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Purificación de la hormona luteinizante (LH) en la lubina (Dicentrarchus labrax) y desarrollo de un inmunoensayo específico

 

Purification of luteinizing hormone (LH) in the sea bass (Dicentrarchus labrax) and development of a specific immunoassay

 

J Mateos¹, E Mañanós¹*, P Swanson², M Carrillo¹, S Zanuy¹

 

¹ Instituto de Acuicultura de Torre la Sal (CSIC), Torre la Sal s/n, 12595-Ribera de Cabanes (Castellón), España. * E-mail: evaristo@iats.csic.es

² Northwest Fisheries Science Center, NMFS, 2725 Montlake Blvd. East, Seattle, WA 98112, USA.

 

Recibido en febrero de 2005;
Aceptado en marzo de 2006.

 

Resumen

La hormona luteinizante (LH), secretada por la glándula hipofisaria, regula los procesos de maduración gonadal, ovulación/ espermiación y puesta en vertebrados. El presente trabajo describe la purificación de la LH de un pez teleósteo, la lubina europea (Dicentrarchus labrax), mediante triple cromatografía en columna (gel filtración, intercambio iónico y FPLC). Las subunidades α y β de la LH se aislaron mediante rpHPLC. El peso molecular de la LH se estimó, mediante SDS-PAGE, en 31 kD y el de sus subunidades α y β en 12 y 22 kD, respectivamente. Se obtuvieron anticuerpos específicos contra la subunidad LHβ (AbLHβ), que fueron utilizados para desarrollar un inmunoensayo tipo ELISA. La sensibilidad del ELISA fue de unos 0.65 ng mL^-1 (Bi/Bo 80%) y los coeficientes de variación intra e interensayo, de 11.7% (n = 8) y 11% (n = 10), respectivamente. La validación del ensayo mostró paralelismo entre la curva patrón (LH) y muestras de plasma e hipófisis de lubina, así como con extractos hipofisiarios de otras especies de peces perciformes. Mediante ELISA, se analizaron los niveles plasmáticos de LH en lubinas sometidas a tratamiento de inducción hormonal a la puesta, por inyección simple de diferentes dosis de GnRHa ([D-Ala⁶, Pro⁹-Net]-LHRH). Todos los tratamientos provocaron un marcado incremento de la LH plasmática a los 90 min después de la inyección, manteniéndose elevados durante 24 h. En conclusión, el ELISA puesto a punto es un inmunoensayo sensible y preciso, apropiado para cuantificar LH en muestras biológicas de lubina y representa una valiosa herramienta para realizar estudios sobre la endocrinología de la reproducción de esta especie.

Palabras clave: reproducción, hormona luteinizante, inmunoensayo, lubina, peces.

 

Abstract

The luteinizing hormone (LH) is a key regulator of the processes of gonad maturation, ovulation/spermiation and spawning in vertebrates. The present study describes the purification of LH from pituitaries of a teleost fish, the European sea bass (Dicentrarchus labrax), by three-step chromatography (gel filtration, ion-exchange and FPLC). The LH α and β subunits were isolated by rpHPLC. The molecular weight of LH was estimated, on SDS-PAGE, at 31 kD, and for its α and β subunits, at 12 and 22 kD, respectively. Specific antibodies against the sea bass LHβ subunit (AbLHβ) were obtained and used to develop a specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which had a sensitivity of around 0.65 ng mL^-1 (Bi/Bo 80%) and intra-and inter-assay coefficients of variation of 11.7% (n = 8) and 11% (n = 10), respectively. Validation of the assay showed parallelism between the standard curve and plasma and pituitary samples from sea bass, as well as with pituitary extracts from other perciform fishes. We measured, using ELISA, plasma LH levels in female sea bass given a single injection of different doses of GnRHa ([D-Ala⁶, Pro⁹-Net]-LHRH), as a hormonal therapy for spawning induction. All treatments increased plasma LH levels after 90 min of the injection and were maintained elevated during 24 h. In conclusion, the immunoassay developed is sensitive and accurate, useful for LH analysis in biological samples of sea bass, and represents a valuable tool for studies on the reproductive endocrinology of this species.

