Contribuciones

 

El sistema Cre/loxP1 como una herramienta genética en Yarrowia lipolytica

 

The system Cre/loxP as a tool in the molecular study of Yarrowia lipolytica

 

Raymundo Rosas–Quijano¹, Claude Gaillardin²

 

¹ Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico Nacional, Reynosa, C.P. 88710, Tamaulipas, México. C. P. 88710.

² Microbiologie et Génétique Moléculaire, CNRS UMR 2582INRA UMR1238, Institut National Agronomique Paris–Grignon, Thiverval Grignon, 78850, France.

 

Autor para correspondencia:
Raymundo Rosas Quijano
rrosasq@ipn.mx

 

Recibido 1 de junio 2010;
aceptado 27 de febrero 2011.

 

Abstract

The non–conventional yeast Yarrowia lipolytica has been broadly studied, its whole genome sequence is known and public, and there are many molecular tools for study itself. However, their genetic markers are limited. Therefore, we need to recycle these markers. Taking advantage of Y. lipolytica has the ability for express different sources of recombinant protein, we constructed one replicating plasmid for Cre1 recombinase from one replicative plasmid under the direction of a strong promoter. The recombinase activity was evaluated in mutants obtained by transposition. The mTnYl1plasmid includes two Lox at ends who are target sequences of phage P1 recombinase. Our results indicated high efficiency and specificity of the recombinase activity. Based on this strategy we replaced the URA3 selective marker gene contained in mTnYl1 and then we sequenced the segments generated after recombinase activity to corroborate its proper action. This strategy is simple as well as a powerful molecular biology tool for Y. lipolytica study under selection and use of one single marker.

Keywords: heterologous expression, recombinase, genetic marker.

 

Resumen

La levadura no convencional Yarrowia lipolytica ha sido estudiada ampliamente, su genoma está totalmente secuenciado y existen numerosas herramientas moleculares para su estudio; sin embargo, los marcadores genéticos son limitados. Por tanto, surge la necesidad de reciclar dichos marcadores. Dada la ventaja de que Y. lipolytica expresa diferentes fuentes de proteína recombinante se construyó un plásmido de expresión para la recombinasa Cre1 a partir de un plásmido replicativo bajo la dirección de un promotor fuerte. La actividad de la recombinasa se evaluó en mutantes obtenidas por transposición. El plásmido mTnYl1 contiene en sus extremos dos secuencias Lox que son blanco de la recombinasa del fago P1. Los resultados indicaron una alta eficiencia de actividad y especificidad de la recombinasa. Bajo esta estrategia, se hizo el recambio del gen marcador de selección URA3 contenido en mTnYl1 y se secuenció el segmento generado después de la acción de la recombinasa para corroborar su adecuada acción. Esta estrategia es simple pero es una poderosa herramienta de biología molecular para realizar manipulaciones múltiples en ingeniería genética para el estudio de Y. lipolytica bajo la selección y utilización de un solo gen marcador.

Palabras clave: expresión heteróloga, recombinasa, marcadores genéticos.

 

