Artículos

 

Variación intratalo de compuestos fenólicos, actividad antioxidante y actividad de la fenolsulfatasa en Cystoseira tamariscifolia (Phaeophyceae) del sur de España

 

Intra-thallus variation of phenolic compounds, antioxidant activity, and phenolsulphatase activity in Cystoseira tamariscifolia (Phaeophyceae) from southern Spain

 

Roberto Teófilo Abdala-Díaz^1,*, Alejandro Cabello-Pasini², Eugenia Márquez-Garrido¹, Félix López Figueroa¹

 

¹ Departamento de Ecología, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Campus Universitario de Teatinos s/n, Málaga E-29071, Spain.

² Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California, Carretera Transpeninsular Ensenada-Tijuana No. 3917, Fraccionamiento Playitas, Ensenada 22860, Baja California, México.

 

Received October 2013
Accepted January 2014.

 

* Corresponding author.
E-mail: abdala@uma.es

 

RESUMEN

Se estudió la variación intratalo del contenido fenólico, la actividad antioxidante y la actividad de la fenolsulfatasa (EC 3.1.6.1) en Cystoseira tamariscifolia (Phaeophyceae) del sur de España. Se encontraron diferencias significativas en el contenido de los compuestos fenólicos entre las secciones apical, media y basal del talo de C. tamariscifolia. La concentración de los compuestos fenólicos y la actividad de la fenolsulfatasa fueron mayores en la sección apical y disminuyeron hacia la sección basal. Se observó una correlación significativa entre la concentración de los compuestos fenólicos y la actividad antioxidante y de la fenolsulfatasa en C. tamariscifolia. Tanto la excreción de fenoles en el agua de mar como la actividad de la fenolsulfatasa se correlacionaron significativamente con la radiación integrada. Esta especie crece en bosques densos que proporcionan autosombra a las secciones media y basal de los talos, y es probable que el mayor contenido de polifenoles en la sección apical se debe a una mayor exposición a radiación fotosintéticamente activa y radiación ultravioleta en comparación con las secciones media y basal. Estos resultados sugieren que la excreción de compuestos fenólicos funciona como un mecanismo de protección que proporciona un filtro de radiación en las inmediaciones de los talos de C. tamariscifolia.

Palabras clave: actividad antioxidante, Cystoseira tamariscifolia, compuestos fenólicos, actividad de la fenolsulfatasa.

 

ABSTRACT

Intra-thallus variation in phenolic content, antioxidant activity, and phenolsulphatase activity (EC 3.1.6.1) was studied in Cystoseira tamariscifolia (Phaeophyceae) from southern Spain. Significant differences in the content of phenolic compounds were found among apical, middle, and basal sections of the thallus of C. tamariscifolia. The concentrations of phenolic compounds and of phenolsulphatase activity were highest in the apical section and decreased toward the basal section. There was a highly significant correlation between the concentration of phenolic compounds and antioxidant and phenolsulphatase activities in C. tamariscifolia. Phenol excretion and phenolsulfatase activity were significantly correlated with integrated irradiance. Cystoseira tamariscifolia grows in tightly packed turfs that promote auto-shading in the middle and basal sections of its thalli, and it is thus likely that the higher polyphenol content in the apical section of this species is a response to the higher exposure to ultraviolet radiation and photosynthetically active radiation relative to the middle and basal sections. These results suggest that this excretion of phenolic compounds might function as a protective mechanism serving as a radiation filter in the immediate surroundings of the C. tamariscifolia thalli.

Key words: antioxidant activity, Cystoseira tamariscifolia, phenolic compounds, phenolsulphatase activity.

 

INTRODUCCIÓN

Los organismos marinos, incluyendo las algas que habitan en la zona intermareal, están expuestos a radicales libres y otros agentes oxidantes (Abdala-Díaz et al. 2006, Rodríguez-Troncoso et al. 2013). Por consiguiente, las algas marinas sintetizan las enzimas protectoras (e.g., superóxido dismutasa, peroxidasa, glutatión reductasa, catalasa) y los compuestos antioxidantes (e.g., florotaninos, fosfolípidos, ácido ascórbico, carotenoides, bromofenoles, catequinas, aminoácidos tipo micosporina, polisacáridos) como mecanismo de defensa (Abdala-Díaz et al. 2006, Korbee et al. 2006, Bellassoued et al. 2012). Además de las enzimas, las algas y plantas superiores sintetizan los polifenoles estructurales que también poseen una alta capacidad antioxidante (Goodwin y Mercer 1988). Entre las algas marinas, las pertenecientes a la clase Phaeophyceae contienen los niveles más altos de compuestos fenólicos, principalmente en forma de florotaninos, i.e., floroglucinol (1,3,5-trihidroxibenceno). Los mayores niveles de florotaninos han sido encontrados en las algas del orden Fucales y orden Dictyotales (20-30% de peso seco (PS), Targett et al. 1995).

