Boletus amygdalinus (Thiers) Thiers, y Geastrum corollinum (Batsch) Hollós resultaron ser las más bioactivas por tener los porcentajes de mortandad por encima del 50 % (Figura 1).

Figura 1 Porcentaje de mortalidad y sobrevivencia en los cultivos, con extractos etanólicos de hongos silvestres frente a la línea celular de cáncer de pulmón H-460. 

Evidentemente todos los taxa que fueron sometidos a esta evaluación tienen por naturaleza una importancia ecológica. Sin embargo A. xanthodermus, B. amygdalinus y G. corollinum se les asigna un valor adicional por los atributos medicinales que pueden representar, los cuales se discuten a continuación:

Agaricus xanthodermus se reconoce fácilmente por su cambio de color amarillo intenso, ya sea al tacto o al agregarle KOH al 5%, además de su fuerte olor a fenol. Es considerada una especie tóxica no mortal, que cuando se ingiere causa dolor estomacal, nauseas, vómito y diarrea (^{Arora, 1986}). Estudios sobre la composición química de este basidiomiceto, indican que los trastornos que ocasiona son debido a la gran cantidad de compuestos fenólicos que contiene, como 4,4'-dihidroxiazobenzeno, fenol, p-quinol, y 4,4'-dihidroxibifenilo, los cuales están también involucrados en el cambio de color para su identificación (^{Gill y Strauch, 1984}).

Boletus amygdalinus es una especie de la región mediterránea californiana, la cual forma una asociación micorrizógena con Quercus agrifolia (^{García-Jiménez, 1999}). Esto en aspectos de conservación y manejo de recurso bióticos, simboliza una señal de alarma para valorar y contemplar a estos hongos, tanto por su relevancia ecosistémica, como por su potencial medicinal. Cabe destacar que en especies cercanas con alto valor culinario como Boletus edulis, se ha examinado su efecto citotóxico en líneas celulares de cáncer de hepatoma BEL-7402, colon HT-29, pulmón SPC-A1 y glioblastoma U-251, con una concentración inhibitoria máxima media (IC₅₀) de 6.29, 6.98, 4.79 y 7.54 μM, respectivamente (^{Liang, 2014}).

Un dato relevante es la variación de la citotoxicidad de los extractos, en una especie de acuerdo con los sitios de colecta. En la Figura 1 se pueden apreciar como las muestras de Boletus amygdalinus colectadas en distintas localidades, presentaron resultados de mortalidad (14.61% y 57.23%) y sobrevivencia (85.39% y 42.77%), en un intervalo muy amplio. Se ha señalado que los factores ambientales y/o sustrato influyen en la producción de ciertos metabolitos secundarios (^{Páres y Juárez, 1997}), condiciones que habría que demostrar si estarían afectando en la producción de compuestos citotóxicos, como en este estudio.

Geastrum corollinum obtuvo los valores más altos en mortalidad (68.48%), sobre los cultivos celulares de cáncer de pulmón. Al respecto, se ha documentado en otras especies del mismo género como G. saccatum Fr., que tiene propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y citotóxicas, y sus extractos son abundantes en β-glucanos (^{Dore et al., 2007}).

La bioactividad encontrada en este trabajo es similar a la encontrada en un trabajo paralelo en el que se estudiaron varias especies de hongos agaricales, reportados con propiedades medicinales.

Específicamente la especie Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. recolectada también en la región de Ensenada, presentó un porcentaje de mortalidad de 47% frente a células de cáncer de pulmón H-460, y de 27 % frente a células de cáncer colorrectal HCT-116. Ganoderma lucidum también presentó propiedades antioxidantes al dar positiva la reacción de decoloración oxidativa del β-caroteno con un 51.04%, así como reducción del radical catión ABTS_.+ con una concentración efectiva media (CE₅₀) de 0.987 (Proyecto de Investigación 2012-OseoCdti-188920, CONACYT), G. lucidum contiene metabolitos secundarios que comprenden polisacáridos, triterpenoides y esteroles, con propiedades farmacológicas como antitumorales, inmunomoduladoras, hipoglucemiantes, entre otras (^{Lindequist, 1995}; ^{Zhou, et al., 2007}; ^{Chang y Buswell, 2008}).

En este estudio se comprobó que los ejemplares colectados en Ensenada, BC, podrían representar una buena fuente de compuestos con actividad citotóxica y antioxidante. Este estudio representa el primer reporte del potencial uso medicinal de la diversidad fúngica de la región.