INTRODUCCIÓN

Se estima que sólo el 10% de la producción acuícola mundial está asociada a programas de mejoramiento genético, por lo que existe un alto potencial para el incremento de la producción a través de esta metodología (^{Gjedrem et al. 2012}). El camarón blanco, Litopenaeus vannamei, es una de las especies para la cual existe un esfuerzo creciente en la instrumentación de programas de selección genética (^{Andriantahina et al. 2013}). Ésta es la especie más importante en la acuacultura de camarones marinos en el mundo, ya que contribuye con más del 71% del total del volumen de producción (^{FAO 2014}).

Rastrear el pedigrí en los núcleos genéticos es necesario para la estimación de parámetros genéticos como la heredabilidad, la interacción entre genotipo y ambiente (G × A) y la endogamia (^{Gjedrem 2010}). Además, la determinación de las relaciones de parentesco entre reproductores es útil para el diseño de las cruzas que minimicen la pérdida de diversidad genética y el incremento de la endogamia y maximicen la productividad de la siguiente generación (^{Gjedrem 2010}).

La rastreabilidad del pedigrí en los programas de mejoramiento genético se lleva a cabo mediante la crianza de familias por separado y/o mediante el marcaje físico con elastómeros de color. Sin embargo, dado que esta estrategia tiene limitaciones respecto a la identificación individual de los ejemplares y la asignación de parentesco, el marcaje genético se ha sugerido como una alternativa (^{Gjedrem 2010}). ^{Yue y Xia (2014)} resumen varias consideraciones prácticas para este tipo de análisis particularizando en microsatélites y polimorfismos de nucleótido sencillo (SNP).

La factibilidad de los microsatélites para el análisis de parentesco se ha estudiado en algunas especies de camarón, tales como Marsupenaeus japonicus (^{Jerry et al. 2004}), Penaeus monodon (^{Jerry et al. 2006}) y Fenneropenaeus chinensis (^{Dong et al. 2006}). Sin embargo, se ha reportado que 10% o más de los ejemplares no son asignados adecuadamente a sus padres putativos (^{Jerry et al. 2004}, ^{Dong et al. 2006}, ^{Jerry et al. 2006}). El índice de falta de asignaciones con el uso de microsatélites ha sido también reportado para peces (e.g., ^{Perez-Enriquez et al. 1999}, ^{Christie et al. 2010}).

Con el desarrollo de la secuenciación masiva de nueva generación, se abrió la posibilidad de utilizar los SNP en estudios de parentesco. ^{Lapègue et al. (2014)} utilizaron marcadores SNP para identificar el pedigrí de 2 especies de ostión cultivado y sugirieron utilizar un panel de al menos 150 SNP para poder identificar el parentesco de más del 95% de la progenie. Para el camarón tigre, P. monodon, Sellars et al. (2013) obtuvieron asignaciones adecuadas con paneles de 56 y 63 SNP. En salmón, se ha demostrado que con 60 loci de SNP es posible diferenciar genéticamente entre salmón silvestre y salmón de cultivo (^{Karlsson et al. 2011}).

En el camarón blanco, L. vannamei, los marcadores genéticos se han utilizado principalmente para la caracterización de la diversidad y composición genética de poblaciones silvestres o lotes de cultivo (^{Cruz et al. 2004}, ^{Freitas y Galetti 2005}, ^{Perez-Enriquez et al. 2009}, ^{Vela-Avitúa et al. 2013}). Son limitados los estudios dirigidos a la identificación individual o asignación de parentesco de individuos cultivados (Perez-Enriquez R, datos no publicados; Perez F com. pers.). El objetivo de este trabajo fue probar y comparar el desempeño de 2 paneles de marcadores genéticos (microsatélites y SNP) para rastrear el pedigrí en una población de camarón blanco de cultivo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de los genotipos