Los florotaninos, empaquetados en vesículas llamadas fisoides unidas a la membrana, parecen desempeñar múltiples funciones en las algas pardas, tanto a nivel celular como del organismo (Schoenwaelder 2002). Por ejemplo, estos polifenoles juegan un papel fundamental en la protección de las algas pardas contra el pastoreo (Pavia y Toth 2000) y en el proceso de anclaje de la planta al sustrato (Vreeland et al. 1998). Las concentraciones de estos compuestos muestran variaciones estacionales, geográficas y diarias, y son afectadas por los niveles de radiación fotosintéticamente activa (PAR, por sus siglas en inglés) y radiación UV, la concentración de nutrientes y la salinidad (Pedersen 1984, Ragan y Glombitza 1986, Yates y Peckol 1993, Pavia et al. 1997, Abdala-Díaz et al. 2006). La diversidad de los compuestos fenólicos y la variedad de los parámetros que condicionan su acumulación en las algas pardas pueden explicar por qué los contenidos fenólicos y la zonificación de algas no son totalmente interdependientes (Connan et al. 2004).

Se ha documentado que el proceso de síntesis y excreción de compuestos polifenólicos en algas marinas es un mecanismo de defensa contra el herbivorismo y niveles altos de radiación UV y PAR. La concentración de florotaninos en el alga Lessonia nigrescens, por ejemplo, aumenta según incrementa el nivel de radiación UV (Gómez y Huovinen 2010). La excreción de coumarinas en el alga verde Dasycladus vermicularis aumentó cuatro veces a mayores niveles de PAR (Pérez-Rodríguez et al. 2001). Un incremento de los compuestos polifenólicos en el agua circundante reduce la transmisión de luz y protege a las algas contra niveles altos de radiación UV y PAR.

La fenolsulfatasa (arilsulfatasa) (E.C. 3.1.6.1) es una enzima ampliamente distribuida en bacterias, algas, hongos, plantas superiores y animales. Esta enzima es parcialmente responsable de la hidrólisis de ésteres de sulfato en los extractos crudos de plantas (Farooqui et al. 1977). En el talo del alga marina Cystoseira tamariscifolia se ha detectado la hidrólisis de ésteres sulfatados (sulfato de p-nitrocatecol, sulfato de p-nitrofenil, sulfato de 6-benzol-2-naftil, etc.) por la fenolsulfatasa (Knöss y Glombitza 1993); sin embargo, se desconoce si esta enzima juega un papel importante en la hidrólisis y excreción de polifenoles en condiciones de estrés.

Cystoseira tamariscifolia es abundante en la zona intermareal de la costa mediterránea de España. Las algas que habitan en la zona intermareal, incluyendo C. tamariscifolia, están expuestas a diferentes niveles de radiación UV y PAR. Mientras están inmersas, estas plantas reciben poca luz, pero cuando emergen, sus porciones apicales pueden quedar expuestas a desecación y a dosis altas de radiación UV y PAR. Aparte de la fotoinhibición dinámica, C. tamariscifolia ha desarrollado mecanismos eficientes de fotoprotección contra estas condiciones ambientalmente estresantes (Hader y Figueroa 1997). Varios trabajos han mostrado, por ejemplo, que la excreción de compuestos fenólicos incrementa en condiciones de alta radiación (Pérez-Rodríguez et al. 2001, Koivikko et al. 2005, Abdala-Díaz et al. 2006, Gómez y Huovinen 2010). Por tanto, es posible que la actividad de la fenolsulfatasa forme las sustancias naturales activas a tasas correlacionadas con los de su excreción. El objetivo de este trabajo fue relacionar la distribución intratalo de los compuestos fenólicos y la actividad antioxidante y actividad de la fenolsulfatasa como un balance entre la producción y excreción de fenoles en C. tamariscifolia (Phaeophyceae) del sur de España.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material algal

En julio de 2010 se recolectaron muestras de C. tamariscifolia temprano en la mañana en el Parque Natural Cabo de Gata-Níjar (36°52' N, 2°12' W; Almería, España) en el Mediterráneo. Las algas fueron desprendidas del sustrato rocoso (zona intermareal) y transportadas en nitrógeno líquido al laboratorio para su análisis.

