Artículos

 

Caracterización del biomineral CaCO₃ en algas rojas coralinas (Corallinales) de las costas del Pacífico mexicano*

 

Characterization of the CaCO₃ biomineral in coralline red algae (Corallinales) from the Pacific coast of Mexico**

 

D Fragoso^1,4*, F Ramírez–Cahero², A Rodríguez–Galván², R Hernández–Reyes³, A Heredia²*, D Rodríguez, M Aguilar–Franco³, L Bucio³, VA Basiuk²

 

¹ Laboratorio de Ficología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, Apartado postal 70–592, 04510 México DF, México. * E–mail: dalila_f@live.com.mx, alejandropicoheredia@googlemail.com

² Instituto de Ciencias Nucleares, Universidad Nacional Autónoma de México, Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, 04510 México DF, México.

³ Instituto de Física, Universidad Nacional Autónoma de México, Circuito Exterior s/n, Ciudad Universitaria, 01000 México DF, México.

⁴ Posgrado de Ciencias del Mar y Limnología, Universidad Nacional Autónoma de México

 

Recibido en mayo de 2009
Aceptado en diciembre de 2009

 

ABSTRACT

Coralline red algae assimilate HCO₃^– to precipitate CaCO₃ in their tissues in the form of calcite or aragonite. A characterization of the biomolecular content and the crystalline structure of the biomineral of coralline red algae from the Pacific coast of Mexico was performed by powder X–ray diffraction (XRD), scanning electron (SEM) and tunneling microscopy (STM), and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The preliminary conclusion drawn from the results is that this type of calcite–aragonite biomineral has a very low organic content occluded within the crystals. FTIR bands at 2945 and 2889 cm^–1 indicate that the most likely organic molecules are carbohydrates; moreover, peptide bond bands (amide I ~1640 and amide II ~1540 cm^–1) were not detected, suggesting that proteins are not related to mineral synthesis or their stabilization. This could be explained if the biomineral is synthesized by a biologically controlled extracellular mineralization process. The XRD study showed two main mineral phases, calcite and aragonite, with very similar structural parameters to the inorganic mineral counterparts. The crystallite shapes, seen by STM, were found as plates and needles with different sizes, between 20 and 100 nm.

Key words: Corallinales, biomineral, Rietveld method, nanostructure, scanning tunneling microscopy.

 

RESUMEN

Las algas rojas coralinas asimilan HCO₃^– para precipitar CaCO₃ en sus tejidos en forma de calcita o aragonita. Se realizó una caracterización del contenido biomolecular así como de la estructura cristalina del biomineral en algas rojas coralinas de las costas del Pacífico mexicano mediante difracción de rayos X (XRD) en polvos, microscopía electrónica de barrido (MEB) y de túnel (STM), y espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR). Con los resultados se llegó a la conclusión preliminar de que este tipo de calcita–aragonita tiene un muy bajo contenido de materia orgánica ocluida dentro de los cristales. Las bandas de FTIR a 2945 y 2889 cm^–1 encontradas indican que las moléculas orgánicas más probables son los hidratos de carbono; además, no se detectaron bandas de enlace peptídico (amida I ~1640 y amida II ~1540 cm^–1), lo que sugiere que las proteínas no están relacionadas con la síntesis mineral o con su estabilización. Esto se podría explicar si el biomineral fuera sintetizado por un proceso extracelular de mineralización controlado biológicamente. El análisis de XRD mostró dos fases minerales principales, calcita y aragonita, muy similares en sus parámetros estructurales a sus contrapartes minerales inorgánicas pero con modificaciones en la estructura molecular. Las formas y tamaños de los cristales, vistos mediante STM, son típicamente en placas y agujas de diferentes tamaños, entre 20 y 100 nm.

Palabras clave: Corallinales, biomineral, método de Rietveld, nanoestructura, microscopía de túnel.

