Aislamiento y prepurificación de los compuestos activos presentes en el veneno de Pelagia noctiluca (Scyphozoa: Pelagiidae) del Mar Caribe*

 

Isolation and prepurification of active compounds in venom from Pelagia noctiluca (Scyphozoa: Pelagiidae) from the Caribbean Sea

 

J Sánchez–Rodríguez*, NL Lucio–Martínez

 

Unidad Académica de Sistemas Arrecifales, Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Prolongación Niños Héroes s/n, Domicilio conocido, Puerto Morelos CP 77580, Quintana Roo, México.

 

*Corresponding author.
E–mail: judithsa@cmarl.unam.mx

 

Received October 2010
Accepted May 2011

 

RESUMEN

El extracto crudo de Pelagia noctiluca fue purificado mediante cromatografía de líquidos. Las fracciones aisladas se probaron en cangrejos de mar (Ocypode quadrata) y se observó la presencia de actividad neurotóxica. El contenido de proteína, cuantificada mediante el método de Bradford, en el extracto crudo fue 0.25 mg mL^–1. La técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida se empleó para determinar el peso molecular aparente de las diferentes fracciones del extracto crudo, y se identificaron varias bandas: 34, 48 y de 90 a 200 kDa. La unidad hemolítica en eritrocitos humanos del tipo A+ fue 100% con 1.1 µg mL^–1 y 50% con 0.98 µg mL^–1 del extracto crudo. El extracto crudo se observó bajo el microscopio y se encontraron tres tipos de nematocistos: heterotrico microbásico euritele, heterotrico isorriza y holotrico isorriza.

Palabras clave: aislamiento, Pelagia noctiluca, veneno, Mar Caribe.

 

ABSTRACT

Crude extract from Pelagia noctiluca was purified using liquid chromatography. The isolated fractions were tested in sea crabs (Ocypode quadrata) and neurotoxic activity was observed. The protein content of the crude extract, quantified by the Bradford method, was 0.25 mg mL^–1. Polyacrylamide gel electrophoresis was used to determine the apparent molecular weight of the different fractions of the crude extract, and several bands were identified: 34, 48, and between 90 and 200 kDa. Haemolytic activity in human blood type A+ was 100% with 1.1 µg mL^–1 and 50% with 0.98 µg mL^–1 of crude extract. The crude extract was observed under a microscope and three types of nematocysts were found: heterotrichous microbasic eurytele, heterotrichous isorhiza, and holotrichous isorhiza.

Key words: isolation, Pelagia nuctiluca, venom, Caribbean Sea.

 

INTRODUCCIÓN

Los cnidarios son el filo más grande de animales tóxicos; sin embargo, sus toxinas y venenos no han llamado tanto la atención de los científicos como lo han hecho los de organismos terrestres (e.g., serpientes, escorpiones, arañas) u otros organismos marinos (e.g., Conus sp.) (Turk y Kem 2009).

Este filo provee un gran número de productos naturales, entre los que se incluyen proteínas y metabolitos secundarios con propiedades tóxicas o biomédicas (ver Rojas et al. 2002 y sus referencias). Las investigaciones químicas, bioquímicas y farmacológicas de este filo se han centrado, principalmente, en los miembros de las clases Alcyonaria (corales blandos y gorgonias), Zooantharia (anémonas) y Cubozoa (cubomedusas) (Rojas et al. 2002). Este filo se caracteriza por la presencia de nematocistos, que son la secreción de células especializadas que residen principalmente en los tentáculos de las medusas, anémonas, corales y los pólipos de los hidroides. Las funciones principales de los nematocistos son para obtención del alimento, para defensa contra los depredadores y para adhesión al sustrato durante la locomoción en el caso de los pólipos (Kass–Simon y Scappaticci 2002). Existen 28 tipos de cnidos descubiertos hasta ahora, y se dividen en tres subcategorías: nematocistos (25 tipos), espirocistos (2) y pticocistos (1) (Mariscal et al. 1977).

El veneno presente en este filo está confinado principalmente en los nematocistos (Kass–Simon and Scappaticci, 2002), y las sustancias activas del veneno son principalmente neurotóxicas, citolíticas (Lotan et al. 1995 en Sánchez–Rodríguez et al. 2006) y antitumorales (Honda et al. 1985). Entre los compuestos antitumorales, los prostanoides son capaces de inhibir el crecimiento celular en tumores mediante la detención de la fase G–I y la disminución de las células en la fase S (Honda et al. 1985).

