INTRODUCCIÓN

La acuicultura ha sido el sistema de producción de alimentos de más rápido crecimiento en el mundo. En particular, el cultivo de camarón representa una de las actividades acuícolas más importantes y se ha establecido como un importante promotor socioeconómico (^{Ahmed y Thompson 2019}). Las condiciones de cultivo de camarón permiten el rápido crecimiento de bacterias oportunistas, como lo son muchas especies de Vibrio, que habitan naturalmente en las aguas costeras y estuarinas, en los sedimentos y como parte de la microbiota de los organismos cultivados (en las branquias, el intestino, el hepatopáncreas y la cutícula de camarón) (^{Jiravanichpaisal et al. 1994}). En general, estas especies no representan ningún riesgo para la producción de camarón (^{Gómez-Jiménez et al. 2005}). Sin embargo, la intensificación de los sistemas de producción aumenta el estrés de los organismos y conduce a la eutrofización del agua; esto promueve la proliferación de estas bacterias oportunistas que pueden colonizar el sistema digestivo y causar enfermedades en los animales cultivados (^{Johnson 2013}, ^{Engle et al. 2017}).

Debido a su alta incidencia en la acuicultura de camarón, las pérdidas más importantes debidas a bacterias patógenas están relacionadas con especies de Vibrio, cuyas infecciones se conocen generalmente como vibriosis (^{Flegel 2012}, ^{de Souza-Valente y Wan 2021}). Inicialmente, esta infección puede limitarse a tejidos específicos; sin embargo, en organismos con el sistema inmune comprometido, se convierte rápidamente en una enfermedad sistémica que puede causar la muerte (^{Jiravanichpaisal et al. 1994}, ^{Gómez-Jiménez et al. 2005}).

Vibrio parahaemolyticus es un patógeno que infecta los cultivos de Penaeus vannamei, causando eventos de mortalidad por vibriosis (^{Hong et al. 2016}, ^{Raja et al. 2017}) y la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (NHPA) (^{Han et al. 2015}). La NHPA es una enfermedad emergente caracterizada por una alta tasa de mortalidad, la cual en algunos casos alcanza el 100% de la población de camarones en brotes en estanques durante los primeros 30 días tras su aparición (de Schryver et al. 2013). Identificar los signos de la enfermedad en una etapa temprana, que en algunos casos es asintomática, es crucial para poder aplicar un tratamiento oportuno y contrarrestar su avance. Sin embargo, en condiciones de producción, esta situación se complica porque ciertos signos pueden corresponder no solo a condiciones de enfermedad sino también a comportamientos típicos de crecimiento o estrés (^{Egan y Gardiner 2016}). ^{Egan y Gardiner (2016)} propusieron que muchas enfermedades en sistemas marinos (poblaciones naturales y cultivadas) deben estudiarse desde el punto de vista de la disbiosis microbiana (un cambio en la comunidad microbiana que tiene un impacto negativo en el hospedero), similar a lo que se ha demostrado en varias enfermedades crónicas humanas (^{Vijay y Valdés 2022}). Los factores de estrés ambiental y el debilitamiento del sistema de defensa del hospedador pueden conducir a la proliferación de patógenos oportunistas del entorno que promueven el desarrollo de la enfermedad.