 

INTRODUCCIÓN

Los principales vegetales productores de carbonato en los ecosistemas acuáticos son las algas coralinas rojas multicelulares, taxonómicamente clasificadas en el orden Corallinales (Silva y Johansen 1986). En este grupo de algas la calcita es depositada sobre las paredes celulares excepto en algunas regiones limitadas y especializadas como las articulaciones. Al igual que otros grupos de organismos marinos como los arrecifes coralinos (Mann 2001), estas algas asimilan HCO₃^– para precipitar CaCO₃ en sus tejidos a fin de construir sus estructuras biológicas rígidas. Como es bien sabido, sus paredes celulares están constituidas de mineral de carbonato micro y nanoestructurado, principalmente calcita, con estructuras ordenadas jerárquicamente que hasta el momento han sido imposibles de manufacturar. Al igual que otros biominerales, los carbonatos formados biológicamente en las algas rojas son producidos mediante mecanismos controlados biomolecularmente que aún no se entienden (Addadi y Weiner 1992, Mann 2001) pero que están estrechamente relacionados con el proceso de fotosíntesis (Borowitzka 1979, Haïkali et al. 2004). Los organismos que biomineralizan CaCO₃ utilizan Ca²⁺, Mg²⁺ y CO₃^2– como fuente para generar los minerales que luego se acoplan a moléculas orgánicas específicas, formando estructuras relacionadas de calcita–aragonita. En este sentido, los recientes hallazgos de algunas biomoléculas derivadas de biominerales resultan de gran importancia para entender las interacciones entre biomoléculas y cristales, así como para determinar cómo inciden las moléculas en la forma y los parámetros atómicos de la celda unitaria del sólido inorgánico.

Aparentemente, la formación de CaCO₃ en las algas rojas es un proceso muy dinámico durante el cual las interacciones entre las moléculas ligadas mediante enlaces C=O y otros elementos químicos contribuyen en la modificación de las formas y los parámetros d cristalinos (Pueschel et al. 1992). Los cristales aparecen primero en la célula en un retículo con formas que van de romboédricas a subesféricas (Pueschel et al. 1992). Otros estudios (ver revisión de Bilan y Usov 2001) muestran claramente que la mineralización en algas coralinas es un proceso muy complejo no sólo en la formación de biominerales sino también en la síntesis de polisacáridos orgánicos poco comunes (Bilan y Usov 2001). Además, a diferencia de otras estructuras biominerales, las algas rojas coralinas tienen una capacidad excepcional para modificar su contenido de biominerales (Allemand et al. 2004) y orgánico (Bilan y Usov 2001) en las diferentes estaciones del año alternando entre calcita y aragonita (Adey 1970), o de incluir diferentes elementos controlados por cambios en la temperatura ambiental (Kamenos et al. 2008). La falta de información sobre moléculas encapsuladas en las paredes de las algas rojas coralinas (CaCO₃, MgCO₃) dificulta la determinación de cómo suceden las interacciones entre grupos inorgánicos y compuestos orgánicos (Allemand et al. 2004). Por ende, el estudio de los procesos involucrados en la biosíntesis de CaCO₃ proporcionará información sobre aspectos biomoleculares y fisicoquímicos que contribuyen a la formación de estructuras celulares biominerales (Addadi y Weiner 1992, Mann 2001, Allemand et al. 2004). En el CaCO₃ de las algas rojas coralinas, las interacciones entre especies de Ca²⁺ y CO₃^2– y moléculas orgánicas podría ser de vital importancia en la formación de núcleos y en el crecimiento de los cristales de un biomineral jerárquicamente ordenado (Medakovic et al. 1995). De hecho, las moléculas orgánicas modifican casi todas las jerarquías en el sólido inorgánico en una estrategia de abajo hacia arriba que incluye parámetros atómicos y la célda cristalina unitaria tal como sucede en la apatita ósea (Heredia 2000), moluscos (Pokroy et al. 2006) y corales (Pokroy et al. 2006, Przenioslo et al. 2008). En las algas coralinas, la baja concentración de moléculas orgánicas en el biomineral (Medakovic et al. 1995) complica establecer la contribución de los compuestos orgánicos a la anisotropía o la captación de iones inorgánicos por las estructuras inorgánicas (Degens 1989, Aizenberg et al. 1994). Estos estudios son de interés para determinar las propiedades (bio)fisicoquímicas de una ruta de síntesis para la producción de estructuras con un gran orden jerárquico o para traducir este conocimiento para entender la generación y diseño de materiales novedosos de alto desempeño, a base de calcio (Mann 2001).

Este tema se abordó analizando el biomineral de diferentes especies del orden Corallinales. La calcita y la aragonita en estas especies muestran un mayor contenido de Mg²⁺ que sus contrapartes de origen orgánico (Medakovic et al. 1995), disminuyendo el tamaño de la celda unitaria en una estructura biomineral más compacta (Cusack et al. 2003). El biomineral de CaCO₃ de las algas rojas coralinas se encuentra en el exterior de la membrana plasmática de las células y en los ecosistemas acuáticos es protegido contra su disolución espontánea mediante la textura de los cristales o la inclusión de átomos de Mg²⁺ en la celda cristalina unitaria (Medakovic et al. 1995).

