Variaciones en el crecimiento y toxicidad en Gymnodinium catenatum Graham del golfo de California bajo diferentes proporciones de nitrógeno y fósforo*

 

Variations in growth and toxicity in Gymnodinium catenatum Graham from the Gulf of California under different ratios of nitrogen and phosphorus

 

JJ Bustillos–Guzmán^1*, CJ Band–Schmidt², DJ López–Cortés¹, I Gárate–Lizárraga², EJ Núñez–Vázquez¹, FE Hernández–Sandoval¹

 

¹ Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, Apdo. postal 128, CP 23000 La Paz, Baja California Sur, México. * Corresponding author. E–mail: jose04@cibnor.mx

² Departamento de Plancton y Ecología Marina, Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas–Instituto Politécnico Nacional, Apdo. Postal 592, CP 23000 La Paz, Baja California Sur, México.

 

Received December 2010
Received in revised form November 2011
Accepted November 2011

 

RESUMEN

Se sometió a una cepa de Gymnodinium catenatum Graham (GCCV–7), aislada del golfo de California, a diferentes proporciones de nitrógeno y fósforo (5.4, 9.2, 23.5, 44.7 y 74.3) para determinar el efecto de estas proporciones en el crecimiento, toxicidad y variaciones en el perfil de toxinas. No se encontraron diferencias en la toxicidad ni en el perfil de toxinas entre los tratamientos. Sin embargo, la mayor densidad celular se presentó en la proporción de N:P de 23.5:1 con 33% más células que en los tratamientos N:P de 44.5:1 y 74.3:1, los cuales a su vez presentaron 34% y 30% más células que en los tratamientos 5.4:1 y 9.2:1. El contenido de total de toxinas por célula y la variación en el perfil de toxinas estuvo claramente relacionado con las tasas de crecimiento. La toxicidad se mantuvo relativamente constante debido, principalmente, a los cambios en el perfil que al contenido celular de toxinas en las diversas estapas de crecimiento. Estos datos sugieren que los cambios en la proporción de N:P no estimulan la producción de toxinas ni cambios en el perfil de toxinas paralizantes, pero sí afectan la densidad celular, y que la dinámica celular de toxinas está relacionada con la fase de crecimiento.

Palabras clave: Gymnodinium catenatum, nitrógeno, fósforo, toxinas, golfo de California.

 

ABSTRACT

A strain of Gymnodinium catenatum Graham (GCCV–7), isolated from the Gulf of California, was submitted to conditions with different nitrogen–to–phosphorus ratios (5.4, 9.2, 23.5, 44.7, and 74.3) to determine the effect of these ratios on the growth, toxicity, and variations in toxin profile. No differences in toxicity and toxin profile were found among the treatments. Highest cell density occurred at the N:P ratio of 23.5:1, yielding 33% more cells than the 44.5:1 and 74.3:1 treatments, which in turn had 34% and 30% more cells than the 5.4:1 and 9.2:1 treatments. Toxin cell quota and variations in toxin composition were clearly related to growth rates. Toxicity remained relatively invariable because of changes in toxin composition rather than changes in the toxin cell quota during the different growth stages. The data suggest that changes in the N:P ratios do not stimulate production of toxins or changes in toxin profiles, but do affect cell density, and that cellular toxin dynamics is related to the growth stage.

Key words: Gymnodinium catenatum, nitrogen, phosphorus, toxins, Gulf of California.

 

INTRODUCCIÓN

El golfo de California ha sido reconocido como una zona altamente productiva donde ocurren procesos físicos que enriquecen las aguas superficiales con nutrientes (Zeitzschel 1969, Álvarez–Borrego y Lara–Lara 1991). Además de estos eventos físicos, las aportaciones antropogénicas de nutrientes son importantes y provienen principalmente de ríos y actividades de agricultura (Páez–Osuna 2001, Miranda et al. 2009). El incremento en la concentración de nutrientes y el desbalance de sus proporciones en áreas costeras se refleja en el incremento y la selectividad de organismos autótrofos (Lancelot et al. 1987, Hodgkiss y Ho 1997).

