Introducción

La cabrilla arenera, Paralabrax maculatofasciatus, es una especie potencial para la acuicultura a lo largo de la costa noroccidental de México. Es una hermafrodita ginogenética. En nuestro laboratorio se han abordado varios aspectos relacionados con el cultivo de esta especie, incluyendo el cultivo de larvas (^{Álvarez-González et al. 2000}), la nutrición de juveniles (^{Álvarez-González et al. 2001}) y su engorde en jaulas marinas (^{Grayeb-del Alamo 2001}). No obstante, esta especie llega a la maduración sexual antes de alcanzar la talla comercial (datos no publicados). Esto se considera un grave problema ya que la madurez sexual se relaciona, en muchas especies, con una disminución de la tasa de crecimiento y supervivencia (^{Felip et al. 2001}, ^{Piferrer et al. 2009}).

La inducción de la triploidía es la técnica de manipulación cromosómica más usada cuando el objetivo es producir peces estériles para la acuicultura (^{Piferrer et al. 2009}). La triploidía se logra forzando la retención del segundo cuerpo polar poco después de la fecundación, mediante uno de varios métodos, como choque térmico (frío o caliente) y presión hidrostática (^{Dunham 2004}). La mayoría de los estudios de manipulación cromosómica se han enfocado en encontrar la combinación correcta de las variables para inducir la triploidía y en examinar el crecimiento de individuos triploides durante las etapas juvenil y adulta, la dinámica hematológica, el rendimiento en condiciones de estrés y el desarrollo gonádico (^{Piferrer et al. 2000}, ^{Felip et al. 2001}, ^{Alcántar-Vázquez et al. 2008}). Por otro lado, la embriogénesis y la supervivencia durante el periodo larval de peces marinos triploides han recibido poca atención hasta la fecha.

Algunos estudios han registrado un aumento en el número de embriones muertos y bajos porcentajes de eclosión de larvas triploides (^{Piferrer et al. 2003}, ^{Peruzzi et al. 2007}); sin embargo, ninguno ha documentado cuáles son las alteraciones en el desarrollo embrionario que causan la mortalidad. La embriogénesis temprana consiste en una serie de divisiones mitóticas conocida como división celular. Cada división produce nuevas células llamadas blastómeros. Cuando los embriones contienen arreglos inusuales de blastómeros se considera que presentan 'división anormal'. Si la división celular anormal ocurre temprano en la embriogénesis puede ser detrimental (^{Avery y Brown 2005}). Una anomalía en uno o más blastómeros puede tener un mayor impacto en el desarrollo que una deformidad en 1 o 2 células más adelante (^{Kjørsvik et al. 1990}). Se han documentado correlaciones positivas entre las tasas de división normal temprana y el éxito de eclosión para diferentes especies (^{Kjørsvik et al. 2003}, ^{Rideout et al. 2004}, ^{Penney et al. 2006}). En general, poco se sabe de los efectos de la inducción de la triploidía sobre la división celular y cómo afecta el éxito de eclosión (^{Sultana 2005}).

Durante el cultivo de larvas, también se ha observado una mayor mortalidad de triploides que de diploides (^{Piferrer et al. 2003}, ^{Opstad et al. 2013}). Se han propuesto diversas explicaciones para explicar esta mortalidad temprana de larvas triploides, incluyendo el momento o la magnitud del tratamiento, la duración del tratamiento (^{Johnstone 1985}, ^{Piferrer et al. 2003}) y la recién adquirida condición triploide, que involucra la presencia de un tercer juego de cromosomas (^{Felip et al. 1997}, ^{Piferrer et al. 2000}).

En nuestro laboratorio se ha desarrollado un método de choque frío para inducir la triploidía en la cabrilla arenera (^{Alcántar-Vázquez et al. 2008}); sin embargo, el tratamiento de choque frío no siempre induce una triploidización del 100%. A los individuos que resultaron diploides a pesar de haber sido tratados con choque frío se les conoce como larvas diploides sometidas a choque frío. En un experimento previo con la cabrilla arenera, la proporción de triploides con respecto a diploides sometidos a choque frío fue 9:1 a la eclosión, pero después de 10 meses de cultivo, la proporción había cambiado a 1:3, lo que muestra que la tasa de mortalidad de las larvas triploides fue 27 veces mayor que la de las larvas diploides sometidas a choque frío (resultados no publicados). No se han documentado resultados similares para otras especies.