Key words: reproduction, luteinizing hormone, immunoassay, sea bass, fish.

 

Introducción

La lubina europea (Dicentrarchus labrax L.) es una de las especies más importantes en la acuicultura europea y también una especie modelo en el estudio de la endocrinología de peces. La lubina se reproduce espontáneamente en cautiverio, pero su reproducción todavía presenta serios problemas, tales como la desincronización de los reproductores y la reducida cantidad y calidad de los huevos (Carrillo et al. 1995), problemas que son comunes a muchas especies cultivadas. Estas disfunciones hormonales pueden solucionarse con el desarrollo y aplicación de terapias hormonales adecuadas, pero esto requiere un conocimiento exhaustivo de la biología reproductiva de la especie estudiada. En el caso de la lubina, se ha obtenido gran cantidad de información en los últimos años, gracias en parte al desarrollo de inmunoensayos específicos para hormonas y proteínas críticas, tales como la vitelogenina (Mañanós et al. 1994), esteroides sexuales (Prat et al. 1990), hormonas tiroideas (Cerdá-Reverter et al. 1996) y GnRHs (Kah et al. 1994).

Las gonadotropinas (GTHs), hormona estimulante del folículo (FSH) y hormona luteinizante (LH) (llamadas previamente GTH1 y GTH2, respectivamente en teleósteos; Querat et al. 2000), son hormonas clave en el control de la reproducción de vertebrados, incluidos los peces. Se sintetizan en la glándula hipofisaria y se secretan al torrente sanguíneo, para regular todos los procesos de la reproducción. La FSH controla principalmente los primeros estadios de la gametogénesis, mientras que la LH regula la maduración gonadal, ovulación, espermiación y puesta (Swanson et al. 2003). La secreción de las GTHs está regulada desde el cerebro, principalmente por el neuropéptido GnRH. Durante la fase de maduración final de la gónada el GnRH estimula la secreción de LH, induciendo así la ovulación/espermiación y la freza (Breton et al. 1993).

El uso de análogos sintéticos del GnRH (GnRHa) es una terapia extendida a todas las especies de vertebrados, para el tratamiento de diferentes disfunciones reproductivas. En acuicultura, los tratamientos con GnRHa se utilizan para la inducción de la freza, con un éxito variable dependiendo de la especie (Zohar y Mylonas 2001). La optimización y desarrollo de terapias GnRHa eficaces depende en gran medida de la posibilidad de analizar LH plasmática en los animales tratados, como medida de la potencia de estos tratamientos para inducir la secreción hipofisaria de LH. La disponibilidad de un inmunoensayo para la LH también es una herramienta importante para determinar perfiles hormonales durante el ciclo reproductivo de una especie, ya que provee información sobre el estado de los reproductores y su respuesta potencial a tratamientos hormonales exógenos.

Estructuralmente, las GTHs son glicoproteínas diméricas, relacionadas con la hormona estimulante de la tiroides (TSH) y la gonadotropina coriónica (CG). Todas ellas están constituidas por una subunidad α común, denominada subunidad α de glicoproteínas (GPα) y una subunidad β, específica de cada una de las hormonas. Ambas subunidades se sintetizan de manera independiente y se unen, de forma no covalente, para constituir el dímero biológicamente activo, de manera que únicamente la subunidad β confiere la especificidad hormonal al dímero (Hearn y Gomme 2000). Por ello, el desarrollo de inmunoensayos específicos se ha basado en el uso de anticuerpos contra las subunidades β y no contra las hormonas completas (dímero), ya que la inmunización contra la subunidad α produce anticuerpos que reconocen indistintamente las cuatro glicoproteínas. Por otro lado, debido a diferencias estructurales, se hace necesario en algunos casos producir anticuerpos específicos para las hormonas de cada especie de interés. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la LHβ de teleosteos presenta un porcentaje de identidad que varía entre 50% y 98%, con homologías elevadas (>90%) entre miembros de la misma familia, pero reducidas entre especies de diferentes órdenes (Querat et al. 2000, Mateos et al. 2003). De esta forma, anticuerpos contra la LHβ de una determinada especie pueden reconocer de forma similar a las LHβs de especies de la misma familia, pero no de otras y en menor grado cuanto mayor es la distancia filogenética entre las especies.