Gymnodinium catenatum Graham es un dinoflagelado desnudo que produce toxinas paralizantes, con una amplia distribución geográfica (Oshima et al. 1993; Negri et al. 2001; Holmes et al. 2002; Band–Schmidt et al. 2006, 2010). A lo largo de la costa del Pacífico mexicano, G. catenatum es una especie conspicua y responsable de la formación de florecimientos algales nocivos en áreas como bahía de Mazatlán (Mee et al. 1986, Cortés–Altamirano y Núñez–Pasten, 1992), bahía de Manzanillo (Morales–Blake et al. 2000), bahía de Acapulco (Licea et al. 1999), las costas de Oaxaca (Saldate–Castañeda et al. 1990, 1991), entre otras. La proliferación de esta especie en el Pacífico mexicano se ha relacionado principalmente con ambientes eutrofizados de zonas costeras y de surgencia (Bravo et al. 1990, Cortés–Altamirano y Núñez–Pasten 1991, Alonso–Rodríguez 2004, Alonso–Rodríguez y Ochoa 2004, Band–Schmidt et al. 2010, Quijano–Scheggia et al. 2012). En el golfo de California, particularmente en la bahía de Mazatlán, los promedios anuales de nitrato entre 1 y 10 m de profundidad han incrementado de ~0.7 a 3.16 µM durante un periodo de 15 años (1980–1995). Asimismo, las proporciones de N:P incrementaron de valores menores que 2 a valores entre 15 y 25 (Mee et al. 1986, García de La Parra 1995, Alonso–Rodríguez 1998). Este incremento está relacionado con la mayor concentración de nitrato, ya que los fosfatos permanecieron en alrededor de 0.8 µM. En contraste, en la bahía de La Paz, que presenta condiciones mesotróficas y proporciones de N:P de 2.1 (López–Cortés et al. 2006), esta especie también está presente pero generalmente en densidades bajas (<100 células mL^–1) (Gárate–Lizárraga et al. 2009, Hernández–Sandoval et al. 2009). Estos datos sugieren que la alta concentración de nutrientes y las altas proporciones de N:P promueven el crecimiento de G. catenatum. Las cepas mexicanas de G. catenatum tienen toxicidad moderada y porcentajes elevados (81–86%) de toxinas sulfocarbamatadas (toxinas tipo C) junto con derivados de decarbamatadas (6.5–8.8%) (Band–Schmidt et al. 2005, 2006). Se han observado variaciones en el perfil de toxinas con el medio de cultivo, edad del cultivo y origen de la cepa (Band–Schmidt et al. 2005, 2006); sin embargo, se requiere mayor información para comprender el efecto de las variables ambientales en la producción de toxinas en cepas de G. catenatum del golfo of California. Debido a que la saxitoxina y sus análogos son moléculas ricas en nitrógeno (ca. 30% por peso) y que se puede encontrar entre el 5% y 10% del total del nitrógeno celular en G. catenatum (Flynn et al. 1996), se ha propuesto que estas toxinas pueden ser un almacenamiento de nitrógeno (Cembella y John 2006).

En este estudio se simularon diferentes proporciones de N:P para analizar su efecto en el crecimiento, la toxicidad y el perfil de toxinas de una cepa de G. catenatum aislada del golfo de California. Esperaríamos que en altas proporciones de N:P habría un mayor crecimiento y cambios en el perfil de toxinas.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento y cultivo de G catenatum

Se recolectaron células vegetativas de G. catenatum de bahía Concepción, golfo de California, mediante arrastres verticales con una red de fitoplancton de 20 µm. El concentrado celular se tamizó a través de una malla de 60 para eliminar organismos de mayor tamaño. Este concentrado se colocó en un recipiente de cultivos de tejidos de 250 mL con agua de mar enriquecida con medio de cultivo GSe (Doblin et al. 2000). En el laboratorio, las células vegetativas de G. catenatum se aislaron con pipetas capilares adelgazadas bajo un microscopio invertido (Carl Zeiss Axiovert 100). Las células individuales y cadenas se transfirieron a placas de 96 pocillos con medio f/2, modificado por la adición de H₂SeO³ (10^–8 M) y por la reducción de CuSO₄ a 10^–8 M, y se colocaron a 20 ± 1 °C con una iluminación de 150 µmol fotón^–1 m^–2 s^–1 utilizando lámparas fluorescentes de luz de día en un ciclo de luz:oscuridad 12:12 en condiciones no axénicas. Se utilizó la cepa clonal GCCV–7 de G. catenatum para los experimentos, que se ha mantenido en nuestro laboratorio desde el año 2000. Los detalles del aislamiento de la cepas y condiciones de mantenimiento se pueden ver en el archivo de la Colección de Dinoflagelados Marinos (CODIMAR) del CIBNOR, La Paz, México (http://www.cibnor.mx/colecciones/codimar/icodimar.php) y en Band–Schmidt et al. (2005).