Introducción

La levadura no convencional Yarrowia lipolytica (Wick. Kurtzman & Herman) Vander Walt & Arx ha sido estudiada ampliamente. Es un hongo ascomiceto aerobio, con diversas aplicaciones a nivel biotecnológico, debido a que produce altas cantidades de ácidos orgánicos como ácido cítrico y 2–cetoglutárico a partir de hidrocarburos como única fuente de carbono; esta capacidad de metabolizar hidrocarburos y sus características secretoras de enzimas, hace que su potencial biotecnológico sea atractivo (Barth y Gaillardin, 1997). Y. lipolytica es un organismo ubicuo pero frecuentemente aislado de substratos complejos que contienen altos niveles de proteínas y de lípidos, incluso de ambientes marinos (Wang et al., 2009). Esta levadura es considerada como no patogénica, y varios procesos industriales que emplean a Y. lipolytica se han clasificados como "GRAS" (Generally Regarded As Safe) por la FDA (Food and Drug Administration) (Madzak et al., 2004). Es un hongo heterotálico y dimórfico, capaz de formar tanto levaduras, como hifas o pseudohifas dependiendo de las condiciones de crecimiento (Barth y Gaillardin, 1997). Y. lipolytica es un excelente modelo de estudio, debido a la facilidad de manipulación con técnicas básicas de biología y genética molecular, las cuales están bien establecidas; además, la secuencia de su genoma se encuentra disponible al público desde hace algunos años y, es conocido que varios de sus fenómenos fisiológicos y bioquímicos son semejantes a los de otros eucariotas incluso a sistemas superiores como plantas y animales; en este organismo frecuentemente se estudia el metabolismo de alcanos y ácidos grasos (Wang et al., 1999; Mauersberger et al., 2001), el control del dimorfismo (Hurtado et al., 2000; Pérez–Campo y Domínguez, 2001; Cervantes–Chávez et al., 2006, 2009), la biogénesis de los peroxisomas (Titorenko y Rachubinski, 2009), las vías generales de secreción (Beckerich et al., 1998), entre otras; esto a través de herramientas genético–moleculares, que implican la caracterización y el análisis funcional de los genes correspondientes y sus productos; como en otros organismos, en Y. lipolytica algunos genes están formando parte de familias numerosas, por tanto el análisis funcional de un gen desconocido de esta clase implicaría interrumpir todos sus miembros para obtener la descripción del fenotipo real de una mutante nula, para ello es necesario generar mutantes múltiples; otro caso, es el análisis de mutantes nulas en un diploide a donde se requiere interrumpir los dos alelos; lo que conlleva a utilizar dos o más genes de selección. Desafortunadamente, el número de genes marcadores empleados en el estudio de Y. lipolytica son limitados; por esta razón, rescatar el marcador de selección para reutilizarlo, es un paso obligado durante un análisis funcional bajo estas condiciones; para el caso de Y. lipolytica se ha reportado un procedimiento eficiente conocido como pop–in, pop–out, que inicialmente fue diseñado para el estudio de Saccharomyces cerevisiae (Boeke et al., 1984). Otro método también empleado es el "ura blaster" previamente descrito para Candida albicans (Fonzi e Irwin, 1993). En ambos procedimientos se emplea el ácido 5–fluororótico (5–FOA), agente que resulta tóxico en cepas que tienen la vía de síntesis de uracilo íntegra (Boeke et al., 1984), por lo tanto este compuesto permite la selección de cepas URA3 las cuales han perdido este gen marcador. El procedimiento es efectivo, sin embargo genera el crecimiento de falsos positivos debido a mutaciones puntuales espontáneas en el gen URA5 lo que no es deseable; aparte, son métodos laboriosos que consumen tiempo y están limitados exclusivamente al gen Y1URA3; por lo tanto, un procedimiento alterno es necesario. La estrategia Cre–loxP ha sido una herramienta genético–molecular altamente eficiente por su sencillez y eficacia para el rescate de genes marcadores en sistemas bacterianos (Weng et al., 2009), fungicos (Carter y Delneri, 2010), en insectos (Nimmo et al., 2006), en animales (Miller et al., 2008) y en vegetales (Chakraborti et al., 2008). El sistema Cre–loxP contiene dos elementos: la recombinasa del bacteriófago P1 (Cre), y dos secuencias específicas que son el blanco de la recombinasa, denominadas loxPl. Estas secuencias constan de 34 pb, compuesta por dos repetidos invertidos idénticos de 13 pb separados por una región de 8 pb (Hamilton y Abremski, 1984). Los sitios de reconocimiento del sistema Cre–loxP median el intercambio de las moléculas de DNA que participan en la recombinación de manera intra o inter específica, tal reacción es catalizada por la recombinasa Cre (Sauer, 1987). Dependiendo de la localización y de la orientación de estos sitios, la recombinasa puede invertir, insertar, suprimir o intercambiar fragmentos de DNA en sistemas procarióntes o eucariótes (Kilby et al., 1993; Sauer, 1994; Ow, 2002). El primer reporte sobre la aplicación del sistema Cre–loxP en las levaduras fue descrito por Sauer (1987) en S. cerevisiae; a partir de entonces, este sistema ha sido adaptado a otras como Kluyveromyces lactis (Steensma y Ter Linde, 2001; Gueldener et al., 2002), Candida albicans (Dennison et al., 2005), Schizosaccharomycespombe (Iwaki y Takegawa, 2004; Hentges et al., 2005), y Hansenula polymorpha (Krappmann et al., 2000); sin embargo, a la fecha este sistema no ha sido explorado totalmente en Y. lipolytica. Por lo anterior, en este trabajo se desarrolló una estrategia para expresar la recombinasa Cre bajo un promotor fuerte de Y. lipolytica (XPR2), se probó su actividad en mutantes que fueron obtenidas por transposición, el transposón contiene el gen de selección YlURA3 flanqueado por las secuencias Lox (Neuvéglise et al., 1998). El sistema Cre–loxP puede ser una herramienta molecular que permita el estudio de los genes de interés de una manera simple y económica, además de reciclar el gen de selección y generar mutantes seriadas bajo un mismo marcador de selección.