Entre las diferentes toxinas encontradas en las medusas, las citolisinas son probablemente las más estudiadas (ver Torres et al. 2001 y sus referencias). Se ha documentado que algunas toxinas de las medusas generan actividad eléctrica en diferentes modelos celulares; por ejemplo, el veneno de Aurelia sp. provoca la despolarización de los músculos de rana (Kihara et al. 1988 en Torres et al. 2001), Carybdea rastoni produce una respuesta contráctil dependiente del canal de calcio en el músculo liso arterial (Azuma et al. 1986 en Torres et al. 2001) y las toxinas de Chrysaora sp. abren canales catiónicos en las fibras nerviosas mielinizadas de rana (Dubois et al. 1983 en Torres et al. 2001).

Koyama et al. (2003) encontraron que las sustancias tóxicas en los nematocistos aislados de los tentáculos de Chiropsalmus quadrigatus (Cubomedusae) produjeron hipotensión seguida de hipertensión en conejos anestesiados. Esto indica que el veneno tiene tanto efectos vasoconstrictores como cardiodepresivos, y sugiere que estas acciones pueden deberse, en parte, a la activación de los canales de calcio dependientes de voltaje y probablemente a una posterior sobrecarga de calcio.

La actividad hemolítica in vitro se ha documentado en una variedad de venenos de medusas (ver Bailey et al. 2005 y sus referencias) y en contra de eritrocitos de diferentes especies, incluyendo los humanos. En tres especies de medusas, esta actividad ha sido atribuida a una toxina proteica aislada y secuenciada de aproximadamente 43 kDa (Nagai et al. 2000a/b, Chung et al. 2001, Nagai et al. 2002 en Bailey et al. 2005). Las toxinas hemolíticas aisladas de las cubomedusas Carybdea rastoni, Chiropsalmus quadrigatus y Carybdea alata mostraron una homología importante entre ellas, pero no con otras proteínas conocidas, lo que sugiere que estas toxinas representan una nueva clase de proteínas bioactivas (Bailey et al. 2005).

Mariottini et al. (2002) observaron que el extracto crudo de Pelagia noctiluca no causó alteración en el ADN celular (V79), pero que sí mostro propiedades citotóxicas. El veneno crudo afectó los fibroblastos cultivados y produjo una disminución severa en la supervivencia a la concentración máxima probada (150,000 nematocistos mL^–1); sin embargo, es bien sabido que las propiedades irritantes in vivo del veneno de P. noctiluca muestran menores efectos que los venenos de Rhizostoma pulmo, Anemonia sulcata y Actinia equina.

Pelagia noctiluca es una medusa pelágica pequeña de coloración rosa, malva o marrón claro, y tiene una campana que es fosforescente en la oscuridad y mide entre 3 y 12 cm de diámetro en organismos adultos. Esta especie presenta ocho tentáculos que emergen del borde de la campana. Se distribuye ampliamente en los océanos del mundo, incluso en el norte del Atlántico y del Pacífico (Tibballs 2006).

Se sabe que esta especie no ha causado muertes humanas, pero el contacto accidental con sus tentáculos o campana puede causar dolor local o urticaria (Mansson et al. 1985 en Tibballs 2006). Se ha observado que, durante sus florecimientos, los barcos de pesca (de arrastre) han tenido problemas debido a que las medusas se adhieren a sus artes de pesca o las dañan (Tibballs 2006). Marino et al. (2006) aislaron los nematocistos de P. noctiluca y documentaron la presencia de actividad neurotóxica y poder hemolítico. Maretic et al. (1991) analizaron extractos homogeneizados mediante electroforesis y encontraron que el veneno de P. noctiluca es de naturaleza proteica, tiene propiedades antigénicas y está compuesto por ocho fracciones, y una cardiotoxina se purificó parcialmente del veneno crudo (Olson et al. 1985 en Mariottini et al. 2002).

Es poco lo que se sabe sobre el veneno de P. noctiluca, excepto que es citotóxico (Mariottini et al. 2002) y que su activación dependiente del calcio de los nematocistos es bloqueada por el tratamiento con gadolinio (Salleo et al. 1994 en Tibballs 2006). El veneno es antigénico y se puede presentar anafilaxia y el síndrome de Guillain–Barre después del contacto (Togias et al. 1985, Pang y Schwartz 1993 en Tibballs 2006).