En este trabajo se hizo una revisión taxonómica de las algas rojas coralinas para entender mejor sus características estructurales a diferentes escalas, como su contenido bioorgánico asociado con el CaCO₃ biomineral, su contenido mineralógico y su organización cristalina a microescala, y se utilizó el método de Rietveld para analizar la deformación de los parámetros atómicos del biomineral a nanoescala. Este trabajo está enfocado al análisis biomineral de diferentes especies de algas rojas coralinas obtenidas de las costas del Pacífico de México, mediante la espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR, por sus siglas en inglés), difracción de rayos X en polvos (XRD), microscopía electrónica de barrido de bajo vacío (LVSEM) con espectroscopía de dispersión de energía (EDS) y microscopía de efecto túnel (STM). Su objetivo fue obtener información y nuevos datos sobre la composición de los depósitos de minerales y la nanoestructura en cuanto a su contenido mineral, así como desarrollar un análisis elemental de los diferentes géneros de algas rojas coralinas (e.g., Amphiroa, Jania, Lithophyllum, Neogoniolithon y Pneophyllum) que se encuentran principalmente en las costas tropicales del Pacífico mexicano. Algunas de estas especies han sido caracterizadas en su contenido de CaCO₃ biomineral; sin embargo, existe poca información sobre la composición y la estructura de los depósitos de minerales de estas especies en las costas de México. También se realizó una comparación con otras especies (e.g., Bossiella, Calliarthron, Haliptilon y Lithothrix) que tienen una distribución particular, especialmente en la costa del Pacífico del norte de México. Cabe hacer notar que tampoco se sabe mucho sobre la relación e interacción entre la composición de los depósitos de minerales y los factores ambientales.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

Material vegetal

Se seleccionaron aleatoriamente especímenes de diferentes especies de algas rojas coralinas, todos ellos recolectados de la zona intermareal, considerando su representatividad en la costa del Pacífico mexicano (fig. 1) y tomando en cuenta su abundancia y distribución (tabla 1).

Existen dos grupos de especies según las condiciones naturales. En la costa noroeste de México existen especies de agua fría como Bossiella orbigniana, Calliarthron cheilosporoides, Corallina vancuouveriensis, Haliptilon gracile y Lithothrix aspergillum, cuya distribución está restringida principalmente a lo largo de la costa noroccidental de la Península de Baja California que es influenciada por la Corriente de California (Hubbs y Roden 1964, Wyrtki 1965) que fluye hacia el SE de la Corriente del Pacífico Norte y acarrea agua de bajas temperaturas, baja salinidad y alto contenido de oxígeno, de origen subártico. El patrón y los límites de este flujo varían estacionalmente: de diciembre a julio la corriente fluye en dirección casi paralela a la costa, cubriendo todo lo largo de la costa occidental de la península, mientras que entre diciembre y abril los componentes costeros se trasladan al SE hasta alrededor de los 15° N en el trópico; de agosto a noviembre su dirección es variable, la mayoría del flujo es mar adentro y su límite inferior es Punta Eugenia (28° N), donde se desvía hacia el SO. La temperatura superficial de las aguas costeras incrementa en relación con el gradiente latitudinal siguiendo en general una dirección NO–SE. Durante el invierno, el gradiente de temperatura es continuo en el margen oceánico entre 32°43' y 18° N, a lo largo de la costa occidental de la Península de Baja California, continuando hasta la costa tropical de Mazatlán. Este patrón prevalece en el verano, presentando un cambio de 15°C a 29°C. La salinidad muestra un patrón similar al de la temperatura, decreciendo latitudinalmente hacia el SE; varía entre 33.6 y 34.8 tanto en verano como en invierno, pero aumenta más rápidamente durante este último, alcanzando 34 a la altura de Punta Eugenia, mientras que en verano esta salinidad no se alcanza sino hasta Bahía Magdalena (Maluf 1983).