Los objetivos de este estudio fueron tratar de determinar algunas alteraciones en la embriogénesis de la cabrilla arenera que podrían explicar la alta mortalidad de triploides durante este periodo, así como determinar si se repetía el bajo porcentaje de triploidía en los juveniles de 10 meses y cuándo sucedía. Para esto, se realizaron 3 experimentos: en el experimento 1 se registró la ocurrencia de división celular anormal en embriones de la cabrilla arenera sometidos y no sometidos a choque frío, en el experimento 2 se examinaron las diferencias en el éxito de eclosión y la supervivencia temprana entre los embriones con divisiones celulares normales y anormales, y en el experimento 3 se evaluaron los porcentajes de triploidía durante el periodo larvario en desoves individuales (grupo control y grupo sometido a choque frío).

Materiales y métodos

Experimento 1: Efecto del tratamiento de choque frío sobre la división celular temprana

Se usaron desoves de 13 hembras: 7 en 2008 y 6 en 2009. Cada desove fue fertilizado con semen de 3 a 4 machos. Se dividieron los huevos fertilizados de cada hembra en 2 grupos: grupo control (2 réplicas) y grupo sometido a choque frío (3 réplicas). Después del tratamiento de choque frío, aproximadamente 50 huevos de este grupo y 50 huevos del grupo control fueron depositados en microplacas de 12 pozos (4 huevos por pozo) con agua de mar estéril. Se determinó la división celular normal o anormal bajo un microscopio óptico de disección. Como la cabrilla arenera es una especie de desarrollo rápido, se observaron algunos desoves tan pronto como la fase de 4 células, mientras que otros no se observaron hasta la fase de 32 células, pero nunca después. Todos los embriones que no mostraron una división normal (ver Fig. 1 a) fueron considerados anormales (Fig. 1b). Los embriones en la fase de 32 células fueron considerados normales o abnormales con base en la organización estructural de los blastómeros (Fig. 1c, d). Después de esta evaluación, se colocaron las microplacas de 12 pozos en una incubadora de temperatura controlada (25 ^ºC). Después de la eclosión, se registró el número de embriones muertos y de larvas vitelinas vivas y muertas. Las larvas vitelinas que estaban dobladas o ligeramente opacas se registraron como muertas (Fig. 1e, f).

Figura 1 Fotografías digitales representativas de la cabrilla arenera (Paralabrax maculatofasciatus): (a) división celular normal y (b) division celular anormal en embriones en la fase de 8 células, (c) división celular normal y (d) división celular anormal en embriones en la fase de 32 células, (e) larvas eclosionadas normales y (f) larvas muertas. Barra de escala = 90 µm. 

Resultados

Efecto de la triploidía sobre la división celular

Se observó un coeficiente de correlación de Pearson significativamente negativo entre los porcentajes transformados de la división celular anormal y eclosión (r = -0.63; P < 0.05) y la proporción de larvas vitelinas vivas (r = -0.58; P < 0.05). La proporción de embriones con división anormal fue significativamente mayor (P < 0.05) en el grupo sometido a choque frío en ambos años experimentales, mientras que el porcentaje de eclosión y la proporción de larvas vitelinas vivas fue significativamente menor (P < 0.05). El porcentaje de triploidía fue significativamente mayor durante el primer año (experimento 1) que durante el segundo (experimento 2) (Tabla 1). El porcentaje transformado de triploidía no fue una covariable significativa (P = 0.83) para la supervivencia a la eclosión, la proporción de división anormal o la proporción de larvas vitelinas vivas. Ninguna de estas variables mostró alguna interacción entre tratamiento y año.

Tabla 1 Porcentajes de división celular anormal (AC), eclosión (H), larvas vivas (LL) y triploidía (T) (promedio ± error estándar) para los huevos de la cabrilla arenera (Paralabrax maculatofasciatus) del grupo control (C) y del grupo sometido a choque frío (CS) en los experimentos 1 (n = 7) y 2 (n = 6). 

^*Means for untransformed data. Superscript letters indicate significant differences in each row (P < 0.05).

Relación entre la división celular anormal y el éxito de eclosión

Cuando los embriones con divisiones normales y anormales del grupo control y el grupo sometido a choque frío fueron incubados por separado, se observaron diferencias significativas (P < 0.05) en el porcentaje de eclosión y el porcentaje de larvas vitelinas vivas (Tabla 2). Los porcentajes de eclosión fueron significativamente diferentes (P = 0.017) debido a que el porcentaje de eclosión fue significativamente menor (P < 0.05) para los embriones anormales del grupo sometido a choque frío en comparación con los embriones normales. No se observó una diferencia significativa entre los embriones normales y anormales del grupo control. El número de larvas vitelinas vivas fue significativamente más alto (P < 0.05) en los embriones normales del grupo control y significativamente más bajo en los embriones anormales del grupo sometido a choque frío (Tabla 2).