En las últimas décadas se han puesto a punto radioinmunoensayos (RIAs) o enzimainmunoensayos (ELISAs) para la LH de varias especies de peces. Ambos tipos de inmunoensayos tienen características similares de sensibilidad y precisión, pero los ELISAs tienen la ventaja de usar trazadores marcados con enzimas en lugar de radioisótopos, lo que evita el uso de radioactividad en el ensayo (Engvall 1980). El objetivo del presente trabajo fue, en primer lugar, la purificación y caracterización de la LH de lubina y en segundo lugar, el desarrollo de un ELISA específico que permitiese, por primera vez, analizar niveles plasmáticos e hipofisarios de LH en esta especie. Con ello se dispondría de una valiosa herramienta inmunológica para el estudio de la endocrinología de la reproducción de esta apreciada especie.

 

Material y métodos

Purificación de la LH

Se obtuvieron hipófisis (400, 2.6 g de peso húmedo) de lubinas adultas, machos y hembras, que se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardaron a -80°C, hasta su procesado. Las hipófisis se homogeneizaron mecánicamente en una solución fría de acetato de amonio al 10%, con pH 7.2, conteniendo PMSF 1 mM. El homogenizado se dejó en agitación durante 1 h a 4°C y se centrifugó (5000 g, 45 min, 4°C) para eliminar sólidos. El sobrenadante se ajustó hasta una concentración de 40% de etanol, añadiendo lentamente etanol absoluto, en frío, y se dejó en agitación toda la noche a 4°C para solubilizar las glicoproteínas. Tras centrifugación (15,000 g, 20 min, 4°C), el sobrenadante se ajustó hasta 85% de concentración alcohólica (manteniendo PMSF 1 mM), añadiendo lentamente etanol absoluto, en frío, y se guardó a 4°C toda la noche, sin agitación, para precipitar las glicoproteínas. Tras centrifugación (20,000 g, 30 min, 4°C), se descartó el sobrenadante y el precipitado se dejó secar al aire para evaporar el exceso de etanol.

El extracto alcohólico se disolvió en bicarbonato de amonio 50 mM, a pH 7.8 y se aplicó a una columna de gel filtración Superdex G100 Superfine (Pharmacia LKB Biotechnology, NJ) de 2.5 x 100 cm. La muestra se eluyó en bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7.8, con un flujo de 0.5 mL min^-1. Se recogieron fracciones de 1 mL cada 2 min y se leyó la absorbancia a 280 nm. Las fracciones pertenecientes a cada pico se mezclaron y liofilizaron. La presencia de LH o sus subunidades, en los diferentes picos, se detectó por elución característica en SDS-PAGE y cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (rpHPLC).

Los picos de interés, conteniendo potencialmente LH o subunidades, se disolvieron en bicarbonato de amonio 50 mM, a pH 7.8, y se sometieron a cromatografía de intercambio iónico (IEC) en una columna DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia LKB) de 1 x 5 cm. La muestra se eluyó con un gradiente por pasos de bicarbonato de amonio 100, 200, 500 y 1000 mM, a pH 7.8, recogiendo fracciones de 3 mL cada 9 min. Las fracciones pertenecientes a cada pico se mezclaron, liofilizaron y analizaron para detectar la presencia de LH y subunidades.