Diseño experimental

En el día 0 un cultivo en fase exponencial de crecimiento se utilizó como inóculo en cultivos de lote con proporciones de N:P de 5.4, 9.2, 23.5, 44.7 y 74.3 (por triplicado). Las cinco proporciones de N:P se iniciaron adicionando un inóculo de 50 mL de G catenatum (2.068 × 10⁵ células) a 350 mL de agua de mar enriquecida con medio f/2 modificado a matraces de Pyrex de 500 mL. Las concentraciones finales de NO₃ y PO₄ y las proporciones N:P se muestran en la tabla 1. Las condiciones de cultivo fueron las descritas anteriormente (ver aislamiento y cultivo de G. catenatum). Cada segundo día hasta el día 16 de crecimiento, entre 09:00 y 10:00, se tomaron muestras de 45 mL para realizar los conteos celulares, la determinación de peridinina y nutrientes (nitrato y fosfatos), y el análisis de toxinas. Los cultivos se agitaron suavemente antes de tomar las muestras. Para el análisis de peridinina y toxinas, se tomaron 20 mL del cultivo y se concentraron por filtración a través de filtros GF/F y se congelaron inmediatamente a –40 °C hasta su análisis. Para el análisis de nutrientes se filtró el medio de cultivo (40 mL) (ver detalles más adelante). El resto del cultivo (5 mL) se preservó con una solución de Lugol para conteos celulares. La densidad celular se estimó mediante una cámara para microscopio invertido de 5 mL (Zeiss, Alemania). Los conteos celulares se realizaron por duplicado (ver tasas de crecimiento). El resto de los datos de este estudio fueron el promedio de tres cultivos independientes bajo la misma proporción de N:P. Los diferentes tratamientos N:P (tabla 1) se nominaron como T1, T2, T3, T4 y T5 para las proporciones de N:P de 5.4, 9.2, 23.5, 44.7 y 74.3, respectivamente.

Nutrientes

Los nutrientes (NO₃ y PO₄) se determinaron de acuerdo con Strickland y Parsons (1972), con un autoanalizador de flujo contínuo de iones (Lachat Instruments QuikChem 8000).

Extracción y análisis de toxinas

La extracción de toxinas se realizó adicionando 2 mL de ácido acético (0.03N) a cada muestra, sonicando (35 kHz) por 5 min en un baño de hielo y clarificando por centrifugación (3000 rpm por 5 min). El sobrenadante se filtró con una jeringa con filtro (0–45 µm) de un solo uso. Una alícuota (150 µL) del extracto clarificado se utilizó para la hidrólisis con HCl (1M) para transformar a toxinas decarbamamatadas (tipo B y C) a sus análogos. Finalmente, se inyectaron 10 de ambos extractos (con y sin hidrólisis) en el sistema de HPLC (HP 1100). La cromatografía se llevó a cabo como lo sugerido por Hummert et al. (1997) y Yu et al. (1998). Brevemente, se utilizó un gradiente amortiguado de pares de iones (ion–pair buffer), compuesto de una solución de ácido octanosulfónico y fosfato de amonio a un pH de 6.9 y acetonitrilo, para separar las toxinas paralizantes. Después de una oxidación postcolumna con ácido periódico alcalino, los productos resultantes se detectaron con un detector de fluorescencia (HP 1116) a una longitud de onda de 330 nm (excitación) y de 395 nm (emisión). La identificación de toxinas se llevó a cabo comparando cromatogramas de muestras de estándares (National Research Council, Canadá). La cuantificación de toxinas se llevó cabo comparando áreas de picos de extractos de estándares con el correspondiente factor de respuesta. Los límites de detección de las diversas toxinas fueron 247, 10, 17, 218, 77, 16 y 7 pg para GTX1–4, neosaxitoxina, dc–saxitoxina y saxitoxina, respectivamente (Yu et al. 1998).