Actualmente, una de las herramientas más eficaces y precisas para el análisis de la comunidad microbiana aplicada al sector acuícola es el análisis metagenómico. La metagenómica es una herramienta emergente en acuicultura que ayuda a comprender la relación entre el hospedero, la microbiota y los patógenos mediante el seguimiento de la dinámica de la diversidad microbiana en los sistemas de producción (^{Tello et al. 2019}). Aunque se sabe que la NHPA es causada por el patógeno V. parahaemolyticus y otras especies de Vibrio que albergan el gen de la toxina binaria PirAB, las alteraciones del microbioma en el tracto digestivo de P. vannamei durante los brotes de NHPA comenzaron a estudiarse recientemente (^{Chen et al. 2017}, ^{Cornejo-Granados et al. 2017}). En particular, el análisis de la estructura microbiana del tracto digestivo en camarones podría servir como diagnóstico oportuno de disbiosis antes de observar los signos macroscópicos de la NHPA. Esto permitiría implementar acciones de manejo oportunas y estar preparados, de ser necesario, para administrar un tratamiento posterior. Por ello, en el presente estudio se realizó un análisis metagenómico de la estructura de la comunidad microbiana del hepatopáncreas de P. vannamei tras un desafío con una cepa patógena de V. parahaemolyticus asociada a NHPA en condiciones controladas. Los resultados mostraron un cambio importante de la estructura de la comunidad microbiana en el hepatopáncreas de P. vannamei y constricciones en los túbulos hepatopancreáticos (un signo característico de la NHPA en etapas tempranas), antes de la manifestación visible de la enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

No se registró la muerte de ningún organismo en ninguno de los grupos experimentales en los 5 días posteriores al bioensayo, por lo que la tasa de supervivencia en este experimento fue del 100%. Además, los organismos no mostraron dificultades para nadar, letargo, intestino vacío ni hepatopáncreas pálido después de los tratamientos. Se realizó una preparación en fresco de los túbulos hepatopancreáticos de los camarones desafiados con las cepas de V. parahaemolyticus (CVP2) y E. coli (Eco) para determinar algunas alteraciones morfológicas presuntivas relacionadas con la NHPA. Como se esperaba, el CN no mostró alteraciones de los túbulos hepatopancreáticos (Fig. 1a). El tratamiento Eco no indujo alteraciones morfológicas ni comprometió la integridad de los túbulos hepatopancreáticos de P. vannamei (Fig. 1b). El grupo con el tratamiento con CVP2 mostró una constricción tubular hepatopancreática, la cual es una característica presuntiva de la fase aguda de la NHPA (Fig. 1c).

Figura 1 Preparación en fresco de los túbulos hepatopancreáticos de Penaeus vannamei. Túbulos hepatopancreáticos de (a) organismos sin tratamiento (NC) y (b) organismos desafiados con la cepa Escherichia coli DH5α (Eco). (c) Constricción de los túbulos hepatopancreáticos (resaltada con flechas) de organismos desafiados con la cepa de Vibrio parahaemolyticus CVP2 (CVP2). Aumento 100×. 

Como primera aproximación para evaluar la carga de la cepa CVP2 en el hepatopáncreas de los camarones tras el desafío, las UFC de este órgano se estimaron utilizando un medio selectivo (TCBS) para el género Vibrio. Los resultados mostraron un aumento significativo (P = 0.0004438) en la carga de CVP2 de más de un orden de magnitud (>10 veces), en comparación con el CN (Fig. 2).

Figura 2 Estimación de la carga de Vibrio parahaemolyticus expresada como unidades formadoras de colonia (CFU) por hepatopáncreas, a partir de organismos desafiados con la cepa CVP2 de V. parahaemolyticus y de organismos no desafiados (control negativo [NC]). Los resultados se representan como media ± desviación estándar. La significancia estadística se determinó mediante una prueba t de Student no pareada de 2 colas (***, P < 0.001). 