 

Extracción y ensayo de fenoles

Los talos fueron divididos en tres secciones: basal, media y apical. Se homogeneizaron muestras de cada sección (n = 5) en nitrógeno líquido con un mortero y se extrajeron con 2.5 mL de metanol al 80% (v/v). Se centrifugó el homogenado a 19,000 g durante 15 min y se recolectó el sobrenadante. Los compuestos fenólicos totales fueron determinados usando floroglucinol (1,3,5-trihidroxibenceno, Sigma P-3502) como un estándar (Folin y Ciocalteu 1927).

 

Actividad de la fenolsulfatasa

La actividad de la enzima fenolsulfatasa en el talo de C. tamariscifolia se determinó colorimétricamente. Se incubaron aproximadamente 50 mg (peso húmedo) de tejido en 2.1 mL de tampón de ensayo (225 μL de MES-Tris 0.4 M, pH 6.2, 225 μL de sulfato de p-nitrocatecol 2.22 mM, 600 μL de H₂O) y H₂O (1:1) en la oscuridad durante 24 h a temperatura ambiente según Knöss y Glombitza (1993). La reacción se detuvo añadiendo tres gotas de NaOH 5 M. Se evaluó la absorbancia de la solución a 510 nm y se estimó la concentración de p-nitrocatecol con una curva estándar. Se calculó la actividad de la fenolsulfatasa (μmol nitrocatecol g^-1 PS h^-1) en cada sección de tejido de C. tamariscifolia.

 

Actividad antioxidante

Se evaluaron las actividades antioxidante y antirradical de los extractos mediante el método del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (Brand-Williams et al. 1995). Se adicionaron alíquotas de 300 μL de los extractos a una solución de 3 mL de DPPH (0.358 mM) en metanol al 90% (v/v). Las muestras se incubaron durante 1 h y se midió la absorbancia a 517 nm usando agua desmineralizada como blanco. La absorbancia fue transformada en un porcentaje de inhibición contra agua desmineralizada. Para determinar la concentración requerida para obtener un efecto antioxidante del 50% (EC₅₀), se diluyó la solución del extracto en metanol y se realizó el ensayo DPPH.

 

Excreción de compuestos fenólicos

Para evaluar el efecto de los niveles de PAR en la tasa de excreción de compuestos fenólicos y la actividad de la fenolsulfatasa, se incubó el tejido de C. tamariscifolia bajo diferentes intensidades de luz amarilla proporcionada por lámparas de sodio de baja presión (Philips, EUA, SOX bajo = 30 μmol m^-2 s^-1 y SOX alto = 360 μmol m^-2 s^-1). Los experimentos se realizaron en contenedores de acrílico (2 L, n = 3) en una cámara de crecimiento a 15 °C, manteniendo el tejido en suspensión constante mediante la introducción de burbujas de aire. Se tomaron muestras de agua después de 18, 24, 36, 48 y 60 h, y se determinó la aborbancia a λ = 266 nm (absorbancia máxima de floroglucinol, Waterman y Mole 1994). Se evaluó la concentración de fenoles excretados en el agua de mar mediante el coeficiente de extinción molar de floroglucinol en agua de mar (ε = 0.00169 M cm^-1). La concentración molar se determinó con la siguiente ecuación:

donde C es la concentración de fenoles (M), A₂₆₆ es la absorbancia a 266 nm, ε es el coeficiente de extinción molar de floroglucinol en agua de mar y L es la longitud de paso de la luz de la cubeta de cuarzo. Se expresó la concentración de compuestos fenólicos excretados en el agua de mar en mM.

 

Análisis estadísticos

Las diferencias significativas entre la concentración de compuestos fenólicos y la actividad antioxidante y de la fenolsulfatasa en C. tamariscifolia fueron analizadas mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) después de comprobar la normalidad y homocedasticidad de los datos (Sokal y Rohlf 1995). Se determinaron las diferencias de las concentraciones en las secciones específicas de los talos mediante la prueba post hoc de Newman-Keuls, con un nivel de significancia de P < 0.05. La significancia de la correlación entre el contenido fenólico y la actividad antioxidante y entre el contenido fenólico y la actividad de la fenolsulfatasa se verificó mediante correlaciones producto-momento de Pearson. Se estableció un nivel mínimo de significancia de P < 0.05.