El segundo grupo coralinas consiste de especies típicas de aguas tropicales como Amphiroa mexicana, Jania tenella, Pneophyllum aff. fragile, Neogoniolithon trichotomum y Lithophyllum aff. frondosum. Estas especies se distribuyen desde la zona intermareal y se han registrado en mayor abundancia particularmente en las costas de Jalisco, Michoacán, Guerrero y Oaxaca. Toda esta región es influenciada por la Corriente Costera de Costa Rica, la cual deriva de la Contracorriente Ecuatorial y acarrea agua de origen tropical (Hubbs y Roden 1964, Wyrtki 1965) caracterizada por altas temperaturas superficiales, alta salinidad y baja concentración de oxígeno. La variación estacional de la temperatura media mínima es de un grado (28–29°C); sin embargo, se presentan cambios locales debido a la influencia de surgencias, cuando menores temperaturas se imponen al patrón general, o por el aislamiento de cuerpos de agua que ocasiona incrementos en la temperatura. En la porción tropical la salinidad es relativamente alta y bastante uniforme, con valores que varían entre 32 y 36.5 (de la Lanza 1991).

Es importante indicar que a pesar de la amplia distribución de las Corallinales en las costas del Pacífico mexicano, la mayoría de sus estudios se enfocan en la región tropical. Las especies no geniculadas son los primeros colonizadores y cubren 80–90% del sustrato primario (Steneck 1986) para convertirse en el sustrato del conjunto de las demás algas bentónicas. Existen hasta 50 especies no geniculadas en todo el Pacífico tropical mexicano (Fragoso y Rodríguez 2002), donde trabajos realizados muestran que, especialmente en Guerrero y Oaxaca, L. aff. frondosum y sus especies relacionadas son las más importantes, presentando el mayor índice de abundancia específico en base a frecuencia y cobertura (López et al. 2000, 2004); este también parece ser el caso de P. aff. fragile y N. trichotomum (obs. pers.). En los ecosistemas de arrecifes coralinos, los cambios en la abundancia de algunas especies de algas coralinas no geniculadas pueden regular la abundancia de otros componentes arrecifales, incluyendo los corales, y modificar la estructura y función del escosistema, por lo que son consideradas grupos funcionales claves (Harrington 2004). En las comunidades coralinas de Zihuatanejo y Huatulco (Pacífico tropical mexicano), las bases de las colonias de diferentes especies de Pocillopora, cuya característica distintiva es no poder formar bases calcáreas sólidas y grandes, son colonizadas por especies no geniculadas que proporcionan a la colonia un gran soporte estructural (Oseguera com. pers.).

Las algas geniculadas o articuladas, junto con otras especies, forman una densa cobertura vegetal. Las especies de Amphiroa y Jania son las más importantes a lo largo de la costa del Pacífico mexicano, después de las especies no geniculadas. La complejidad arquitectural de esta cobertura la convierte en un hábitat para diversos conjuntos de macrofauna (Kelaher et. al. 2003), a quienes proporciona espacio, refugio y alimento. Datos de la bahía de Zihuatanejo (García 2009) muestran que esta macrofauna (organismos de 0.5–1 mm según Bilyard 1987, Warwick 1988) incluye gran número de especies que pertenecen a seis filos (Annelida, Arthropoda, Mollusca, Echinodermata, Sipuncula y Platyhelminthes), con altas densidades, generalmente mayores que 200 ind 0.1 m^–2.

Procesamiento de muestras

Se lavaron las muestras de diferentes especies con agua de la llave durante 24 h. Sus superficies fueron cuidadosamente observadas bajo un estereomicroscopio, eliminando epífitos con un cepillo, y luego se procesaron mediante diferentes análisis microscópicos. En general se usaron fragmentos pequeños de cada planta de cada especie. Las muestras consistieron de fragmentos del eje principal o de las ramas laterales asociadas (0.5–1 cm). Los especímenes de algas coralinas incrustantes se fracturaron y se analizaron piezas pequeñas (0.5–1 cm) de diferentes partes del talo. Las estructuras biominerales completas fueron lavadas cuidadosamente con agua destilada y secadas al aire. Los especímenes se analizaron por LVSEM–EDS, STM, FTIR y XRD. Se seleccionaron dos muestras con más de una fase cristalina para realizar XRD de alta resolución y determinar su contenido de material fino mediante refinamientos Rietveld.

LVSEM–EDS

En el análisis de LVSEM, se fijaron todas las muestras en un portamuestras usando sólo cinta de carbón, sin ninguna preparación adicional. Para este análisis se utilizó un instrumento JSM–5900LV. Las mediciones se realizaron a un bajo vacío de 1–250 Pa (0.01–2.5 Torr), con un voltaje de aceleración de 5–20 kV. Se llevaron a cabo análisis químicos adicionales midiendo espectros de EDS por análisis cuantitativo ZAF.