Tasas de crecimiento

Los conteos para cada tratamiento se relacionaron con los datos de peridinina, determinados por HPLC de acuerdo con Vidussi et al. (1996), para obtener la ecuación de regresión. Todos los coeficientes de regresión (r) fueron mayores que 0.90 (tabla 2). La ecuación resultante (tabla 2) se utilizó para calcular la densidad celular en todos los tratamientos utilizando el contenido de peridinina. Con estos datos, se determinaron las tasas de crecimiento para cada curva de crecimiento para el periodo en que se alcanzó la máxima densidad celular (fase de crecimiento exponencial) y para cada segundo día (tasa de crecimiento diario) de acuerdo con la siguiente ecuación (Guillard 1973):

donde N₂ y N₁ son las concentraciones celulares al final (t₂) y al inicio (t₁) de un periodo de tiempo, Δt es t₂ – t₁.

Análisis estadísticos

Las diferencias en las tasas de crecimiento en los diferentes tratamientos se determinaron con una prueba de análsis de varianza (ANDEVA). Para determinar el efecto del factor principal (proporción N:P) a cada tiempo y en cada variable respuesta, se aplicó un ANDEVA de una sola vía. Para probar la normalidad de los datos se utilizó la prueba de Kolvorov–Smirnof. Si los datos no fueron normales se transformaron a logaritmo. Los análisis se realizaron utilizando el software Statistica v5.0 (StatSoft, Inc.) con un nivel mínimo de significación de α = 0.05. Los datos de toxinas paralizantes de las cepas se analizaron expresados en porcentaje molar (% mol). Estos datos se emplearon para elaborar un dendrograma de similitud de Bray Curtis utilizando el programa BioDiversity Professional Beta v2 (McAleece 1997). Se realizaron análisis de regresión y correlación entre tasas de crecimiento y toxicidad, contenido celular de toxinas y perfil de toxinas (% mol) agrupando las toxinas carbamatadas, decarbamatadas y sulfo–carbamatadas. Se consideraron que presentaban relaciones significativamente diferentes si a era igual o menor que 0.05.

 

RESULTADOS

Variación de los nutrientes en el cultivo

El PO₄ disminuyó constantemente en los tratamientos con mayor proporción de N:P hasta alcanzar niveles fuera del intervalo de detección a los días 6 (T4 y T5) y 8 (T3) (fig. 1a). En T1 y T2, el PO₄ decayó de manera regular hasta el octavo día y luego se mantuvo relativamente constante. Para T1 y T2, la concentración de PO₄ luego del octavo día fue de 8.7 and 22.1 µoM, respectivamente.

El contenido de NO₃ también disminuyó de manera constante en todos los tratamientos y alcanzó su valor mínimo del octavo día en adelante (fig. 1b). En T5, el NO₃ no se agotó del medio y quedó un valor mínimo de 40 µM. Por lo tanto, el nitrógeno fue limitante en los cultivos con las proporciones de N:P más bajas (T1 y T2) después de los días 8 y 10, y después del día 12 en T3 y T4. Es interesante que el NO₃ continuó disminuyendo aun cuando el PO4 se había agotado o bien permanecía casi constante en el medio. Esto sugiere que las células de G. catenatum continuaron asimilando nitrato del medio.

Tasas de crecimiento

Todos los cultivos presentaron la típica curva de crecimiento, con una fase de aclimatación corta, en caso de presentarse, seguida de una clara fase logarítmica hasta el día 8 de cultivo en los tratamientos de menor proporción de N:P (T1 y T2), y hasta el día 10 en el resto de los cultivos (fig. 2). La fase estacionaria no fue muy clara ya que se observó que la fase de decaimiento se presentó rápidamente después de alcanzar la máxima densidad celular.

Las tasas de crecimiento exponencial variaron entre 0.20 y 0.24 d^–1 (tabla 3). Los análisis estadísticos mostraron que no hubieron diferencias en las tasas de crecimiento entre los tratamientos. Sin embargo, al considerar el número máximo de células para cada tratamiento, T3 (5852 cél mL^–1) tuvo una densidad casi dos veces mayor que T1 y T2 (2553 cél mL^–1).

En el caso de los tratamientos T4 y T5, las densidades oscilaron entre 3600 y 3800 cél mL^–1. No se encontraron diferencias estadísticas en los máximos celulares entre T3 y el resto de los tratamientos. Tampoco se encontraron diferencias entre las densidades de T1 y T2 ni entre T4 y T5. Las tasas de crecimiento calculadas para cada dos días oscilaron (datos no mostrados) entre –0.5 y 0.45 d^–1.