Tabla 2 Porcentajes de eclosión (H) y de larvas vivas (LL) (promedio ± error estándar) obtenidos para embriones de la cabrilla arenera con divisiones celulares normales y anormales. 

^*Means for untransformed data. Superscript letters indicate significant differences in each column (P < 0.05).

Porcentajes de triploidía durante el periodo larvario

Se observó una disminución significativa (P < 0.05) de los porcentajes de triploidía durante el periodo larvario en los 3 desoves individuales (Tabla 3). El número de prejuveniles al día 30 (NL30) fue mayor en el grupo control que en el grupo sometido a choque frío (Tabla 4). En el grupo sometido a choque frío, el porcentaje de diploides que sobrevivieron al día 30 (SCSD) fue mayor que el de triploides, pero cerca a lo observado para el grupo control en los 3 desoves. Al día 30, en los 3 desoves, el número de prejuveniles diploides sometidos a choque frío siempre fue mayor que el número de triploides (Tabla 4).

Tabla 3 Porcentaje^* de triploidía a la eclosión (TH) y a 5 (T5), 15 (T15) y 30 (T30) días después de la eclosión. Datos de desoves individuales (S₁, S₂, S₃) de la cabrilla arenera. 

^*Means of untransformed data. Superscript letters indicate significant differences in each column (P < 0.05).

Tabla 4 Número inicial de larvas (IL), número inicial de larvas triploides (IT), número inicial de larvas diploides sometidas a choque frío (ICSD), número de prejuveniles al día 30 (NL30), porcentaje de supervivencia al día 30 (S), porcentaje de supervivencia de larvas triploides al día 30 (ST) y porcentaje de supervivencia de larvas diploides sometidas a choque frío al día 30 (SCSD). Datos de desoves individuales de la cabrilla arenera (Paralabrax maculatofasciatus). 

Discusión

En el presente estudio se observó una mayor mortalidad relacionada con la división celular anormal en los embriones de la cabrilla arenera sometidos a choque frío. Además, se registró una disminución de la cantidad de triploides durante el periodo larvario.

Se observó división celular anormal tanto en el grupo control como en el grupo sometido a choque frío; sin embargo, mientras que la tasa de división anormal fue de 25% en el grupo control, el éxito de eclosión fue >90%. Estos resultados coinciden con los de ^{Vallin y Nissling (1998)}, quienes argumentan que divergencias en las células tempranas no diferenciadas de bacalao (4 a 32 células) permiten que el desarrollo proceda normalmente hasta la eclosión. ^{Rideout et al. (2004)} indicaron que la viabilidad varía en embriones con división anormal y depende del tipo de anormalidad blastomérica. Además, las proteínas y los mecanismos de reparación están constantemente trabajando para reducir los blastómeros anormales y la mortalidad embrionaria, actuando como puntos de control durante la división celular (^{Gerald 2005}). Sin embargo, cuando se separaron los embriones con divisiones normales y anormales en nuestros 2 grupos experimentales, sólo se observó una correlación negativa significativa entre los embriones anormales y la eclosión en los huevos sometidos a choque frío; por ende, una proporción alta de huevos anormales no eclosionaron. Es probable que se interrumpan los mecanismos de autoreparación durante el tratamiento de choque frío debido a cambios en las proteínas intracelulares. ^{Felip et al. (1997)} y ^{Piferrer et al. (2003)} sugieren que el incremento de división celular anormal que se observa después de un tratamiento de choque frío puede ser resultado de aneuploidía. La adición de un tercer juego de cromosomas podría interferir durante la anafase. Estos cromosomas adicionales podrían afectar la alineación del huso mitótico en las etapas tempranas de la mitosis, y cambiar la dinámica de los microtúbulos durante la división celular y, consecuentemente, modificar la distribución del material genético y el volumen citoplasmático entre las células hijas (^{Gerald 2005}, ^{Voronina y Wessel 2006}). Por otro lado, la división anormal puede ser resultado de la intensidad del choque frío. Las proteínas intracelularles involucradas en la formación de microtúbulos pueden ser afectados negativamente, lo que provocaría aneuploidía o una interrupción de la acción y distribución de proteínas específicas en cada mitad de las células en división (^{Downing y Allen 1987}, ^{Voronina y Wessel 2006}).