STM

Las muestras fueron pulverizadas y depositadas sobre superficies de grafito pirolítico de alto ordenamiento (soportes HOPG de ca 5 x 5 mm proporcionados con el instrumento). La STM (Binning et al. 1982) se trabajó en modo de corriente constante a temperatura ambiente. Se usaron las condiciones de túnel para optimizar las imágenes (voltaje de sesgo de 1.01–1.52 V y corriente túnel de 0.050–0.4 nA). Las imágenes de STM se obtuvieron al aire libre usando el sistema Nanosurf EasyScan E–STM versión 2.1 con un intervalo de barrido de 624 x 624 nm. Para el barrido se utilizaron sondas metálicas de Pt/Ir recién cortadas de 0.25 mm de diámetro. El depósito de las muestras sobre superficies de HPOG recientemente preparadas se realizó como sigue: el material algal fue lavado con agua destilada y secado; se trituraron porciones en un mortero de vidrio y el polvo se depositó sobre los sustratos de HOPG preparados para el análisis.

FTIR

Para obtener información sobre el tipo de biopolímero y la naturaleza química del biomineral, se realizaron mediciones de FTIR. Las muestras se trituraron y se mezclaron con polvo KBr (razón de 100:1), y posteriormente se comprimieron en píldoras. Se empleó un espectrómetro Nicolet 680 FT–IR con una resolución de 4 cm^–1 y cada muestra se barrió 64 veces. Para determinar el número exacto de ondas de los diferentes grupos químicos producidos en los barridos, éstos se compararon con números de ondas de grupos específicos previamente publicados. En el caso de la FTIR de Calliarthron sp., se aplicó suavizado.

XRD

Para el análisis de XRD se estudiaron las muestras pulverizadas usando un difractómetro Bruker D8 Advance (a temperatura ambiente) con radiación de Cu Kα, una configuración θ–θ y un monocromador secundario de grafito. Se hicieron análisis cortos de XRD para examinar el contenido mineralógico de las estructuras enteras. El barrido se realizó entre 3° y 80°, con un paso de 2θ° de 0.05 y 0.5 s por punto. Para los patrones de XRD adecuados para el refinamiento Rietveld se midieron las intensidades de difracción entre 20° y 80°, con un paso de 2θ° de 0.02 y un tiempo de conteo de 8 s por punto.

Método de Rietveld para XRD en polvos

Implementado en el programa FULLPROF (Rodríguez–Carvajal 1981, Thompson et al. 1987, Young 1993), el método de Rietveld es utilizado para refinar estructuras de cristales con parámetros iniciales a partir de datos publicados para una estructura de tipo mineral, en este caso la calcita (a = 4.9896 Å, c = 17.0610 Å, y α = 90.0°, β = 90.0°, γ = 120°), la dolomita (a = 4.812 Å, c = 16.020 Å, y α = 90.0°, β = 90.0°, γ = 120°) (Effenberger et al. 1981), y la aragonita (a = 4.9611 Å, b = 7.9672 Å, c = 5.7407 Å, y α = 90°, β = 90°, γ = 90°) (Villiers 1971). El método de Rietveld se usa para varias cosas como estudiar el cambio en la anisotropía de las tensiones entre los átomos cuando éstos interactúan con moléculas orgánicas como en las conchas de moluscos (Pokroy et al. 2006) y corales (Przenioslo et al. 2008). En el presente trabajo se modificaron los parámetros de Rietveld ya que los difractogramas mostraron cambios en los parámetros de la celda unitaria, los tamaños de los cristales y la forma de los picos, con colas del lado derecho; además se incluyeron átomos de Mg²⁺ en el modelo de la estructura de la calcita (Heredia et al. 2005). Se escogió una función pseudo–Voigt modificada por Thompson et al. (1987) para generar la forma de los picos de difracción. Aquí se reporta el refinamiento de 19 parámetros independientes para los grupos espaciales Rc (calcita No. 167) y Pmcn (aragonita No. 62): punto cero, factor de escala, tres coeficientes polinomiales de fondo, dimensiones de la celda unitaria, ancho medio, pseudo–Voigt, parámetros de asimetría para la forma de los picos y factores isotrópicos posicionales y térmicos según las funciones normalmente empleadas en el refinamiento Rietveld, para las muestras trituradas. Se utilizó una región excluida (28.0–28.5 28°). Para estudiar la microtensión se usó la muestra pulverizada LaB6 como estándar para corregir el ensanchamiento instrumental de las líneas de difracción. El análisis del tamaño y la microtensión en este estudio se realizó empleando el análisis del patrón completo dentro del método de Rietveld. Para el análisis del tamaño y la microtensión dentro de este método se escogió la función del perfil de difracción pseudo–Voigt modificada por Thompson et al. (1987), con una función lorentziana para el tamaño y una gaussiana para la microtensión.