 

RESULTADOS

Contenido fenólico y actividad de la fenolsulfatasa

La concentración de los compuestos fenólicos en las diferentes secciones del talo de C. tamariscifolia mostró diferencias significativas (P < 0.05, fig. 1). La concentración de los compuestos fenólicos fue de dos a cuatro veces mayor en la sección apical que en las secciones media y basal. La actividad de la fenolsulfatasa también mostró diferencias significativas entre las muestras de tejido de C. tamariscifolia (P < 0.05, fig. 1), observándose la mayor actividad (P < 0.05) en la sección apical (900 μmol nitrocatecol g^-1 PS h^-1) y la menor en la sección basal.

 

Capacidad antioxidante

Se observaron diferencias significativas (P < 0.05) en la capacidad antioxidante entre las tres secciones del talo de C. tamariscifolia (fig. 2), siendo mayor en la sección apical y cinco veces menor (P < 0.05) hacia la sección basal. Se observó una correlación positiva y significativa (P < 0.05) entre los niveles de compuestos fenólicos en el tejido y la actividad de la fenolsulfatasa, así como entre los niveles de compuestos fenólicos en el tejido y la capacidad antioxidante (fig. 3). La actividad de la fenolsulfatasa y la capacidad antioxidante fueron menores en los tejidos con menores niveles de compuestos fenólicos y fueron mayores en los tejidos con mayores niveles de compuestos fenólicos.

 

Irradiación y excreción de fenoles

Se observó una correlación positiva y significativa (P < 0.05) entre la dosis de radiación integrada y la excreción de fenoles, y entre la dosis de radiación integrada y la actividad de la fenolsulfatasa (fig. 4). La actividad de la fenolsulfatasa y la excreción de compuestos fenólicos fueron menores a dosis integradas bajas y mayores a dosis integradas altas. Además, se observó un incremento de la excreción de compuestos fenólicos en función del tiempo cuando el tejido fue expuesto a luz SOX baja o alta (fig. 5); sin embargo, la tasa de excreción de compuestos fenólicos fue dos veces mayor (P < 0.05) en tejidos incubados con luz SOX alta que con luz SOX baja. Las tasas de excreción se mantuvieron constantes durante el periodo de incubación de 60 h.

 

DISCUSIÓN

Las algas marinas intermareales han desarrollado mecanismos para reducir el estrés causado por cambios en el régimen de luz y variaciones estacionales de la temperatura. Estos mecanismos de defensa incluyen la producción de antioxidantes, la captación de radicales libres mediante compuestos fenólicos, y/o enzimas antioxidantes (Jiménez-Escring et al. 2001, Lohrmann et al. 2004, Zubia et al. 2009). En Chondrus crispus y Mastocarpus stellatus, por ejemplo, la actividad de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa, ascorbato peroxidasa y glutatión reductasa es mayor en invierno que en verano (Lohrmann et al. 2004). Esto sugiere que las algas responden al incremento en la producción de especies reactivas del oxígeno aumentando la producción de enzimas antioxidantes y compuestos fenólicos. Cystoseira tamariscifolia del sur de España también está expuesta a grandes fluctuaciones de luz, radiación UV y temperatura a lo largo del año (Hader et al. 1997), y es probable que también experimenta variaciones estacionales de compuestos y enzimas antioxidantes, como ha sido documentado para algas de Bretaña, Francia (Connan et al. 2007).

Se ha demostrado que el contenido de compuestos fenólicos varía entre especies así como entre las secciones del talo de diferentes especies. En Ascophyllum nodosum se ha observado una mayor concentración de compuestos fenólicos en la sección apical que en las secciones media y basal del talo (Geiselman 1980). También se han documentado variaciones intratalo en dos especies de Sargassum y en el alga verde Dasycladus vermicularis a lo largo del año, observándose los niveles más altos en la sección apical y las concentraciones más bajas en la sección basal y el órgano de fijación (Rao y Untawale 1991, Pérez-Rodríguez et al. 2001). En el presente estudio, el contenido de compuestos fenólicos en el talo de C. tamariscifolia también fue mayor en la sección apical que en las secciones media y basal. Cystoseira tamariscifolia crece en bosques densos que proporcionan autosombra a las secciones media y basal del talo; por lo tanto, es probable que el mayor contenido de polifenoles en la sección apical de esta especie se debe a una mayor exposición a radiación UV y PAR en comparación con las secciones media y basal.