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Varios especímenes de P. noctiluca se recolectaron mediante arrastres superficiales horizontales de 10 min con redes de plancton en la laguna arrecifal de Puerto Morelos (Quintana Roo, México). Los organismos se trasladaron al laboratorio de toxinología y se congelaron a –60 °C durante 24 h. El extracto crudo se preparó de acuerdo con el método modificado por Kem et al. (1989), se congeló a –60 °C y se liofilizó (Labconco 4.5 L) a –45 °C al vacío.

Identificación de los nematocistos

Se disolvieron 3 g de extracto liofilizado en 10 mL de agua destilada para realizar la descarga de los nematocistos. La solución se centrifugó a 4 °C y 4000 rpm durante 10 min.

Para identificar los nematocistos, se usó la clave de Mariscal (1974), que se basa en las medidas del diámetro de la cápsula y del filamento, y en el tamaño, la forma y la abundancia de las espinas que se encuentran en la superficie de los filamentos.

Aislamiento y purificación de la toxina de P. noctiluca

El extracto total de 4.7 mL se pasó a través de una columna en gel de filtración (81 × 2.3 cm) empacada con Sephadex G–50 M y equilibrada con una solución amortiguadora de ácido acético 0.7 M; la elución se realizó a un flujo de 2.0 mL min^–1. Las fracciones se concentraron al vacío por medio de un rotavapor.

La fracción activa II se pasó a través de una columna de QAE Sephadex A–25 (48 × 0.5 cm); la elución se procesó con una solución amortiguadora de acetato de amonio con un pH de 8.5 mediante un gradiente escalonado de 0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 y 1 M, a un flujo de 1 mL min^–1. La fracción activa se concentró a presión reducida.

Posteriormente, la fracción activa se pasó a través de una columna de Fractogel EMD SO3^– (48 × 0.5 cm) equilibrada con una solución amortiguadora de acetato de amonio 0.01 M con pH de 5.4 mediante un gradiente escalonado de 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 M, a un flujo de 1.5 mL min^–1. La muestra se concentró al vacío y se desaló en una columna de Sephadex G–25 (48 × 0.75 cm) con una solución amortiguadora de ácido acético 0.3 M a un flujo de 1.5 mL min^–1. Las fracciones resultantes se concentraron al vacío.

La pureza de la fracción activa se determinó por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, por sus siglas en inglés) en un cromatógrafo Varian ProStar 410 Autosampler mediante una columna de fase reversa Nucleosil C18 (250 x 4.5 mm) y un gradiente lineal de 10% a 90% de acetonitrilo en 0.1% de ácido trifluoroacético por 70 min a un flujo de 1 mL min^–1. El contenido de proteínas se determinó según el método descrito por Bradford (1976), con gamma globulina de bovino (Bio–Rad) como estándar.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS–PAGE) se realizó según el método de Laemmli (1970), usando una concentración de acrilamida de 12.0% a 25 V durante 2 h con amortiguador de Tris–Glicina (0.098M y 0.998 M). El gel se tiñó con azul de Coomassie. Las masas moleculares se determinaron mediante la comparación con estándares de proteína Precision Plus Protein (Bio–Rad): 250, 150, 100, 75, 50, 37 y 25 kDa.

Actividad hemolítica

La actividad hemolítica del extracto crudo se determinó según el método descrito por Rottini et al. (1990), con algunas modificaciones. Los eritrocitos de humano se colocaron en una solución de Alsever, a un pH de 7.4 y sobre hielo para evitar la hemólisis. La actividad hemolítica fue probada con distintas concentraciones de extracto crudo (0.275 a 1.1 |ag mL^–1). Las muestras se incubaron a 37 °C durante 30 min. Después de la centrifugación, la actividad hemolítica se midió espectrofotométricamente a 415 nm. Se calculó la unidad hemolítica al 50% (UH50).

Monitoreo neurotóxico

En las fracciones obtenidas después de la purificación se llevaron a cabo las pruebas de neurotoxicidad por medio de la inyección intramuscular de 0.01 mL en la base del tercer pereiópodo del cangrejo Ocypode quadrata (entre 10 y 15 g de peso corporal). Se definió como reacción positiva la presencia de contracciones tetánicas en las extremidades de los cangrejos.

 

RESULTADOS

Identificación de los nematocistos

El método modificado de Kem et al. (1989) empleado para el aislamiento de los nematocistos resultó ser muy eficiente. Se identificaron tres tipos de nematocistos: heterotrico microbásico euritele, heterotrico isorriza y holotrico isorriza (fig. 1).