Toxicidad

Los valores iniciales de toxicidad en todos los tratamientos fueron de 21.75 ± 2.93 pg STXeq. célula^–1. En general, los datos de toxicidad no mostraron una variación clara durante el periodo experimental (fig. 3). No se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos, excepto el día 12, en T3, cuando los valores fueron menores que en T1, T4 y T5. En todos los tratamientos se notó una tendencia ligera a disminuir la toxicidad desde el inicio del cultivo hasta los días 10 y 14, notándose una disminución de casi la mitad del valor inicial (10 pg STXeq. célula^–1). Al final del experimento, se observó un incremento en la toxicidad total con valores de entre 20 y 31 pg STXeq. célula^–1; sin embargo, esta diferencia no fue significativa entre los tratamientos.

Perfil de toxinas

Se detectaron nueve análogos de la saxitoxina (STX, NeoSTX, dcSTX, dcGTX2–3, B1–2 y C1–3). Considerando su peso, al tiempo 0, la concentración de las toxinas carbama–tadas, decarbamatadas y sulfocarbamatadas fue de 10.1, 3.0 y 119.0 pg célula^–1, respectivamente (fig. 4). No se observaron diferencias claras en el perfil de toxinas entre los tratamientos con la edad del cultivo. Cuando se considera la edad del cultivo, se nota una tendencia a disminuir en las toxinas sulfocarbamatadas hasta casi a la mitad (50 pg célula^–1) entre los días 10 y 14 (fig. 4c). Para el caso del grupo de las carbamatadas, la tendencia a disminuir fue clara entre el día 10 y 14 (fig. 4a), y luego las concentraciones se mantuvieron oscilando hasta el día 14 para luego incrementarse al día 16. La concentración de las toxinas decarbamatadas se mantuvo constante hasta el día 8, luego oscilaron y aumentaron hacia el final del experimento (fig. 4b).

Si consideramos el porcentaje molar de las toxinas, las toxinas sulfocarbamatadas fueron las más abundantes, en particular las del tipo B1–2 (fig. 5c), seguidas de las carbamatadas (STX y NeoSTX) (fig. 5a). El primer grupo representó más del 80% durante los primeros 6 y 8 días de cultivo y después disminuyó, con una contribución de hasta el 60% del total de toxinas hacia el final de los experimentos (fig. 5c). Opuesto al grupo de las sulfocarbamatadas, la contribución de las carbamatadas y decarbamatadas fue baja en los primeros días de cultivo y más alta, con una contribución de entre 15 y 25%, respectivamente, cuando el cultivo se avejentó (fig. 5 a, b).

Cuando se utilizó la abundancia de toxinas (mol %) para construir un dendrograma de similitud, no se observaron diferencias entre los tratamientos (datos no mostrados), pero sí con la edad del cultivo (fig. 6). Se evidenciaron dos grupos y se separaron las muestras recolectadas entre los días 2 y 8, y las muestras recolectadas entre los días 10 y 16, con un 81% de similitud.

Relación entre la tasa de crecimiento y la toxicidad, el contenido de toxinas y el perfil de toxinas

Las tasas de crecimiento y la toxicidad no fueron significativas (fig. 7a), pero sí entre la tasa de crecimiento y el contenido celular de toxinas (fig. 7b). Considerando la composición de toxinas (% mol), se observó una relación negativa entre las tasas de crecimiento y el grupo carbamatado y el decarbamatado (fig. 8a, b), y una relación positiva con el grupo de las sulfocarbamatadas (fig. 8c).

 

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos no muestran efectos importantes en la toxicidad y el perfil de toxinas bajo los diversos tratamientos de N:P; sin embargo, sí se observan cambios en las densidades del dinoflagelado. La variación en la toxicidad y el perfil de toxinas parece estar más relacionada con los cambios fisiológicos de las células durante las diferentes fases de crecimiento (variación de la etapa de crecimiento) como lo han sugerido varios autores (Anderson et al. 1990, Band–Schmidt et al. 2006). Antes de abordar la discusión de estos resultados de manera más particular, se discuten en un contexto general y en referencia a resultados previos sobre crecimiento y toxinas de otras cepas productoras de toxinas paralizantes.

Comparando el crecimiento, la toxicidad y el perfil de toxinas con otras cepas de G. catenatum aisladas del golfo de California y mantenidas en el mismo medio de cultivo tenemos que son muy similares a otros resultados (Band–Schmidt et al. 2004, 2005, 2006; Gárate–Lizárraga et al. 2005): tasas de crecimiento y toxicidad moderadas y una dominancia de las toxinas sulfocarbamatadas seguidas de las carbamatadas, con un cambio en el perfil de las toxinas relacionado con la edad del cultivo y la longitud de las cadenas. Sin embargo, cuando se comparan con cepas cultivadas en medios diferentes (Band–Schmidt et al. 2004), las toxicidades encontradas en este estudio fueron relativamente mayores durante las fase exponencial (tabla 3).