Para inferir si los diferentes tratamientos afectaron a las estructuras de la comunidad bacteriana del hepatopáncreas, se realizó la secuenciación de nueva generación (SNG), junto con el análisis exploratorio metagenómico del ADNr 16S. Las comunidades bacterianas en los hepatopáncreas con los tratamientos CVP2 y Eco mostraron una estructura marcada y característica, dominada por un género en particular (Fig. 3a). En la muestra de los hepatopáncreas con CVP2 predominó el género Vibrio. En la muestra de los hepatopáncreas con Eco predominaron los géneros Acinetobacter y “Candidatus Pelagibacter”. La muestra de los hepatopáncreas en el CN mostró una diversidad más rica y mayor que la observada en la muestra de los hepatopáncreas con CVP2 y Eco: Roseibacillus, Lewinella, Pseudoalteromonas, Vibrio, Algoriphagus y Formosa se encontraron entre los géneros más abundantes sin una dominancia obvia para ningún género en particular (Fig. 3a). Para apoyar nuestras observaciones, se realizaron estimaciones de diversidad alfa para las muestras CVP2, Eco y CN. La estimación de la riqueza (índice de Shannon) reveló que la muestra CN tuvo la mayor riqueza bacteriana y la muestra CVP2 la menor; esto se relacionó con la dominancia del género Vibrio en la muestra CVP2 (Tabla 1, Fig. 3a). Resultó interesante que los índices de diversidad alfa mostraron un rango estrecho para las UTO observadas e incluso una similitud estrecha entre las muestras CVP2 y CN (índice de Chao1; Tabla 1). El índice de Simpson reveló que todas las muestras eran uniformes y que estaban compuestas mayoritariamente por organismos bacterianos; el índice de cobertura de Good mostró que la cobertura de secuencias de todas las muestras se realizó correctamente (>99%; Tabla 1). La prueba de Kruskal-Wallis mostró que los tratamientos ejercieron un efecto significativo (P = 0.0002927) sobre la distribución de la estructura de la comunidad bacteriana. Además, el ACP mostró que no hubo ninguna agrupación entre todas las muestras; estas se localizaron en un cuadrante diferente en el gráfico del ACP (Fig. 3b). El APC coincidió con la determinación de las estructuras de la comunidad bacteriana (Fig. 3a), las estimaciones de la diversidad alfa (Tabla 1) y los resultados de la prueba de Kruskal-Wallis.

Figura 3 Análisis metagenómico mediante la secuenciación del gen de ADNr 16S (región V4) del hepatopáncreas de camarones desafiados con la cepa de Vibrio parahaemolyticus CVP2. (a) Estructuras de las comunidades bacterianas del hepatopáncreas de camarón comparadas entre tratamientos (CVP2, Eco y NC) al nivel taxonómico de género. (b) Análisis de componentes principales de las estructuras de las comunidades bacterianas entre tratamientos: V. parahaemolyticus (CVP2), Escherichia coli (Eco) y organismos sin tratamiento (NC). 

DISCUSIÓN

En camarones sanos, se ha demostrado que las bacterias residen en diferentes órganos internos, incluso en el sistema circulatorio, durante unos minutos u horas. Por lo tanto, frecuentemente se encuentran bacterias en cantidades de hasta 1 × 10³ UFC·mL^-1 en la hemolinfa de organismos sanos (Gómez-Gil et al. 2016). En Asia y América, varias especies bacterianas se asocian con enfermedades del camarón blanco. Sin embargo, el papel de Vibrio no se ha demostrado como un agente primario y se considera un patógeno secundario u oportunista (^{Flores-Miranda et al. 2012}). Las especies de Vibrio se consideran un componente de la microbiota normal en los organismos de cultivo. Sin embargo, bajo condiciones de estrés o manejo deficiente en los sistemas de producción, las especies de Vibrio han generado problemas críticos relacionados con la aparición de enfermedades asociadas (^{Peña-Navarro y Varela-Mejías 2015}, ^{de Souza-Valente y Wan 2021}).