 

Materiales y métodos

Cepas, medios de cultivo y condiciones de crecimiento

Cepas bacterianas. Las bacterias empleadas para mantenimiento y construcción de los plásmidos fueron Escherichia coli DH5α (Difco BRL, France), y HB101 (Stratagene, France); éstas se cultivaron en medio Luria–Bertani suplementado con ampicilina (100 mg/1) a 37°C de 16 a 24 h según los requerimientos.

Cepas fúngicas. Se empleó la cepa isogénica P01a (MatA, ura3–302, leu2–270), obtenida de la colección del laboratorio del Dr. Gaillardin (Institute National de la Recherche Agronomique, Paris–Grignon, France); además de tres cepas mutantes interrumpidas por un minitransposon (mTnYl1) (Neuvéglise et al., 1998) derivadas de la cepa parental P01a (P01aFil) denominadas Fil209, Fil246 y Fil354 (Richard et al., 2001), las cuales poseen en sus extremos dos secuencias Lox (P1 y R1). Dichas cepas fueron multiplicadas en medio YPD (Barth y Gaillardin, 1996), y en medio YNB w/o aa (1.7 g/l de Yeast Nitrogen Base sin aminoácidos, 5 g/l de sulfato de amonio; Difco, France) adicionado uracilo (50 mg/ml) o leucina (50 mg/ml) cuando se requirió.

Técnicas genéticas. Se emplearon técnicas básicas de biología molecular (Sambrook et al., 1989). Las enzimas de restricción y enzimas de amplificación fueron suministradas por la compañía Invitrogen (France), o New England Biolabs (France). El DNA genómico de las levaduras se aisló y purificó siguiendo el protocolo descrito por Hoffman y Winston (1987). Un termociclador Perkin–Elmer Thermal Cycler 9600 fue utilizado para llevar a cabo las reacciones de amplificación bajo las siguientes condiciones: 2 min a 94°C, seguido por 10 ciclos de 10 s a 94°C, 30 s a 56°C, y 10 min a 68°C; 20 ciclos de 10 s a 94°C, 30 s a 56°C, y 10 min a 68°C con 15 s de rampa en cada ciclo, y un paso de extensión final de 15 min at 68°C utilizando la enzima Expand Long Template PCR system (Roche). La secuenciación de los segmentos fue realizada en un equipo ABI 373 DNA Sequencer siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante. Para el análisis de las secuencias se emplearon los paquetes bioinformáticos: GCG package (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison) y Lasergen (DNAstar v.o 7.0).

Construcción del plásmido que expresa la recombinasa Cre. El vector de expresión de la recombinasa Cre fue construido como sigue: El promotor del gen XPR2 contenido en el plásmido pINA 1269 fue recuperado por restricción con las enzimas Kpn1 y Sal1 y se ligó al plásmido replicativo pINA1053 cuyo marcador es YlLEU, el cual previamente había sido digerido con las enzimas Kpn1 y Sal1 para dar origen al plásmido pRRQ1; por otro lado, el gen de la recombinasa Cre contenido en el plásmido pSH47 (proporcionado por J. H. Hegemann) fue obtenido por restricción con las enzimas Kpn1 y Sma1 y fue ligado directamente dentro del plásmido pRRQ1 previamente digerido con Kpn 1 y Pml1 generando el plásmido pRRQ2 que conserva el marcador de auxotrofía a leucina (Figura 1).

Transformación de las levaduras. Las levaduras (P01a, Fil209, Fil246 y Fil354) fueron sujetas a un ensayo de transformación por electroporación con el plásmido replicativo pRRQ2 y pRRQ1 como control negativo (Vector sin Cre, Figura 1). La preparación de las células electrocompetentes, se hizo conforme a lo establecido por Becker y Guarente (1991), donde 50 µl de células competentes fueron mezcladas suavemente con 500 ng del plásmido pRRQ2 y trasferidas a un electroporador (Jouan GHT 1287). Se aplicó un pulso eléctrico de 1.5 kV, 200 Ω. y capacitancia de 25 µF. Después del choque eléctrico, 1 ml de YPD suplementado con 1 M de sorbitol se adicionó a la suspensión celular y se mezcló suavemente, posteriormente se distribuyó en una placa con medio de cultivo YNB sin aminoácidos y adicionado de uracilo. Se recuperaron 100 transformantes de cada cepa, se multiplicaron en el medio YNB adicionado de uracilo y se almacenaron a –80 °C.