Los dinoflagelados productores de toxinas paralizantes parecen tener una producción mayor de toxinas por célula durante la fase exponencial de crecimiento (Ianora et al. 2006). Sería interesante ver si esta mayor producción de toxinas encontrada también en G. catenatum es un factor determinante para favorecer su proliferación en condiciones naturales como lo ha sugerido Ianora et al. (2006).

La concentración de nitrato en el medio disminuyó continuamente con la edad del cultivo y continuó disminuyendo aún cuando el fósforo se agotó en el medio en los tratamientos con la mayor proporción de N:P o cuando el fosfato permaneció casi constante (fig. 2). Lo contrario, la disminución de fósforo cuando el nitrógeno se agotó, no se observó. El fosfato del medio disminuyó a una tasa mayor en todos los tratamientos entre el cuarto y el octavo día de cultivo. En el tratamiento de N:P de 74.3, la concentración de fosfato se mantuvo constante después del octavo día. Ambos nutrientes, NO₃ y PO₄, están relacionados con la producción de saxitoxina en los dinoflagelados. Una explicación lógica para la disminución continua del nitrógeno del medio podría ser que, debido a que el nitrógeno puede ser almacenado en las vacuolas, éste continuó siendo asimilado por la célula y almacenado para posteriormente ser excretado al medio en forma de aminoácidos libres, como se ha descrito para otras especies de fitoplancton (Zehr y Falkowsky 1988; Flynn et al. 1993, 1996). Experimentalmente, también se ha demostrado que, durante la síntesis de toxinas, se puede utilizar nitrógeno celular reciclado y no sólo el nitrógeno inorgánico recientemente incorporado (Anderson et al. 1990, John y Flynn 2000). Algunos aminoácidos (licina, arginina, acetato, etc.) forman parte intermedia en la producción de la saxitoxina (Flynn et al. 1994, Shimizu 1996, Ishida et al. 1998, Kellmann y Neilan 2007), por lo que, bajo estrés de nitrógeno, se puede presentar una disminución de la producción de esta toxina en los dinoflagelados (Flynn et al. 1994). También la deficiencia de fósforo en el medio se ha asociado a una alta producción de saxitoxina en los dinoflagelados (Wang y Hsieh 2002). Si bien la saxitoxina y sus análogos no tienen fósforo en su estructura, la enzimas encargadas de la fosforilación (e.g., la carbamoil fosfatasa) y productos metabólicos intermedios en la producción de saxitoxina sí lo contienen, por lo que el estrés de fósforo también puede afectar la producción de éstas toxinas (Flynn et al. 1994, Cembella 1998, Kellmann y Neilan 2007). Estos mecanismos de estrés de fósforo y nitrógeno en el metabolismo de la saxitoxina, sin embargo, no son aplicables a todos los dinoflagelados. La disminución de nitrógeno y fósforo del medio demuestran también su alta tasa de afinidad del dinoflagelado hacia estos nutrientes, como lo han registrado Yamamoto et al. ( 2004). En una cepa japonesa de G. catenatum, por ejemplo, se encontró una tasa de afinidad de 6.48 µM para el NO₃ y de 1.42 µM para el PO₄ (Yamamoto et al. 2004). Nuestros resultados no muestran cambios importantes en el contenido celular de toxinas ni en el perfil de éstas, quizás debido a que G. catenatum tiene una alta capacidad de almacenar fósforo y nitrógeno bajo condiciones de inanición y emplearlos para mantener el crecimiento y la síntesis de toxinas. Otra posibilidad sería que las toxinas son utilizadas como reservorios de nitrógeno, ya que se observó que cuando el nitrógeno y el fósforo (cultivos viejos) disminuyeron, el contenido celular de toxinas aumentó (Boyer et al. 1987).