Bajo las condiciones experimentales del presente estudio, demostramos los signos presuntivos de la NHPA, con las alteraciones morfológicas distintivas en el hepatopáncreas de camarón (Fig. 1c) que se relacionan directamente con esta enfermedad, tal como fue reportado previamente por ^{Peña-Navarro y Varela-Mejías (2015)}. Para determinar el impacto del desafío con la cepa CVP2 en el hepatopáncreas de P. vannamei, se estimó la carga de V. parahaemolyticus (UFC·hepatopáncreas^-1) utilizando TCBS. Estos resultados, junto con el análisis metagenómico, mostraron la misma tendencia tanto para las UFC por hepatopáncreas como para las lecturas del género Vibrio por muestra, con una diferencia de más de un orden de magnitud (>10 veces) para el tratamiento CVP2 en comparación con el CN (Figs. 2, 3a). Sin embargo, cabe destacar que, a través del análisis metagenómico, determinamos que las especies relacionadas con Vibrio no estuvieron presentes en el tratamiento Eco. Por otro lado, las especies relacionadas con el género Escherichia estaban presentes en el hepatopáncreas con recuentos de lecturas extremadamente bajos (solo 4 lecturas). El enfoque de utilizar un medio selectivo, como el TCBS, y estimar las UFC por hepatopáncreas es restringido para la detección de especies de Vibrio. Esto nos permitió determinar si efectivamente se había producido un aumento en la carga de V. parahaemolyticus (colonias verdes), con respecto al control negativo (CN). Sin embargo, se necesita más información para determinar una disbiosis, ya que los datos sobre la proporción de especies de Vibrio en la microbiota son nulos.

Se evaluó el efecto del desafío con la cepa CVP2 en la estructura de la comunidad microbiana del hepatopáncreas de P. vannamei, mediante un enfoque de análisis exploratorio metagenómico. Las comunidades bacterianas del hepatopáncreas del camarón experimentaron un cambio drástico en todos los organismos suplementados en la dieta con una bacteria específica (CVP2 o Eco). El género Vibrio dominó las muestras de los hepatopáncreas de los organismos desafiados con CVP2. En la muestra de Eco predominaron los géneros Acinetobacter y “Candidatus Pelagibacter”, lo que demuestra el impacto ejercido por E. coli, que se introdujo en la microbiota del hepatopáncreas y estimuló la proliferación de otros géneros.

Las estructuras de la comunidad bacteriana en varios órganos de camarones (P. vannamei, Penaeus monodon y Litopenaeus stylirostris) se encuentran en un delicado equilibrio que se modifica fácilmente por el desarrollo y estado de salud del camarón (^{Rungrassamee et al. 2013}, ^{Cardona et al. 2016}, ^{Chen et al. 2017}, ^{Cornejo-Granados et al. 2017}). La caracterización de la microbiota de un organismo es crucial para comprender las interacciones y relaciones entre el hospedero y sus microorganismos colonizadores (^{Gao et al. 2019}).

En conjunto, los datos del presente estudio mostraron una alteración de la estructura de la microbiota en el hepatopáncreas del camarón blanco (P. vannamei) inoculado mediante la alimentación con la cepa CVP2 de V. parahaemolyticus, la cual se asocia con NHPA. Estos resultados, obtenidos en condiciones controladas, concuerdan con estudios de campo durante brotes de NHPA que describen un enriquecimiento en el tracto digestivo de especies del orden Vibrionales que a su vez provoca cambios en la abundancia relativa en la comunidad bacteriana, específicamente, una simplificación de la diversidad microbiana (reducción del índice de Shannon) (^{Chen et al. 2017}, ^{Dong et al. 2021}).

Por otro lado, aunque no se observaron signos de enfermedad a nivel macroscópico ni mortalidad durante el periodo de evaluación, a nivel microscópico la morfología de los túbulos hepatopancreáticos cambió en los organismos desafiados (Fig. 1). Este cambio es un signo característico observado en los organismos infectados con cepas asociadas a NHPA (^{Carrillo-Méndez et al. 2019}).

El presente estudio proporciona información sobre el desequilibrio de la microbiota del hepatopáncreas de P. vannamei tras un desafío con una cepa de V. parahaemolyticus asociada a NHPA en condiciones experimentales. Los resultados muestran una disbiosis de la microbiota del hepatopáncreas y alteraciones en este órgano antes de la manifestación visible de la enfermedad. Se necesitan más estudios para establecer la línea base de lo que es una estructura microbiana saludable del tracto digestivo del camarón en condiciones de cultivo para discriminar qué magnitud del cambio en la estructura microbiana sería un indicador de disbiosis.