El ADN se obtuvo de los pleópodos utilizando el Wizard SV 96 Genomic DNA Purification System (A2371, Promega). Se obtuvieron perfiles genéticos individuales con los microsatélites y SNP. Se utilizó un lote de 5 microsatélites previamente publicados: Pvan1758 y Pvan1815 (^{Cruz et al. 2002}), Lvan05 (^{Perez-Enriquez et al. 2009}) y TumxLv8.256 y TumxLv10.312 (^{Meehan et al. 2003}). Los microsatélites Pvan1758, Lvan05 y TumxLv8.26 se amplificaron mediante PCR en un volumen de reacción final de 11 µL (1 µL de ADN a 10-95 ng µL^-1, amortiguador 1×, 3.5 mM de MgCl₂, 0.25 mM de dNTP, 0.39 µM de cada iniciador sentido y antisentido, 0.025 U µL^-1 de Taq polimerasa) bajo las condiciones reportadas por los respectivos autores. Para el locus Pvan1815, se utilizó un protocolo de descenso gradual de temperatura (95 ºC por 3 min, 30 ciclos a 94 ºC por 45 s, temperatura de acoplamiento por 45 s [iniciando en 60 ºC y disminuyendo cada ciclo 0.3 ºC hasta alcanzar 51 ºC], 65 ºC por 1 min y extensión final a 65 ºC por 20 min). Para el locus TumxLv10.312, se utilizó el protocolo modificado de ^{Yoshiday y Awaji (2000)} (94 ºC por 2 min; 5 ciclos a 94 ºC por 5 s, 60 ºC por 1 min y 72 ºC por 1 min; 20 ciclos a 94 ºC por 1 s, 60 ºC por 1 min y 72 ºC por 1 min; y extensión final a 72 ºC por 10 min). Además, se utilizó un lote adicional de 5 loci (Livan04, Livan13, Livan44, Livan51, Livan60; Tabla 1), para los cuales se usaron 1.5 mM de MgCl₂ y la misma cantidad de los otros componentes mencionados arriba con las condiciones de amplificación siguientes: 95 ºC por 3 min; 30 ciclos a 94 ºC por 35 s, 57 ºC por 40 s y 72 ºC por 40 s; y extensión final a 72 ºC por 5 min. Los productos de la PCR fueron analizados en un secuenciador (ABI3130, Applied Biosystems). Los genotipos se obtuvieron con el programa GeneMapper 4.0.

Los genotipos de SNP de un panel de 76 loci se obtuvieron en el Center for Aquaculture Technologies (San Diego, California, http://aquatechcenter.com/) utilizando ensayos de PCR específicos para cada alelo en una plataforma instrumental EP1 (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA). Los genotipos se analizaron en un archivo Excel.

Tabla 1 Secuencias de los iniciadores de microsatélites de Litopenaeus vannamei. 

RESULTADOS

De los 192 individuos de la progenie analizados, se obtuvieron lecturas completas de 168 con los microsatélites (87.5%) y 186 con los SNP (96.9%). Los individuos con genotipos incompletos no se consideraron para los análisis de parentesco.

Los valores de diversidad genética (número de alelos por locus, heterocigosidad) fueron mayores con los microsatélites que con los SNP; sin embargo, la probabilidad de no exclusión fue 3 órdenes de magnitud más potente (i.e., un valor de probabilidad más bajo) con los SNP (Tabla 2). Esta característica se reflejó en un porcentaje mayor de asignación de paternidad al utilizar el panel de SNP con los 2 métodos de exclusión (directa y probabilística), tanto en la simulación como con los datos reales (Tabla 2). El uso del panel de 76 SNP resultó en una asignación de 94% a 96% de la progenie a una pareja única de padres, ampliamente mayor que lo obtenido con los microsatélites. Cabe mencionar que el 4-6% restante no se refiere a ejemplares con asignaciones múltiples, sino a una falta de asignación, lo que indica que probablemente esos ejemplares pertenecen a otros lotes de desove. Se detectaron alelos nulos en 3 loci (Lvan05, Livan13 y Livan60), que pueden explicar la reducida proporción de asignaciones con estos marcadores.

Tabla 2 Valores promedio de diversidad genética (desviación estándar en paréntesis), probabilidad de identidad, probabilidad combinada de no exclusión de ambos padres y porcentaje de asignaciones de parentesco de la progenie (datos simulados y reales) obtenidos con los paneles de microsatélites y SNP por exclusión directa y probabilística. 

Las curvas de rarefacción indican que las pruebas de paternidad por exclusión directa usando 50 loci alcanzaron un 100% de asignaciones cuando el 60% de los loci tuvieron una FAM ≥ 0.3, y entre 98.3% y 99.4% de asignaciones para las proporciones de FAM ≥ 0.3 de 20%, 40% y 50% (Fig. 1). Las asignaciones probabilisticas con 50 loci alcanzaron el 100% en 3 proporciones de FAM ≥ 0.3 (40%, 50% y 60%; Fig. 1).

Figura 1 Curvas de rarefacción de las asignaciones de parentesco con el panel de SNP por exclusión directa (programa Vitassign) y exclusión probabilística (programa Cervus), de acuerdo con la proporción de loci con frecuencia alélica mínima (MAF) ≥ 0.3. 

Considerando 50 loci como el número mínimo para un análisis de asignación de paternidad, el error estimado (la diferencia en las parejas de padres obtenidas entre métodos) mostró una tendencia de disminución del error en función de la proporción de loci con FAM ≥ 0.3, y la proporción del 60% fue la proporción con la que se obtuvo el valor más bajo (2.3%; Fig. 2).