En el bacalao del Atlántico, que vive en aguas frías, ^{Sultana (2005)} no observó diferencias en el porcentaje de embriones con división anormal entre el grupo sometido a choque frío y el grupo control. De hecho, el porcentaje de embriones con división anormal así como el porcentaje de eclosión fueron muy bajos para ambos grupos. La diferencia entre la temperatura del choque frío y la temperatura de mantenimiento parece ser más importante que la propia temperatura del choque (^{Diaz et al. 1993}). La diferencia fue de sólo 5 ^ºC en el experimento con el bacalao del Atlántico y de 14 ^ºC en nuestro experimento. Esta diferencia podría explicar la alta proporción de división anormal en nuestro estudio.

En el presente estudio, durante el cultivo de larvas de la cabrilla arenera, el porcentaje de supervivencia de las larvas triploides fue menor que el de las diploides sometidas a choque frío y del grupo control. La supervivencia de las larvas diploides del grupo control fue similar a la obtenida por ^{Álvarez-González et al. (2000)} en un estudio previo con la misma especie en nuestro laboratorio. Una mayor mortalidad de larvas triploides que de diploides control ha sido documentada por ^{Solar et al. (1984)}, quienes sugieren que esta disminución gradual en la supervivencia puede ser resultado de un grado de endogamia causada por la retención del segundo cuerpo polar.

No obstante, no se puede ignorar la intensidad del choque frío. Los individuos que no responden a choques térmicos cuando la inducción a la triploidía no es del 100% pueden servir como controles para determinar el efecto de la intensidad del choque sobre la supervivencia y las tasas de crecimiento durante el periodo larvario (^{Piferrer et al. 2009}). ^{Maxime (2008)} sugiere que es poco probable que las temperaturas usadas durante el tratamiento de inducción a la triploidía sean lo suficientemente intensas para interrumpir el desarrollo después de la embriogénesis temprana. Los porcentajes de diploides sometidos a choque frío en los 3 desoves fueron similares a los obtenidos para el grupo control, lo que sugiere que la intensidad del choque frío no fue responsable de la baja supervivencia de las larvas triploides.

No tenemos evidencia concluyente de la mortalidad diferencial entre las larvas triploides y las larvas diploides sometidas a choque frío. Se han documentado varias diferencias entre peces triploides y diploides que pueden afectar el desarrollo y la supervivencia de larvas. Se han registrado comportamientos anormales, incluyendo comportamiento natatorio y alimentario inusual (^{Solar et al. 1984}), para larvas triploides de algunas especies (^{Piferrer et al. 2009}). Se ha registrado un comportamiento menos agresivo para juveniles triploides (^{Galbreath et al. 1994}), y en peces triploides se han observado deformidades de la mandíbula inferior (^{Lijalad y Powell 2009}), de la vejiga natatoria y esqueléticas (^{Tiwary y Ray 2004}). También se ha propuesto la disminución del área superficial de una célula asociada a la elevación del estatus de ploidía y su potencial relación con varias características biológicas y fisiológicas negativas, entre ellas la disminución del número de células en algunos órganos (^{Swarup 1959}), el número de células en la sangre circulante, la capacidad de transportar oxígeno (^{Saddler et al. 2000}), rutas metabólicas (^{Hyndman et al. 2003}, ^{Atkins y Benfey 2008}) y la respuesta al estrés (^{Beyea et al. 2005}).

En conclusión, la mortalidad de embriones de la cabrilla arenera sometidos a choque frío puede atribuirse a la división celular anormal provocada por el choque frío (8 ^ºC), lo que resultó en una menor eclosión que la observada en embriones con división anormal del grupo control. Asimismo, se registró una tasa de supervivencia diferencial entre las larvas triploides y las diploides sometidas a choque frío, lo que se tradujo en porcentajes bajos de triploides al final del periodo larvario. Esto representa un serio impedimento para la producción de larvas triploides de la cabrilla arenera. Una posible solución sería realizar el cultivo larvario exclusivamente con desoves sometidos a choque frío que han resultado en 100% de triploidía. Se necesita realizar más investigación para determinar la viabilidad de cultivar larvas triploides de la cabrilla arenera, y un próximo paso lógico sería estudiar su maduración sexual.