 

RESULTADOS

Estructura coralina y análisis elemental

La microestructura de los biominerales presenta dos principales tipos de formas cristlinas: en forma de agujas (Neogoniolithon trichotomum, Jania tenella, Amphiroa mexicana, Calliarthron cheilosporoides, Corallina vancouveriensis) y en forma de placas (Haliptilon gracile, Bossiella orbigniana, Lithothrix aspergillum). Las estructuras complejas (fig. 2a, e) presentan cristales texturizados que pueden observarse en imágenes de LVSEM (fig. 2b, c, d, f, g, h).

Las microesferas (fig. 2b–c), interpretadas como gránulos de almidón por Woelkerling (1988), mostraron un contenido alto de Ca²⁺ según el análisis de EDS (ampliación en fig. 2b; tablas 2, 3, columnas encabezadas "sphere"). Además, las muestras con protrusiones cristalinas muestran una textura muy definida (fig. 2a), que puede originarse de una capa central (flechas negras en fig. 2c). El contenido de Mg (resultados de EDS, tabla 2) en algunas muestras puede ser un factor que reduzca la celda unitaria cristalina (Meldrum y Hyde 2001, Cusack et al. 2003) para incrementar la estabilidad (Antao et al. 2004). En este caso, en vista del bajo contenido de Mg²+ en la estructura coralina el biomineral no puede considerarse CaCO₃ magnésico (Tucker y Wright 1991).

El análisis elemental por EDS de los cristales (ampliación en fig. 2b) muestra una notable diferencia en la estequiometría del contenido de Ca en comparación con la calcita o la aragonita puras (tablas 2, 3). En este caso, el contenido de Ca es mucho mayor que en la estequiometría de las muestras biominerales, lo que podría estar relacionado con la presencia de otro sólido no identificado con cantidades mayores de Ca (posiblemente el responsable de los picos alrededor de 18.45, 21 y 23.9 en 2θ° del análisis de rayos X).

STM

Las imágenes de STM también muestran dos principales morfologías cristalinas: en forma de agujas y de placas. El bajo contenido de materia orgánica en el biomineral de las algas es favorable para la obtención de imágenes por STM ya que el rayo electrónico de túnel puede fácilmente rebasar el grosor del material carbónico (fig. 3). En comparación, se observa grafito pirolítico en la superficie del lado izquierdo de Neogoniolithon trichotomum (flechas negras en fig. 3a). En la tabla 2 se presentan las formas cristalinas correspondientes y sus tamaños, y en la figura 3 se muestran ejemplos de muestras de biomineral de cuatro diferentes especies de algas.

Las escalas de altura indican que la superficie de los cristales es muy homogénea; esto es, en casi ninguno de los casos se observan grandes contrastes de color (fig. 3).

En la imagen de N. trichotomum (fig. 3a) la forma de los cristales no parece ser estructuralmente homogénea aunque éstos presentan estructuras claramente definidas. En todos los casos el bajo contenido orgánico favoreció la toma de imágenes por STM. La mayor brillantez en comparación con las otras imágenes puede deberse a la presencia de materia orgánica no conductiva. La imagen de Lithophyllum aff. frondosum (fig. 3b) muestra cristales en forma de placas (indicados con corchetes) con una superficie muy lisa, y relativamente homogéneos en tamaño y forma. En otras muestras (Calliarthron cheilosporoides, fig. 3c) los cristales son menos simétricos pero es posible observar capas que probablemente constituyen planos cristalinos. En Jania tenella (fig. 3d) los cristales son más grandes que los de otras muestras (ver tabla 2).

FTIR

La naturaleza química de las algas muestra tres diferentes tipos de enlaces químicos: uno es un mineral carbonatado y los otros probablemente son un sólido de silicato y un biopolímero (fig. 4).