Análisis de las transformantes. Para la actividad Cre, se estudiaron las transformantes primeramente por auxotrofía a uracilo y posteriormente a 5 clonas de cada trasformación se analizaron por PCR, amplificando un segmento blanco limitado por un par de oligonucleótidos específicos, diseñados hacia las zonas que flanquean el sitio donde el mTnYl1 estaba insertado en el genoma (Tabla 1, Figura 2). El análisis consistió en comparar el tamaño del segmento amplificado, entre la cepa parental (P01a), la mutante (Fil) y la mutante transformada con Cre (FilCre). En un estudio previo, Richard et al., (2001), reportaron que existe una diferencia de tamaños entre la cepa parental y la mutante de aproximadamente 4.5 Kb que corresponde al tamaño del mini transposón utilizado (Figura 2). El segmento amplificado en la mutante Fil después de la acción de Cre, fue sujeto a secuenciación para confirmar la correcta acción de la recombinasa Cre del fago P1 dentro de Y. lipolytica.

 

Resultados

Se construyó el plásmido replicativo pRRQ2 (Figura 1), el cual porta el gen de la recombinasa Cre bajo un promotor híbrido de Y. lipolytica (XPR2), este es un promotor que dirige la expresión génica de manera fuerte (Madzak et al., 2004). La construcción del plásmido se verificó por análisis de restricción (dato no mostrado).

Después de la transformación de las diferentes cepas (P01a, Fil209, Fil246 y Fil354) con el plásmido pRRQ2, se recuperaron numerosas clonas seleccionadas en placas de YNB sin aminoácidos y suplementadas con uracilo, debido a que si Cre tuvo acción, escinde la mayor parte del mTnYl1 incluyendo el gen marcador YlURA3 como se puede ver en la Figura 2. De las transformantes seleccionadas de cada cepa (100 clonas), se hicieron réplicas en medio YNB sin aminoácidos adicionadas de uracilo, en todos los casos las clonas fueron capaces de crecer (100%); en replicas en medio YNB sin aminoácidos el crecimiento de las transformantes Fil fue como máximo del 10%, a diferencia del control negativo correspondiente a donde el crecimiento siguió siendo del 100%; en las células transformantes de la cepa parental, el crecimiento fue negativo (0%), esto indica que la recombinasa Cre había ejercido su actividad en un porcentaje igual o superior al 90%, en la Tabla 2 se resumen los datos. Dichas transformantes se denominaron: P01aCre, 209Cre, 246Cre y 354Cre según su origen (P01aFilCre).

Las cepas que fueron auxótrofas a uracilo por la actividad de Cre fueron analizadas a través de PCR para valorar la actividad de recombinasa directamente sobre el DNA, en la Figura 3 se muestran los resultados de la amplificación, un caso tipo de cada una de las tres mutantes analizadas, se puede observar que la cepa parental y mutantes arrojan un producto de amplificación de tamaño similar al reportado (Richard et al., 2001), y que las transformantes sujetas a la actividad de Cre generaron un fragmento de 300 pb por encima del que corresponde a la cepa parental y que es del tamaño aproximado esperado (Tabla 1). Esto, sugiere que la auxotrofía a uracilo mostrada en las mutantes transformadas con el plásmido pRRQ2 era debida a la acción correcta de la recombinasa Cre. Los segmentos de amplificación por PCR de las cepas Fil209Cre, Fil246Cre y Fil354Cre fueron secuenciados; en el análisis de las secuencias, se identifica el sitio exacto de inserción del mTnYl1 dentro del gen interrumpido, los repetidos invertidos del mTnYl1 y una huella del sitio lox que para los casos analizados siempre fue el sitio R1 presente originalmente en el mTnYl1 (Figura 4), este segmento adicional es de 310 pb exactamente, que es la diferencia de tamaño observado entre la cepa parental y las mutantes tratadas con la recombinasa (Figura 3, Tabla 1), confirmándose la expresión y función correcta de la recombinasa Cre del fago P1 en Y. lipolytica.

 

Discusión

Yarrowia lipolytica es un excelente modelo de estudio, la generación de herramientas moleculares han contribuido fuertemente al avance en el conocimiento de este organismo, aun así, nuevas estrategias que permitan disminuir el tiempo que consumen los análisis son necesarias, uno de los principales retos en las nuevas investigaciones.

