Introducción

La filogeografía analiza las relaciones entre los linajes intraespecíficos a lo largo de la distribución de las especies (^{Avise 2000}). Las investigaciones en esta área son importantes dado que apoyan los estudios sobre diferenciación genética entre poblaciones distantes o cercanas (^{Wiley y Lieberman 2011}). La estructura filogeográfica en animales puede estar relacionada con dos factores: capacidad de dispersión y dispersión de gametos. En los invertebrados bentó-nicos, la dispersión de las larvas parece ser el factor principal que afecta el flujo génico y, por consiguiente, el aislamiento entre poblaciones.

Las corrientes marinas actúan como el principal dispersor de larvas de invertebrados bentónicos (^{Kurihara 2007}, ^{Salas et al. 2010}) y pueden conectar poblaciones separadas por cientos de kilómetros, lo cual promueve el flujo génico (^{Ospina-Guerrero et al. 2008}, ^{Van den Broeck et al. 2008}). La dispersión de las larvas también es influenciada por el tiempo que permanece la larva en el plancton (^{Paulay y Meyer 2006}), así como por el tipo de desarrollo que presentan los organismos, ya sea directo o larvario (^{Lee y Boulding 2009}, ^{Sánchez et al. 2011}). La disponibilidad de hábitat es otro factor que define la distribución de las especies, ya que los organismos se establecen en hábitats específicos a lo largo de su distribución (^{Kirkendale y Meyer 2004}, ^{Elligson y Krug 2006}, ^{Crandall et al. 2008}).

Los estudios filogeográficos se han centrado en la cuanti-ficación de la diversidad haplotípica y nucleotídica con la ayuda del ADN mitocondrial. Los marcadores más comunes usados para estudios de la filogeografía de gasterópodos de la zona intermareal rocosa son el citocromo c oxidasa subuni-dad I (COI), citocromo b ó ambos (^{Lee y Boulding 2007}, ^{Crandall et al. 2008}, ^{Van den Broeck et al. 2008}, ^{Haupt et al. 2013}, ^{Espinoza et al. 2015}, ^{Nuñez et al. 2015}). Los estudios comparativos en los cuales se ha utilizado el citocromo b mostraron variación tanto nucleotídica como haplotípica en especies con larva planctónica y en especies con desarrollo directo (Tabla 1). Las especies del mismo género y con diferente forma de desarrollo (Littorina spp.) muestran una diferencia marcada entre ellas, y la diversidad haplotípica y nucleotídica es mayor en las especies de larva planctónica. Sin embargo, en otros estudios comparativos entre Nucella lima y Sphonaria lessoni se registraron resultados diferentes con respecto a su diversidad haplotípica y nucleotídica, dependiendo del sitio en donde se encontraban, ya sea en la costa este u oeste (^{Cox et al. 2014}, ^{Nuñez et al. 2015}).

Tabla 1: Comparación de diversidad haplotípica (h) y nucleotídica (π) de moluscos intermareales y otras especies de invertebrados plantónicos cuando se usó el citocromo b (Cyt b) como marcador: bp = pares de bases del ADN usado, ND6 = NADH deshidrogenasa subunidad 6, y COI= citocromo c oxidasa subunidad I. 

El caracol púrpura, Plicopurpura pansa (Gould 1853) habita la zona intermareal rocosa del Pacífico Oriental Tropical y se reproduce durante la primavera. Se distribuye desde el sur de Baja California Sur, México, hasta el norte del Perú (^{Keen 1971}). El caracol púrpura es una especie económica-mente importante en la costa oeste de México, ya que produce un tinte que es utilizado por los habitantes de Oaxaca y Guerrero (^{Castillo-Rodríguez y Amezcua-Linares 1992}). ^{Chávez y Michel (2006)} propusieron que las larvas de P. pansa pueden estar presentes en el plancton por un periodo de hasta cuatro meses, desde el momento en que los huevos son puestos hasta que son vistos los primeros reclutas. Las larvas de P. pansa presentan su propio tipo de movimiento por medio de las contracciones del velo, y pueden moverse de las corrientes superficiales a las corrientes submarinas.