De todas las series de bandas de las algas rojas las más notables son las de la calcita (Bottcher et al. 1997) a 2533, 1808, 1446, 870 y 716 cm^–1, aunque se pueden observar bandas de una molécula orgánica a 2945, 2889 (C–H) y 1034 cm^–1 (C–O) en Bossiella orbigniana y Calliarthron cheilosporoides. También es posible observar bandas de un compuesto de silicio no cristalino a 1110 (Si–O) y 924 cm^–1 (Si–O) (Lazarev 1972). Las bandas a 2945 y 2889 cm^–1 son de hidrocarburo (C–H). Todas las bandas atribuibles a los componentes orgánicos se encuentran notablemente disminuídas en comparación con la fase cristalina, lo que está relacionado con la razón de componentes inorgánicos/orgánicos. Esto sugiere que el contenido mineral excepcionalmente excede la cantidad de contenido orgánico (fig. 4). Aunque el contenido químico de las muestras parece ser muy homogéneo, los casos de C. cheilosporoides y B. orbigniana, y en menor medida de Corallina vancouveriensis, son ligeramente diferentes debido a la fuerte intensidad de las bandas a 1110 (Si–O) y 1034 cm^–1 (C–O).

Estructura interna del biomineral por XRD en polvo

Las algas coralinas están principalmente compuestas de calcita muy cristalina, aragonita (fig. 5) y una tercera fase cristalina no identificada (indicada con flechas en fig. 6). En todos los casos la calcita es la fase mineral más representativa como se ha descrito en otros casos también en presencia de aragonita (Medakovic et al. 1995).

La diferencia principal entre la calcita y la aragonita mineral y el biomineral de las algas coralinas es la posición de los picos, que está directamente relacionada con el contenido de Mg²⁺ y otros iones. Además, el contenido de materia orgánica puede modificar los parámetros cristalinos (tabla 4) (Medakovic et al. 1995, Przenioslo et al. 2008).

Las algas coralinas presentan picos que cambiaron en sus posiciones cristalográficas hacia ángulos mayores. Esto significa un aumento en el tamaño de la celda unitaria (fig. 2) como el encontrado por otros autores (Medakovic et al. 1995) en algas rojas.

Análisis de la red cristalina usando el método de Rietveld para XRD en polvos

Con base en los datos de difracción se realizó un análisis de Rietveld de las muestras biogénicas. Las mediciones de XRD y Rietveld mostraron una estructura cristalina de calcita y aragonita ligeramente modificada y una tercera fase mineral no identificada (flechas en fig. 6). La principal reflexión (104) es de la calcita (figs. 5, 6). En el refinamiento de los datos con mayores intensidades de aragonita no fue posible alcanzar un modelo estructural correcto. La razón puede hayarse en el bajo grado de cristalinidad y la escasa información (conteos) del mineral del grupo aragonita. Un paso adicional incluyendo sólo los datos de la fase de calcita mejoró el análisis (figs. 5, 6).

En la tabla 5 se comparan los parámetros de la red de calcita y aragonita resultantes, así como los parámetros de tensión determinados en nuestras muestras con la calcita y aragonita de referencia y otros datos. La reducción en el tamaño de la celda unitaria se debe a Mg²+ incorporado en la red, y las tensiones y la anisotropia problemente se deben a la presencia de estos iones en diferentes partes de la estructura cristalina y a que no están homogéneamente distribuidos en ella. Asimismo, la asimetría de los picos (figs. 5, 6) puede estar relacionada con un cambio en los parámetros estructurales de la calcita (Itaya et al. 1997).

El valor de la microtensión (0.4%) probablemente se deba a la baja intensidad de las lineas de difracción en la fase aragonitica en comparación con la calcitica dentro del mismo patrón de XRD, lo cual podría indicar la presencia de impurezas. Además, en algunos casos las intensidades de las lineas de difracción son comparables con el fondo, lo que resulta una dificultad adicional en la determinación del tamaño y la microtensión mediante el método de Rietveld.

 

DISCUSIÓN

Dado que la LVSEM puede producir imágenes de muestras biológicas con alta resolución, cabe esperar imágenes homogéneas del material orgánico e inorgánico como las que se aprecian en la figura 2. Es claro que el mineral carbonatado tiene una textura muy ordenada desde la base donde se unen dos capas de cristales (flechas negras en fig. 2). La LVSEM mostró una estructura policristalina muy ordenada (fig. 2). Además, el bajo contenido orgánico permitió tomar imágenes por STM con cierta facilidad sin que algunas regiones obstruyeran el flujo de electrones (fig. 3). Otro aspecto estructural de interés de la STM de alta resolución es la sensibilidad a cambios en la topografía. En nuestro caso de estudio la topografía es muy homogénea y en algunas muestras el cambio de color (barras de escala) indica un cambio muy pequeño en altura entre los cristales. Esto significa que los nanocristales muy probablemente estén acoplados entre si en conglomerados (fig. 3) que explican por qué la medición Rietveld produjo un tamaño de cristal medio de ~200 nm. Se observaron dos principales formas cristalinas: cristales en forma de agujas y de placas. El análisis de elementos a veces mostró un contenido variable de éstos (tablas 2, 3), con un contenido muy alto de Ca en la estructura pero no necesariamente una cantidad muy alta de Mg (sólo en el caso de N. trichotomum el contenido fue de ~5.8%). Se observaron otros elementos como Ca, O y C en casi todas las muestras aunque no en la misma proporción, pero se encontró un alto porcentaje de estos elementos en el material de CaCO₃, como lo indican los análisis de FTIR y XRD (figs. 4, 5, 6).