En este trabajo, se comprueba nuevamente la habilidad y potencial biológico que tiene Y. lipolytica para expresar proteínas heterólogas (Madzak et al., 2004), cuya fuente ha sido muy diversa, como de plantas (Kopecny et al., 2005), de animales (Hamsa et al., 1998), de levaduras (Förster et al., 2007) entre otros; pero en este caso, la expresión de una proteína de origen viral como es la recombinasa del fago P1 y que además mostró actividad y funcionalidad dentro de la misma levadura.

La expresión de la proteína Cre, se ha realizado en diversos sistemas biológicos con la principal aplicación de remover el DNA flanqueado por los sitios LoxPl, estos sitios y debido a que son idénticos llega a ocurrir recombinación espontánea entre ellos, por lo cual diferentes estrategias se han realizado, una de ellas es modificar los sitios Zox. La recombinación entre los sitios LoxPl y LoxRl vía la recombinasa Cre ya había sido descrita para el caso de Saccharomyces cerevisiae (Ross–Macdonald et al., 1997), a donde reportan que existe un 90% de escisión vía la actividad de la recombinasa Cre, y registran menos del 1% de escisión en condiciones de no inducción, es decir, la que ocurre sin mediación de la recombinasa (de manera espontánea). Para este caso, la actividad de Cre fue valorada según su marcador de auxotrofía (uracilo); los valores de escisión fueron superiores al 90%, similares a los indicados para S. cerevisiae, la escisión espontánea no fue evaluada, pero muy probablemente es inferior al 1% debido a que no fue evidenciada durante los análisis a las que fueron sujetas estas mutantes (Richard et al., 2001), característica deseable cuando se generan mutantes de cualquier tipo; esta estabilidad en las mutantes fue obtenida por la combinación de los sitios Lox utilizados, el original LoxP1 y un sitio modificado denominado LoxR1, sitios en los cuales se ha demostrado que la frecuencia de recombinación espontánea entre ellos es mínima, pero que permanece el sitio de reconocimiento por parte de la recombinasa (Sternberg et al., 1981 ; Siegel et al., 2004). Por otro lado, y debido a que no existía evidencia experimental de que el sistema cre–loxP funcionaría en Y. lipolytica, se utilizó en principio un sistema de expresión fuerte y en un plásmido de replicación autónoma, permitiendo que la recombinasa Cre estuviese expresada continuamente por la naturaleza del promotor constitutivo de la exoproteasa alcalina XPR2 (Madzak et al., 2000). Bajo este primer acercamiento, ahora es posible diseñar herramientas moleculares que permitan dirigir la expresión de la proteína Cre bajo situaciones específicas tanto de tiempo y/o de espacio en Y. lipolytica, de manera similar a como ha ocurrido actualmente en otros sistemas, como en maíz (Wang et al., 2005), tabaco (Kopertekh et al., 2010) o ratón (Madisen et al., 2010).

Cuando se desea la integración o alteración de diferentes genes en un organismo, es necesario la incorporación de diferentes marcadores de selección, entre ellos los marcadores de auxotrofía como URA3, LEU2, HIS3, etc., y estos son preferidos sobre los marcadores de resistencia por la eficiencia de transformación (Kaneko et al., 2009); el número de marcadores de selección existentes limitan los análisis, por tanto surge la necesidad de reciclarlos; o también si es el caso, eliminarlos de los organismos, sobre todo en aquellos que participan en procesos industriales, de tal manera de introducir la menor cantidad de DNA exógeno a los sistemas (Ribeiro et al., 2007). La estrategia que aquí se describe, por un lado permite reciclar el marcador de selección y por otro, según el diseño de la estrategia puede eliminar en gran medida el DNA exógeno que se introduce a dicho organismo y de esta manera distorsionar lo menos posible el sistema en cuestión. La metodología es simple pero se presenta como una poderosa herramienta de biología molecular para realizar múltiples manipulaciones en ingeniería genética durante el estudio, manipulación o aplicación de Y. lipolytica bajo la selección y utilización de un solo marcador.

 

Agradecimientos

Se agradece al laboratorio CBAI del INAP–G donde se realizaron los estudios, así también a A. Lepingle y A. Auger, personal que realizó la secuenciación de los segmentos en el mismo departamento. Al Dr. N. Mayek–Pérez por sus valiosas aportaciones. A los revisores anónimos por sus atinadas críticas y sugerencias. R. R. Q. fue becario CONACyT, México y de la C. E. E. programa alfa (grant 5.0118.9).

 

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