En el presente estudio analizamos la estructura genética y filogeográfica de P. pansa y los eventos demográficos a lo largo del Pacífico Oriental Tropical. Ya que P pansa surge como resultado del levantamiento del istmo de Panamá (^{Collins et al. 1996}) y que las larvas permanecen mucho tiempo en el plancton y habitan la zona intermareal rocosa casi continua en la costa tropical del Pacífico, con excepción de algunas zonas arenosas en la parte norte de América Central (^{Hurtado et al. 2007}), esperamos encontrar haploti-pos ancestrales en las poblaciones sureñas y haplotipos derivados en las poblaciones norteñas de su distribución en el Pacífico oriental.

Materiales y métodos

Recolectamos un total de 219 individuos de P. pansa durante 2006 en 16 localidades en la costa mexicana del Pacífico y una en Costa Rica (Fig. 1). Plicopurpura pansa comparte distribución con Plicopurpura columellaris y parece haber hibridación entre estas dos especies, ya que hemos encontrado individuos con características fenotípicas de ambas especies; por lo tanto, recolectamos sólo aquellos especímenes que fueran P pansa puros. Los organismos se recolectaron a mano. Una porción pequeña del pie fue desprendida y preservada en etanol al 95% para su posterior análisis en el laboratorio.

1. Isla Clarión, 2. Pescadero, 3. Cabo San Lucas, 4 Mazatlán, 5. Isla María Madre, 6. Platanitos, 7. Tenacatita, 8. Faro de Bucerías, 9. San Juan de Alima, 10. Peñitas, 11. Barra de Potosí, 12. Playa Ventura, 13. Punta Maldonado, 14. Carrizalillo, 15. Puerto Ángel, 16. Huatulco, 17. Costa Rica.

Figura 1: Sitios de muestreo y distribución de haplotipos de las poblaciones de Plicopurpura pansa. No se muestran los alelos privados. 

El ADN fue extraído de una muestra de tejido de aproximadamente 200 mg mediante el protocolo de fenol-cloroformo-alcohol (^{Palumbi 1996}). Se amplificó un fragmento de ADN de 687 pb del gen del citocromo b utilizando los iniciadores 14,841 y 15,573 (^{Anderson et al. 1981}). No utilizamos otro marcador ya que en estudios anteriores este marcador mostró suficiente resolución para identificar la estructura genética y filogeográfica de invertebrados y vertebrados (^{Nicolas et al. 2012}, ^{Yong et al. 2015}; ver Tabla 1). La amplificación por PCR se desarrolló en un volumen de 25 μL con 0.2 mM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl₂, 0.36 μM de cada iniciador, amortiguador 1× (el amortiguador 10× contiene 500 mM KCl y 100 mM tris HCl [pH 8.3]), 1 unidad de Taq, BSA 1× y de 50 a 200 ng de ADN. Las condiciones del termociclador fueron las siguientes: una desnaturalización inicial del ADN a 95 °C por 1 min, seguido de 35 ciclos de 1 min a 95 °C, 1 min a 50 °C y 1 min a 72 °C, y una extensión final de 5 min a 72 °C. Los productos de la PCR se visualizaron por electroforesis en geles de agarosa al 0.8% teñidos con bromuro de etidio. Los productos de la PCR se limpiaron con el QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, EUA). Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en ambas direcciones con el kit de secuenciación ABI PRISM Big-Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Las secuencias se generaron en ambas direcciones en un secuenciador automático ABI 3100-Avant (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

La edición de las secuencias se llevó a cabo con el programa de computación Sequencher 4.7 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Para la codificación de regiones, los alineamientos fueron ajustados visualmente y se tradujeron las secuencias para confirmar que se conservara el marco de lectura y verificar la ausencia de codones de terminación prematuros. La diversidad nucleotídica (π) y diversidad haplotípica (h) fueron estimadas con el paquete Arlequin 3.11 (^{Excoffier et al. 2005}). La distribución de la diversidad genética entre las poblaciones fue cuantificada utilizando un análisis de varianza molecular (AMOVA; ^{Excoffier et al. 1992}) en Arlequin 3.11 (^{Excoffier et al. 2005}). Buscamos diferencias entre poblaciones con un análisis por pares de los valores de FST (tomando a cada sitio de muestreo como una población) para ver cómo se relacionaban los haplotipos entre las poblaciones.