La asimetría de los picos de XRD es notable, aunque no es clara su relevancia en la forma del cristal o su relación con el contenido elemental. La estructura del cristal está distorsionada y nuestro modelo supone un incremento en la tensión de los componentes de los cristales. Esto podría ser orgánico.

Se planea realizar estudios analiticos adicionales con el método de Rietveld para visualizar las estructuras de la red y sus distorciones geométricas. Las caracteristicas en los difractogramas de rayos X de Calliarthron cheilosporoides y Bossiella orbigniana son muy similares entre si pero muy distintas a las de Lithotrix aspergillum y Amphiroa mexicana. Al menos en este caso estas diferencias concuerdan con las filogenias moleculares, lo que sugiere que el proceso de biomineralización puede ser controlado genéticamente expresando alguna caracteristica filogenética.

En este estudio se consideraron especimenes de dos regiones biogeográficas con diferentes patrones de temperatura y salinidad; sin embargo, nuestros resultados no reflejan cambios significativos en los parámetros medidos mediante diferentes técnicas microscópicas. Medakovic et al. (1995) mencionaron que las tasas de calcificación y la proporción de la calcita magnésica en aguas frías son menores que en aguas tropicales. Esto no resultó evidente en nuestro estudio, posiblemente porque las muestras en general correspondieron a la misma temporada en ambas regiones. De acuerdo con nuestros resultados, en futuros trabajos será necesario comparar una o más especies en ambas regiones durante el mismo periodo estacional y analizar su comportamiento con respecto a la biomineralización.

 

CONCLUSIONES

Por medio de LVSEM y STM se mostró que los cristales de los diferentes géneros estudiados están bien ordenados en dos escalas: (1) en conglomerados de nanocristales y (2) en una estructura como palizada en zonas donde la celda presumiblemente congrega estos cristales. Es posible que la calcita prismática crezca en vasos como racimos y luego se ordena capa por capa a lo largo de la superficie en la capa central o plantilla orgánica que ayuda a orientar y proporciona homogeneidad estructural. Según el análisis de FTIR, el contenido orgánico parece no ser protéico. Además, el análisis elemental mostró una gran diversidad de elementos como Mg²⁺ probablemente incluidos en la red y asociados con la reducción y cambio general en el tamaño de la celda unitaria de la calcita. Por tanto, el cambio en la celda unitaria pareciera ser isotrópico y la asimetría de los picos no tiene una clara interpretación, aunque algunos autores la consideran como cambios en los sólidos mineralógicos por actividad biológica llamados transiciones de fase mineralógica (Itaya et al. 1997).

En resumen, los estudios bioestructurales de cristales biogénicos proporcionan un mejor conocimiento de sus complicados mecanismos de crecimiento y propiedades. Se requieren más trabajos sobre especies de algas rojas coralinas para entender si la biomineralización está relacionada con las relaciones filogenéticas y la micro y nanoestructura de biomineral. En el caso de las algas rojas, se están realizando más estudios usando STM y el método de Rietveld para poder determinar mejor la responsabilidad de los iones y los biopolímeros en la formación del biomineral.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por el CONACYT (México) y la UNAM. D. Fragoso agradece a CONACYT (México) por el apoyo financiero (num. de beca 144066). Agradecemos al laboratorio central de microscopía del Instituto de Física (UNAM) y en particular a C Magaña por su asistencia técnica, así como a M Cusack (Departamento de Ciencias Geográficas y de la Tierra, Universidad de Glasgow) por su gran interés, apoyo científico y discusiones beneficiosas. Todos los autores agradecen a AM D'amore Wilkinson del departamento de Lingüística de la Universidad Autónoma de Zacatecas por su importante ayuda en la versión original en inglés.

 

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NOTAS

* Traducido al español por Christine Harris.

** Versión bilingüe (Inglés–Español) en formato PDF