El contenido celular de toxinas varió en todos los tratamientos, aunque los valores se mantuvieron dentro del intervalo (13–47 pg STXeq. célula^–1) encontrado en otros estudios para cepas aisladas de la misma área (Band–Schmidt et al. 2004, 2005, 2006). Nuestros resultados difieren de otros estudios, donde se han registrado toxicidades mayores para otras cepas de G. catenatum cultivadas en altas concentraciones de nitratos, entre 110 y 220 µm, debido a la alta producción de GTX6 (Reguera y Oshima 1990). La toxicidad por célula, en este y otros estudios (Band–Schmidt et al. 2004, 2006), fue mayor que aquellos registrados para poblaciones en condiciones naturales que se encuentran en promedio entre 1.2 (Gárate–Lizárraga et al. 2004) y 10.9 pg STXeq. célula^–1 (Quijano–Scheggia et al. 2012). A diferencia de estos resultados, se ha encontrado que las células de algunas especies productoras de toxinas paralizantes del género Alexandrium en cultivo son menos tóxicas que las de células del medio natural (White 1986, Cembella et al. 1990). De acuerdo con Cembella (1998), esto se debe a un artefacto que "fuerza" el crecimiento por la alta concentración de nutrientes, al relajamiento de la presión de selección a una producción de toxinas en condiciones naturales, a la mayor tasa de crecimiento (reducción de la tasa de toxinas o célula) y a la deriva genética en condiciones de cultivo que se expresa en una menor actividad de biosíntesis de las toxinas. En este contexto, se debe realizar un mayor número de mediciones de la toxicidad en condiciones naturales de G. catenatum en las costas del golfo de California a fin de probar si la baja toxicidad registrada es una característica de la población "mexicana" o si los valores bajos de toxinas encontrados por Gárate–Lizárraga et al. (2004) y Quijano–Scheggia et al. (2012) son una excepción.

Las variaciones nictimerales del contenido y producción de toxinas han sido demostradas para los dinoflagelados (Flynn et al. 1996, Taroncher–Oldenburg et al. 1997), y se han asociado a la fase M1 temprana de la división celular iniciada por la irradiancia (Taroncher–Oldenburg et al. 1997). Por ello, es posible suponer que nuestras mediciones en cultivos en lote reflejan la toxicidad y los perfiles de toxinas de las células bajo diversas fases de crecimiento, y que estas mediciones son comparables entre sí debido a que se siempre se muestreó a la misma hora del día. Los resultados del contenido celular de toxinas apoya el trabajo de Flynn et al. (1996), quienes también muestran cambios pequeños en este parámetro en una cepa de G. catenatum de origen español sometida a estrés de nitrógeno y fósforo. No fueron evidentes los cambios en el perfil de toxinas en nuestros resultados, lo que sugiere que las cepas del "golfo de California" se comportan igual bajo las diferentes condiciones de N:P a las que se sometieron. No es posible hacer una comparación directa de nuestros resultados del perfil de toxinas (% mol) con los de Flynn et al. (1996), ya que el factor de respuesta utilizado por estos autores fue el de la saxitoxina para todos los análogos.

Se observaron cambios importantes (tanto en peso como en moles) en todos los tratamientos con la edad de cultivo (fig. 4, 5). El dendrograma de similitud, considerando este parámetro, también agrupó a todos los cultivos hasta el día 8 y a aquellos de entre el día 10 y 16 (fig. 6). Así, el perfil de toxinas fue similar durante los primeros días de cultivo, pero luego se observó un incremento en las toxinas de los grupos carbamatado y decarbamatado, y una disminución del grupo sulfocarbamatado, en particular la C1 y C2. Esta dinámica sugiere que existe una eliminación selectiva de las toxinas más complejas y/o una transformación de las toxinas más complejas (menos potentes) hacia las menos complejas pero de mayor potencia (toxinas carbamatadas y decarbamatadas). Esto concuerda con otros resultados para otras cepas de G. catenatum aisladas del golfo de California y cultivadas en medio GSe (Band–Schmidt et al. 2006).

Al décimo día, los cultivos presentaron la densidad celular máxima y algunos se encontraban en la fase de decadencia (T1 y T2) (fig. 2), lo que sugiere una limitación por nutrientes y la consiguiente disminución de la tasa de crecimiento. En esta fase de decadencia se observa la disminución de las toxinas tipo B y C, y el incremento de los otros análogos de la saxitoxina (fig. 4, 5). El análisis de regresión entre las tasas de crecimiento y los porcentajes molares muestra también esta asociación (fig. 7), y sugiere que la dinámica de las toxinas es dependiente de la tasa de crecimiento. Nuestros resultados muestran claramente que, aunque hay una dinámica importante en las toxinas con las fases de crecimiento, la toxicidad se mantiene más o menos constante. Esto pudiera deberse a la dinámica de las toxinas de baja y alta potencia: el bajo o nulo crecimiento induce una baja proporción de las toxinas menos potentes, mientras que con un crecimiento alto se favorece la producción de las toxinas de mayor potencia. Estos resultados también sugieren que el crecimiento bajo o nulo de G. catenatum favorece la producción de las toxinas más potentes, manteniéndose una toxicidad relativamente constante.