Construimos una red de haplotipos utilizando el método de máxima parsimonia y el algoritmo de unión por medianas (median joining) del programa de computación Network (^{Bandelt et al. 1999}). Se obtuvieron los valores de F_S de Fu y D de Tajima para detectar expansión o contracción poblacio-nal con Arlequin 3.11 (^{Excoffier et al. 2005}). Probamos el ajuste de las diferencias en la distribución entre pares de nucleótidos con el modelo 'constante poblacional' para obtener una inicial y final, así como valores de T. Estos parámetros fueron necesarios para correr el modelo de crecimiento-declive de la población implementado en Arlequin 3.11 (^{Excoffier et al. 2005}). Calculamos el índice de irregularidad (raggedness) de Harpending para probar el ajuste de los datos del análisis de diferencias pareadas.

Analizamos la historia demográfica de los clados del ADNmt entre las muestras del Pacífico mexicano con un análisis de clados anidados (NCA por sus siglas en inglés) con la ayuda de ANeCA (^{Panchal 2007}), TCS (^{Clement et al. 2000}) y GeoDis (^{Posada et al. 2000}). Para probar las barreras al flujo de genes, utilizamos el algoritmo de Monmonier implementado en BARRIER 2.2 (^{Manni et al. 2004}), el cual incluye una triangulación de Delaunay (^{Watson 1992}, ^{Brouns et al. 2003}) que crea una red de conexiones entre las poblaciones. Todos los análisis estadísticos se interpretaron con un α = 0.05

Resultados

Secuenciamos un fragmento de 687 pb del gen del citocromo b de cada uno de los 216 individuos recolectados a lo largo de 3,000 km de la línea de costa de México, desde Pescadero, Baja California Sur, hasta Huatulco, Oaxaca (Fig. 1), además de 3 muestras de Costa Rica. Encontramos 92 haplotipos (números de acceso del GenBank KF372880-KF372966 y KF372969-KF372973). El promedio del porcentaje para C fue 17.16%, para T fue 40.59%, para A fue 24.72% y para G fue 17.52%. La variación del contenido de C, T, A y G entre las poblaciones estuvo por debajo del 0.16%. Se obtuvieron 98 sitios polimórficos, de los cuales 46 fueron informativos y 52 fueron portadores de mutaciones únicas. Sin considerar las muestras de Costa Rica (h = 0.6), debido a que eran pocas, la diversidad haplotípica estuvo entre 0.87 y 0.98 y la diversidad nucleotídica varió entre 0.002 y 0.06 (Tabla 2). Veintiséis haplotipos se compartieron en al menos un par de poblaciones, y 66 se observaron en una sola población.

Tabla 2: Diversidad genética de Plicopurpura pansa a lo largo de la costa del Pacífico mexicano: n = tamaño de muestra, H = número de haplotipos por sitio, h = diversidad haplotípica, π = diversidad nucleotídica, D = D de Tajima y F_S = F_S de Fu. 

El AMOVA mostró que el valor de Φ _st para todas las poblaciones fue de -0.004 (P = 0.6). Cuando se examinaron los valores de FST entre pares de poblaciones, la población de isla Clarión difirió significativamente de 6 de las 15 poblaciones (Tabla 3); Costa Rica no fue considerada en esta parte del análisis debido al bajo número de muestras. La red de haplotipos que se presenta es la que se construyó en TCS, ya que la que obtuvimos con Network no presentó diferencias significativas y decidimos dejar la que obtuvimos mediante el NCA. La red muestra dos politomías principales con dos haplotipos centrales con alta frecuencia (haplotipos P1, n = 47, y P7, n = 23; Fig. 2). La F_S de Fu para todas las muestras presentó un valor negativo y significativo (Tabla 2), como se espera para poblaciones que han pasado por cambios demográficos recientes en tiempos ecológicos. El análisis de la distribución de diferencias pareadas mostró una representación unimodal para todas las poblaciones (Fig. 3), la cual se ajustó al modelo de expansión de acuerdo con el índice de irregularidad (r = 0.0128, P = 0.85).