El pico seleccionado, conteniendo LH, se disolvió en bicarbonato de amonio 150 mM, a pH 7.8, y se sometió a cromatografía FPLC en columna de gel filtración Superdex 75 Hiload (Pharmacia LKB) de 1.6 x 60 cm, recogiendo fracciones de 4 mL cada 20 min. La muestra se eluyó en el mismo tampón. Las fracciones pertenecientes a cada pico se mezclaron y liofilizaron. La presencia e identidad de la LH y sus subunidades se determinó mediante rpHPLC, SDS-PAGE y secuenciación N-terminal de aminoácidos.

 

Aislamiento y análisis de las subunidades de la LH

Las subunidades de LH se aislaron mediante rpHPLC, en una columna C18 TSK gel ODS-120T (0.46 x 25 cm; tamaño partícula de 5 μm, Tosoh, Japón) usando un sistema de HPLC de bomba binaria (Konik Inc., FL). Las muestras se eluyeron con un gradiente lineal de acetonitrilo del 20 al 50%, conteniendo 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA), durante 60 min, a una temperatura de columna de 40°C y un flujo de 1 mL min^-1. Los picos de proteínas del rpHPLC se analizaron en SDS-PAGE, espectrometría de masas MALDI-TOF y secuenciación N terminal de aminoácidos. La electroforesis se llevó a cabo en un gel de poliacrilamida al 5% en la zona de hacinamiento y al 15% en la de separación (SDS-PAGE), bajo condiciones no reductoras y las proteínas se visualizaron con tinción de plata.

La espectrometría de masas MALDI-TOF la realizó el Centro Nacional de Biotecnología (CSIC, Madrid, España). Para el análisis, las muestras liofilizadas de las subunidades purificadas se disolvieron en 10 μL de acetonitrilo al 50% y TFA al 0.1%, a una concentración de 10 pmol μL^-1 y se mezclaron con un volumen equivalente de ácido trans-3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico saturado en acetonitrilo 30% y TFA 0.1%. La muestra (0.5 μL de la mezcla) se depositó en una punta de sonda de acero inoxidable, se secó a temperatura ambiente durante 5 min y se midió en espectrómetro de masas MALDI-TOF (Bruker Reflex II, Bremen, Alemania).

El análisis de la secuencia de aminoácidos del extremo N terminal se llevó a cabo en el Centro Nacional de Biotecnología (CSIC, Madrid, España), con un secuenciador Precise Protein Sequencing System (model 494, Applied Biosystems, CA). Las secuencias que se obtuvieron se compararon con secuencias similares en el servicio BLAST-2 de bases de datos de proteínas del NCBI.

 

Preparación de los anticuerpos (AbLHβ) de la subunidad LHβ

Se inmunizaron dos conejos con la subunidad LHβ purificada. El liofilizado (LHβ) se resuspendió en NaCl 0.9%, a una concentración de 100 μg mL^-1, y se guardó alicuotado a -80°C. Se aplicó una primera inyección de 1 mL, de una emulsión preparada al 50% con solución de LHβ (50 μg) y adyuvante completo de Freund, administrada en siete puntos bajo la piel dorsal. Posteriormente, los conejos recibieron cinco inyecciones sucesivas, cada una de 50 μg de LHβ disueltas en adyuvante incompleto de Freund, dadas cada cuatro semanas y aplicadas en cuatro puntos, bajo la piel de cada ingle. La titulación del anticuerpo se determinó por ELISA. Al final del proceso de inmunización se sangraron los conejos, el suero se separó por centrifugación (2000 g, 20 min, 4°C) y se guardó a -80°C.

 

Desarrollo y validación del ELISA de LH

Se puso a punto un ELISA competitivo específico para la LH de lubina, basándonos en los protocolos descritos para los ELISAs de la vitelogenina de lubina (Mañanós et al. 1994) y de la LH de lubina americana (Mañanós et al. 1997), quedando establecido como sigue:

1. Recubrimiento ("coating") de los pocillos de las microplacas (96-well Maxisorp, NUNC) con LHβ de lubina (1 ng/ 0.1 mL/pocillo) preparada en tampón carbonato 50 mM, a pH 9.6, durante toda la noche a 4°C. Tres pocillos por placa se recubrieron con la misma concentración de albúmina (BSA, Sigma) para determinar la unión no específica (NSB). Después del recubrimiento, se lavaron los pocillos (3 x 1 min) con tampón PBST (tampón fosfato 10 mM, 0.9% NaCl y 0.05% Tween-20, pH 7.2).