También es posible que la baja variación en la toxicidad y en el perfil de toxinas observada en este estudio sea una consecuencia del poco tiempo de aclimatación de la cepa a los diversos tratamientos. Sin embargo, Hernández–Sandoval (2010) aclimató otras cepas de G. catenatum, aisladas del golfo de California, al menos por cuatro ciclos celulares a varias condiciones de N:P y también observó cambios pequeños en la toxicidad y en el perfil de toxinas. Estos resultados sugieren que G. catenatum del golfo de California sometido a cambios en las proporciones de N:P, sólo tienen efectos pequeños en la toxicidad y en el perfil de toxinas.

En síntesis, nuestro estudio muestra que, aunque la cepa no fue adaptada a los diversos tratamientos, excepto T3, nuestros resultados concuerdan con lo demostrado para otras cepas de ésta especie (Oshima et al. 1993, Flynn et al. 1996), donde se observó que la toxicidad y el perfil de las toxinas sufren pocos cambios. En este trabajo el grupo de las toxinas sulfocarbamatadas fue el más abundante seguido de las carbamatadas (principalmente NeoSTX), y coincide con trabajos previos en los que usaron cepas aisladas del golfo de California (Band–Schmidt et al. 2005, 2006). Claramente, G. catenatum puede crecer en un intervalo amplio de proporciones de N:P y mantener un crecimiento moderado y toxicidad similar. También es claro que las tasas altas de N:P pueden estimular la producción de una mayor biomasa celular, lo que coincide con datos del estado nutricional (eutróficos) de los lugares donde prolifera, y sugieren que estas condiciones favorecen su crecimiento. Las diferencias observadas en el perfil de toxinas con la fase de crecimiento parecen deberse a la interconversión o a la excreción selectiva de las toxinas menos potentes. Finalmente, es importante señalar que existen diferencias importantes en muchos parámetros fisiológicos y bioquímicos entre cepas de la misma especie aún siendo aisladas de la misma área (Wood y Leathan 1992, Burkholder y Gilbert 2006, Kodama 2010). Más aún, se han observado cambios importantes en la toxicidad a nivel de subcepas de Alexandrium tamarense (Ogata et al. 1987). Por lo tanto, nuestros resultados deben verse sólo como una contribución al conocimiento de la respuesta de la cepa "mexicana" de G. catenatum a los nutrientes. También el mantenimiento de esta cepa en condiciones de laboratorio por varios años tiene que tomarse en consideración para la inferencia de nuestros resultados a condiciones naturales. Con respecto a la presencia de neosaxitoxina, ésta también debe considerarse de manera tentativa ya que el método usado (Yu et al. 1998) no es tan eficiente en la separación de NeoSTX de la dcNEO (datos no mostrados). Recientemente, se encontró que una cepa del golfo de California no presentó neosaxitoxina (Bustillos–Guzmán etal. 2011).

El trabajo futuro en mayor número de cepas de la misma zona y otras áreas será útil para generar un patrón de respuesta, sí es que lo tiene, de G. catenatum a la variación de los nutrientes. Con los planes de desarrollo del golfo de California para uso recreacional y de producción acuícola, podrían esperarse cambios en los flujos de nutrientes en las áreas costeras y, por lo tanto, en los balances de nitrógeno y fósforo.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se realizó con el soporte financiero de proyectos institucionales (SIP 20110590, CICIMAR–IPN; PC3.1 y PC3.2, CIBNOR) y del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, proyectos SEP2007–84064, SNI2008–90102 y 61126). CJBS y IGL son becarios COFAA y EDI. Los autores agradecen a I Fogel y DW Johnson su ayuda en la edición en inglés de este trabajo, y a M Cerro su ayuda en el laboratorio. Agradecemos también a los revisores anónimos su ayuda para definir el análisis estadístico de los datos y su sugerencia sobre la reestructuración del artículo.

 

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NOTA

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