Tabla 3: Diferencia por pares de pobladores de F_ST. Valores en negritas = F_ST significativo. 

1. Cabo San Lucas, 2. Pescadero, 3. Platanitos, 4. Mazatlán, 5. Isla María, 6. Isla Clarión, 7. Faro de Bucerías, 8. Tenacatita, 9. San Juan de Alima, 10. Peñotas, 11. Barra de Potosí, 12. Punta Maldonado, 13. Playa Ventura, 14. Puerto Ángel, 15. Carrizalillo, 16. Huatulco.

Figura 2: Red de haplotipos y el correspondiente diseño anidado del citocromo b para los haplotipos de Plicopurpura pansa. Los números "1-n", "2-n", "3-n" y "4-n" son los números para las cuatro etapas de los clados. 

Figura 3: Análisis de la distribución de diferencias pareadas de acuerdo con un escenario de crecimiento poblacional para todas las poblaciones. 

El NCA para P. pansa mostró cuatro niveles presentes en la red de haplotipos (Fig. 2). De los 92 haplotipos, 38 fueron clados de primer nivel, 16 de segundo nivel, 7 de tercer nivel, 3 de cuarto nivel y 1 de quinto nivel. Tres de los clados presentaron flujo de genes restringido con aislamiento por distancia; éstos fueron 1-11, 2-11 y 3-3. La red de haplotipos en general mostró expansión contigua.

El análisis realizado con BARRIER 2.2 mostró cuatro posibles barreras con datos de F_ST y G_ST. Los resultados obtenidos con FST y GST presentaron una diferencia de agrupa-miento en las poblaciones del norte (de San Juan de Alima a Pescadero), y con ambos datos se forma un solo grupo en el sur del área muestreada (Fig. 4).

Figura 4: Red de conectividad por triangulación de Delaunay para los sitios de muestreo con un teselado de Voronoi construida con BARRIER 2.2. Las líneas gruesas representan las cuatro barreras probables en el flujo génico (la probabilidad decrece de I a IV) como fue detectado con la máxima diferencia del algoritmo de Monmonier por medio de F_ST (a) y G_ST (b). 

Discusión

La distribución de la diversidad genética de los gasterópodos de la zona intermareal rocosa presenta diferentes patrones dependiendo del tipo de desarrollo que tengan las especies, ya sea que presenten larvas planctónicas (^{Crandall et al. 2008}, ^{Díaz-Ferguson et al. 2012}, ^{Haupt et al. 2013}) o larvas con desarrollo directo (^{Ayre et al. 2009}, ^{Cox et al. 2014}). Sin embargo, hay cierta tendencia hacia una mayor diversidad tanto nucleotídica como haplotípica en especies que presentan larvas de vida libre comparadas con aquellas que presentan larvas con desarrollo directo (Tabla 1). Nuestros datos sugieren que las poblaciones de P. pansa estudiadas están en proceso de expansión. No encontramos estructura genética ni filogeográfica entre las poblaciones muestreadas. Los resultados obtenidos se pueden explicar por un evento de cuello de botella reciente o por un efecto fundador (^{Grant y Bowen 1998}, ^{Avise 2000}).

Existen reportes sobre otros neogasterópodos con diversidad haplotípica media, los cuales incluyen a Mexacanthina lugubris (^{Fenberg et al. 2014}), Megastraea unduosa (^{Haupt et al. 2013}) y Conus sanguinolentus (^{Duda et al. 2012}). Por otro lado, Morula marginalba y Haustrum vinosa (^{Ayre et al. 2009}) mostraron valores altos de diversidad haplotípica, a pesar de que presentan desarrollo directo.