Purificación de la toxina de P. noctiluca

Después del primer paso de purificación, cada fracción separada fue probada en cangrejos para encontrar las fracciones activas y continuar la purificación (fig. 2a–d). La fracción activa II presentó una fuerte actividad paralizante.

La fracción II se cromatografió en la columna de QAE Sephadex A–25 y se obtuvo una fracción (B) activa. La fracción B se cromatografió en Fractogel EMD SO₃^– y se aisló una fracción (C) activa. Esta fracción C se desaló con Sephadex G–25. El extracto crudo contenía 0.25 mg de proteína en 1 mL.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Las proteínas del extracto crudo de P. noctiluca presentaron pesos moleculares aparentes de 34, 48 y entre 90 y 200 kDa (fig. 3).

Actividad hemolítica

El 100% de la actividad hemolítica se alcanzó con 1.1 µm de proteína mL^–1 del extracto crudo, mientras que el 50% se alcanzó con 0.98 mg proteína mL^–1, usando sangre humana del tipo A+. Se observó un efecto dependiente de la concentración de extracto crudo (fig. 4).

Monitoreo neurotóxico

En el monitoreo neurotoxico con 5 mg mL^–1 de extracto crudo, los organismos murieron a los 3 min después de la inyección de 0.10 mL en la base del tercer pereiópodo de O. quadrata; en el monitoreo con 8 mg mL^–1, la muerte ocurrió en los primeros 60 s.

 

DISCUSIÓN

Se identificaron tres tipos de nematocistos en P. noctiluca: heterotrico microbásico euritele, heterotrico isorriza y holotrico isorriza. Estos organelos se consideran como una de las secreciones celulares más complejas (Anderluh y Macek 2000). Avian et al. (1991) encontraron resultados similares para la misma especie.

En relación al análisis electoforético del extracto crudo, las fracciones separadas presentaron un peso molecular aparente de 34, 48 y entre 90 y 200 kDa. Se han registrado resultados similares para las medusas Cassiopea andromeda (5 a 250 kDa), Cassiopea xamachana (aproximadamente 10 bandas con líneas distintas a 90, 150 y 250 kDa) y Aurelia aurita (5 a 210 kDa) (Radwan et al. 2001). Por otro lado, el veneno de los nematocistos en los tentáculos de Chrysaora achlyos se ha documentado con un peso molecular de 35, 50, 55 y 100 kDa (Radwan et al. 2000).

En el extracto crudo de P. noctiluca, Marino et al. (2006) mencionan que una muestra de 90 nematocistos por 1 con 1.6 µg proteína µL^–1 en promedio induce 100% de hemólisis en una suspensión de 0.05% de eritrocitos humanos, después de 1 h de incubación. Un menor grado de hemólisis fue inducido por el extracto crudo de las cápsulas disparadas, ya que los nematocistos de menor pH fueron menos activos que las cápsulas que se dispararon espontáneamente. En Carybdea marsupialis, la hemólisis para una solución de 10 mL de eritrocitos de ovino al 0.05% fue ≥ 80% después de 11 min a 37 °C y 15 min a 20 °C (Rottini et al. 1995), muy similar a la de P. noctiluca. Comparado con lo observado para Rhopilema nomadica, la actividad hemolítica es menos estable (Gusmani et al. 1997).

La actividad biológica de la citotoxina se determinó en el bioensayo hemolítico con sangre humana fresca, mientras que la neurotoxicidad se determinó con cangrejos de mar (O. quadrata). La UH₅₀ para P. noctiluca se determinó en 0.98 µg proteína mL^–1 de sangre humana tipo A+. En comparación con esta actividad, en Chrysaora achlyos se ha observado que la UH₅₀ fue mayor en los tentáculos y menor en el mesenterio, pero con resultados muy próximos a los observados para Chrysaora quinquecirrha (Radwan et al. 2000).

La actividad neurotóxica se probó en los cangrejos (O. quadrata) para determinar la actividad biológica de acuerdo con Béress y Zwick (1980). Las convulsiones, la parálisis e incluso la muerte fueron las reacciones observadas en las fracciones purificadas. La toxina demostró ser una sustancia neurotóxica y activa en los canales iónicos dependientes del voltaje, como lo descrito por Béress y Zwick (1980).

 

AGRADECIMIENTOS

Se agradecen a L Celis los valiosos comentarios al manuscrito.

 

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NOTA

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