Asimismo, se han registrado variaciones en el contenido de fenoles en el alga parda Macrocystis integrifolia, las cuales se han relacionado con un aumento en los niveles de luz solar y radiación UV (Swanson y Druehl 2002). En C. tamariscifolia, Abdala-Díaz et al. (2006) encontraron que los niveles de compuestos fenólicos son bajos en la mañana y aumentan progresivamente durante el día. Esto sugiere una relación entre la fotoregulación de la producción de fenoles y la radiación acumulativa durante la exposición.

La desulfuración de polifenoles por la fenolsulfatasa ha sido observada en varias especies (Abdala-Díaz 2001). Se ha encontrado que esta desulfuración se correlaciona con la excreción de fenoles libres cuando las algas están expuestas a condiciones de estrés como la radiación solar en verano. Como también se ha mostrado en otros estudios, el contenido fenólico y la actividad de la fenolsulfatasa incrementan en C. tamariscifolia cuando es incubada bajo altos niveles de PAR. Craigie y McLachlan (1964) analizaron el efecto de temperatura, pH, salinidad y luz en la coloración del agua por puntas cortadas de Fucus vesiculosus y encontraron que esta especie excretó aproximadamente 0.25% de su peso seco como flavonoides después de 10 h a 20 °C. Asimismo, F. vesiculosus puede excretar al menos 0.05% de su peso seco como material fenólico en un periodo de 24 h a 6-7 °C (Sieburth y Jensen 1969). Estos autores también observaron un aumento de material fenólico al incrementar la salinidad del agua. Nuestros resultados muestran que la excreción de compuestos fenólicos aumenta en tejido expuesto a niveles altos de PAR. Estos resultados sugieren que la excreción de compuestos fenólicos puede funcionar como un mecanismo de protección proporcionando un filtro de radiación en las inmediaciones de los talos de C. tamariscifolia.

Los compuestos fenólicos y los aminoácidos tipo micosporina funcionan como un mecanismo de defensa contra altos niveles de luz en varias algas marinas (Korbee et al. 2006). En C. tamariscifolia, la porción apical del talo queda expuesta a mayores niveles de radiación, mientras que la sección basal está fija al sustrato y protegida de altos niveles de PAR (Abdala-Díaz 2001). En estas circunstancias la sección apical del talo necesitaría una mayor protección contra el fotodaño. Los mayores niveles de compuestos fenólicos en la sección apical son consistentes con una mayor exposición a radiación. Además, la correlación entre la dosis de radiación integrada y la excreción de fenoles indica que hay una respuesta rápida a un incremento en los niveles de luz.

El contenido de fenoles en el talo es un balance entre la síntesis y la excreción. Se han descrito dos diferentes fracciones internas de florotaninos: una fracción soluble en los fisoides del citoplasma y una fracción insoluble unida a la pared celular (Koivikko et al. 2005, Gómez y Huovinen 2010). La proporción de excreción y florotaninos solubles e insolubles puede ser afectada por procesos morfofuncionales intrínsecos y el proceso de aclimatación estacional (Gómez y Huovinen 2010). En Lessonia nigrescens, durante el verano cuando las algas están expuestas a altos niveles de radiación UV, se inducen los florotaninos solubles y se observa una alta tasa de excreción, mientras que su transición a florotaninos insolubles puede estar relacionada con requerimientos de crecimiento ya que el alargamiento de las hojas sucede durante esta temporada (Gómez y Huovinen 2010).

La correlación positiva entre el contenido de compuestos fenólicos en los tejidos y la actividad antioxidante de C. tamariscifolia sugiere que los compuestos activos en los extractos de las secciones del talo son principalmente sustancias fenólicas. Esto coincide con otros estudios que muestran que la actividad antioxidante de los extractos medidos mediante el método de DPPH se relaciona estrechamente con el contenido fenólico de algas pardas (Jiménez-Escring et al. 2001). También se ha observado una relación entre las coumarinas y la actividad antioxidante en el alga verde D. vermicularis (Pérez-Rodríguez et al. 2001).

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España (proyecto CGL08-05407-C03-01). El primer autor agradece la Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo. Los autores agradecen el uso de las facilidades de la Delegación Provincial (Consejería de Medio Ambiente, Junta de Andalucía) en el Parque Natural Cabo de Gata-Níjar.

 

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Nota

Traducido al español por Christine Harris.