2. Saturación (30 min a 37°C), con 200 μL/pocillo de tampón de ensayo (tampón PBST con suero de cabra normal al 2%). Lavado (3 x 1 min) con tampón PBST.

3. Incubación con anticuerpos específicos (AbLHβ) y muestras/patrón. Previamente, patrón y muestras se preincubaron durante una noche a 4°C con AbLHβ (dilución final 1/80,000), en tubos, diluido en tampón de ensayo. Tras la preincubación, las muestras y el patrón se dispensan por duplicado (100 μL/pocillo) en los pocillos recubiertos y se incuban durante 90 min a 37°C. Los pocillos NSB y cinco pocillos recubiertos con LHβ (ligado máximo, Bo) sólo reciben solución de AbLHβ.

4. Incubación con anticuerpos secundarios. La unión del complejo antígeno-anticuerpo se detectó mediante la incubación (100 μL/pocillo, 30 min, 37°C) con IgG de cabra contra conejo marcada con HRP (GAR-HRP, affinity purified ETA grade, BioRad), diluida 1/3000 en tampón de ensayo. Tras incubación, lavado (3 x 1 min) con tampón PBST.

5. Revelado del color por adición de 100 μL/pocillo de TMB (BioRad). La reacción (en oscuridad a temperatura ambiente) se para tras 20 min, añadiendo 100 μL/pocillo de H₂SO₄ 1 N. Se determinaron las absorbancias a 450 nm, usando un lector automático de microplacas (BioRad).

El ensayo se validó para muestras de plasma e hipófisis de lubina. El plasma se obtuvo por centrifugación (3000 g, 15 min, 4°C) de sangre extraída de lubinas adultas, machos y hembras, por punción caudal, usando jeringas y tubos heparinizados. El plasma, guardado a -80°C se utilizó directamente en el ELISA, a la dilución apropiada, sin ningún procesado adicional. Las hipófisis se obtuvieron de los mismos animales y se extrajeron por homogeinización en 0.5 mL de tampón fosfato 10 mM, a pH 7.2, NaCl al 0.9%, en frío, usando un polytron. El homogeneizado se dejó reposar en hielo 30 min y se centrifugó (2500 g, 30 min, 4°C) para eliminar sólidos. Posteriormente se congeló a -80°C hasta su análisis por ELISA, sin ningún procesado adicional.

Para el experimento de tratamiento hormonal se utilizaron lubinas hembras adultas (4 años, 0.8 ± 0.25 kg), mantenidas en instalaciones nuestras en condiciones naturales de luz y temperatura (16°C durante el experimento) y en estado de maduración final oocitaria (diámetro oocitos ~450 μm). Los peces se distribuyeron en tanques circulares de 3000 L, en cuatro grupos homogéneos (n = 6) y se trataron con 5, 25 ó 50 μg kg^-1 de GnRHa ([D-Ala⁶, Pro⁹ Net]-LHRH, Sigma), o bien recibieron una inyección de solución salina (controles). Los tratamientos se aplicaron una sola vez sobre peces anestesiados (inmersión en 300 ppm fenoxietanol, Sigma), por inyección intraperitoneal y, posteriormente, se muestrearon a 1.5, 3, 6, 12 y 24 h post-tratamiento (pt), para la obtención de sangre por punción caudal, usando jeringas y tubos heparinizados. El plasma se obtuvo por centrifugación (3000 g, 15 min, 4°C) y se guardó a -80°C para el posterior análisis de LH por ELISA.