Una pista de las tendencias de la diversidad genética entre los neogasterópodos de la zona intermareal rocosa se encuentra en el estudio de ^{Cox et al. (2014)} sobre la filogeografía de N. lima en las costas este y oeste del Pacífico Norte. Estos autores encontraron que las poblaciones de N. lima del oeste mostraron baja diversidad haplotípica y nucleotídica, pero las poblaciones del este mostraron mayor diversidad haplotípica y nucleotídica. Esta especie presenta un desarrollo directo y no es afectada por las corrientes marinas tanto como las especies con larva planctónica. Las poblaciones estuvieron aisladas por el último periodo glacial, el cual provocó un cuello de botella en las poblaciones del este. Las poblaciones de P. pansa en el Pacífico mexicano parecen responder de la misma manera que las poblaciones de N. lima del este, pero por el efecto de los giros y remolinos que desvían a las larvas mar adentro y las regresan a sus playas de nacimiento.

No es clara la relación entre la estructura filogeográfica y el tipo de larva (y su duración); sin embargo, la ausencia de estructura genética en nuestra área de estudio, a lo largo del Pacífico mexicano, puede estar relacionada con las corrientes oceánicas, lo cual apunta hacia la hipótesis del efecto fundador. Las corrientes fluyen hacia mar adentro la mayor parte del año alrededor de la isla Clarión, donde la población presentó diferencias con 6 de las poblaciones mexicanas estudiadas. Otro ejemplo es la corriente que corre desde Oaxaca hasta Nayarit y regresa a Oaxaca (^{Kessler 2006}), que puede mantener en contacto las poblaciones de esa parte de la costa mexicana del Pacífico.

La presencia de uno de los dos haplotipos encontrados en Costa Rica que no se encuentra en México puede ser el resultado de la presencia de un remolino en el golfo de Tehuante-pec y otro en el golfo de Papagayos en Costa Rica. Los remolinos pueden prevenir la migración de las larvas hacia el norte y llevar las larvas hasta 1,000 km mar adentro (^{Trasviña et al. 1995}, ^{Filonov y Trasviña 2000}, ^{López-Calderón et al. 2006}). Los giros y los remolinos pueden funcionar como barreras entre las poblaciones al mantener a las larvas cerca de las playas donde nacieron. Además, las larvas tendrían que atravesar una zona de playa arenosa de aproximadamente 1,200 km desde el litoral del sur de Oaxaca hasta El Salvador (^{Hurtado et al. 2007}) para alcanzar la playa rocosa más cercana en Huatulco, Oaxaca. Dicho viaje le llevaría a las larvas casi un año con una velocidad de corriente de 1 m s^-1.

La distribución de P. pansa en las costas de México aparentemente ocurrió después del levantamiento del istmo de Panamá (^{Barco et al. 2010}, ^{Claremont et al. 2013}). Después del cierre del océano, el cambio de las corrientes marinas promovió la invasión de las aguas tropicales frente a Panamá hacia el norte (^{Coates 1997}). La presencia de un haplotipo en la población de Costa Rica y en 6 poblaciones de México (Fig. 1) es indicio de un posible haplotipo ancestral disperso en las poblaciones mexicanas. Sin embargo, es necesario ampliar el número de muestras de Centro América para identificar la sucesión de haplotipos de sur a norte. No obstante, nuestros resultados indican que la diversidad genética de P. pansa en las poblaciones mexicanas mues-treadas fue definida por un efecto fundador o por un cuello de botella, debido a las barreras presentes en Centro América y el istmo de Tehuantepec. La ausencia de estructura entre las muestras y la alta diversidad haplotípica y nucleotídica pudieran estar relacionadas con el hecho de que las larvas planctónicas de P. pansa son dispersadas por corrientes oceánicas de Costa Rica y Tehuantepec.