Figure 2 Porcentaje de error de asignación mediante el análisis probabilístico con 50 loci, en función de la proporción de loci con frecuencia alélica mínima (MAF) ≥ 0.3. 

DISCUSIÓN

Éste es el primer trabajo del conocimiento de los autores acerca de la utilidad de un panel de SNP en L. vannamei. Se demostró que la utilización del panel de 76 SNP es adecuado para la identificación de la genealogía o pedigrí del camarón blanco de cultivo. A pesar de una menor variabilidad en comparación con los microsatélites, el panel de SNP presenta mayor certidumbre en las asignaciones de parentesco. La menor resolución de los microsatélites en comparación con los SNP ha sido descrita también para otras especies acuáticas como la tilapia (^{Trọng et al. 2013}) y el camarón tigre, P. monodon (^{Sellars et al. 2014}). Las diferencias estriban en errores de genotipificación como resultado de la presencia de alelos nulos, la supresión de alelos y las mutaciones, estas últimas derivadas de una relativa alta tasa de mutación de los microsatélites (^{Ellegren 2000}, ^{Pompanon et al. 2005}, ^{Trọnget al. 2013}, ^{Lapègue et al. 2014}). Sin embargo, de manera similar a lo reportado por ^{Trọng et al. (2013)}, la eliminación de loci con frecuencias elevadas de alelos nulos no contribuyó a incrementar la proporción de asignación.

El análisis de exclusión directa con un error permitido de genotipificación de los SNP del 2.6% (2 no coincidencias) resultó en más del 96% de la progenie con asignación a una sola pareja, lo cual brinda una alta certidumbre en la asignación. Este nivel de precisión requiere del conocimiento del plan de apareamiento bajo el cual se obtuvo la progenie, es decir, qué hembra fue fecundada por qué macho. Sin embargo, aun si se desconoce el plan de apareamiento, el uso del panel de SNP es factible ya que el análisis probabilístico es capaz de identificar las familias con un 95% de confianza y un error menor que 3%. ^{Trọng et al (2013)} obtuvieron niveles similares de asignación de parentesco con ambos métodos analíticos (exclusión directa y probabilística) para una población de cultivo de tilapia.

Aun cuando el número de loci del panel de SNP (76) es ligeramente mayor que el número utilizado por ^{Sellars et al. (2014)} para P. monodon (56 y 63 SNP), los resultados indican que al utilizar un panel con una proporción de loci con FAM ≥ 0.3 de 60%, 50 loci serían suficientes para obtener una asignación correcta para más del 98% de la progenie. Estos resultados difieren de lo obtenido por ^{Lapègue et al. (2014)} para ostras y ^{Trọng et al. (2013)} para tilapia, quienes utilizaron paneles de entre 122 y 384 loci. De hecho, ^{Lapègue et al. (2014)} recomiendan un mínimo de 150 loci con un FAM promedio de 0.3 para obtener una asignación suficientemente potente.

La probabilidad de asignación está en función de las frecuencias alélicas de la población (^{Kalinowski et al. 2007}); por lo tanto, los individuos emparentados dentro del lote de reproductores, los cuales comparten más alelos que individuos no emparentados, disminuirán la probabilidad de asignación correcta. En este sentido, ^{Trọng et al. (2013)} señalan que una de las razones de obtener una baja a moderada asignación en la población de tilapia que analizaron se debe a los altos niveles de parentesco entre individuos derivados de un programa de selección por talla por más de 8 generaciones. En el presente estudio, el lote se encontraba en la quinta generación de selección, para la cual la endogamia se ha mantenido en un nivel reducido de 1.1-2.4% (Perez-Enriquez et al., datos no publicados). Aunque esta baja endogamia pudiera no tener efecto en la precisión de asignación con los SNP, algunos microsatélites parecen haber sido afectados, ya que incrementó la frecuencia de alelos nulos. Cuando se realizan análisis de pedigrí es recomendable mantener registros adecuados del manejo histórico del lote de reproductores.

La certidumbre en la asignación de pedigrí con SNP abre posibilidades para realizar estimaciones de heredabilidad, interacción G × A y manejo reproductivo en condiciones de cultivo en ambientes comunes y bajo condiciones en las cuales el marcaje físico es inadecuado o ineficiente. Con las plataformas de análisis de este estudio, el uso de SNP en camarón se sugiere como alternativa de mayor beneficio- costo (costo por muestra, tasa de genotipificación, tiempo de análisis) que los microsatélites.