 

Estadística

Todos los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM). Para el experimento de inducción hormonal, las diferencias entre las medias se analizaron entre los diferentes grupos, para cada punto de muestreo, mediante análisis de la varianza (ANOVA), seguida del test de rango LSD (diferencias significativas mínimas). Previa y respectivamente, se verificaron la normalidad y la homogeneidad de las varianzas mediante el test de Kolmogorov-Smirnov y el test de Bartlett. La significación se aceptó en todos los casos a P < 0.05. Para los cálculos del ELISA, las curvas sigmoideas se linealizaron usando la trasformación logit, logit (B/B₀) = ln (B-N/B₀-B), siendo B la unión de cada punto, B₀ la unión máxima y N la unión no específica. El paralelismo entre las curvas de desplazamiento se analizó mediante el análisis de la covarianza. Las regresiones lineales se analizaron por el método de los mínimos cuadrados.

 

Resultados

Purificación de la LH y sus subunidades en la lubina

La LH se purificó a partir de hipófisis de lubinas adultas mediante extracción alcohólica y varios pasos de cromatografía (fig. 1). La elución del extracto alcohólico hipofisario en cromatografía de gel filtración, dió lugar a seis picos principales (fig. 1a) cuyo análisis por SDS-PAGE y rpHPLC mostró la presencia de posible LH en el pico G4. La elución del pico G4 en SDS-PAGE, en condiciones no reductoras, mostró, junto con otras proteínas, una banda predominante de 31 kD, la cual se disociaba en dos bandas menores de 12 y 22 kD en condiciones reductoras. En rpHPLC, el pico G4 dió lugar a varios picos, detectándose las proteínas de 12 y 22 kD en los picos que eluyeron a 40 y 45 min. La secuenciación de aminoácidos N-terminal de estos dos picos, los identificó como las posibles GPα y LHβ de lubina. También se detectaron subunidades GPα y LHβ libres en las fracciones G5 y G6, que eluyeron cerca del pico G4, mientras que las fracciones G1, G2 y G3 contenían otras proteínas.

La separación del pico G4 en cromatografía de intercambio iónico (IEC) dio lugar a cinco picos (fig. 1b). Mediante SDS-PAGE y rpHPLC, la posible LH se detectó en las fracciones eluídas a 500 mM (pico IEC4), mientras que se detectaron subunidades libres eluídas a 200 mM. La purificación final de la LH se realizó por FPLC, con cromatografía de gel filtración, sobre el pico IEC4 (fig. 1c). Las subunidades α y β se aislaron mediante rpHPLC (fig. 2). La mayoría de las subunidades se obtuvieron a partir del pico de IEC que eluyó a 200 mM, aunque de otros picos de IEC se obtuvieron cantidades menores.

La identidad y pureza de la LH y de sus subunidades se analizó mediante SDS-PAGE, rpHPLC, espectrometría de masas MALDI-TOF y secuenciación de aminoácidos N-terminal. En SDS-PAGE, la preparación de LH dió lugar a una sola banda proteica (fig. 2), con un peso molecular alrededor de 30 kD, similar al descrito para las LHs de otras especies. En rpHPLC, bajo condiciones ácidas, la LH intacta se separó en dos picos (fig. 2) y cada pico dió lugar en SDS-PAGE a una sola banda proteica, en posiciones apropiadas al peso molecular esperado para las posibles subunidades LH α y β, en torno a 12 y 22 kD, respectivamente (fig. 2). La secuenciación de aminoácidos N-terminal mostró residuos únicos en cada pico del rpHPLC, indicando la pureza de las preparaciones. La secuencia del extremo N-terminal de la preparación de GPα fue Y-P-S-M-D-L-S-N-M-G y de la LHβ fue F-Q-L-P-P-C-Q-L-I-C, correspondiendo ambas con las secuencias aminoacídicas de las subunidades de la LH de lubina, deducidas de sus respectivos cDNAs (Mateos et al. 2003). El análisis de las subunidades de la LH por espectrometría de masas MALDI-TOF, dió pesos moleculares de 12.395 kD para la GPα y 15.134 kD para la LHβ.

 

Desarrollo y validación del ELISA de la LH de lubina

Se desarrolló un ELISA competitivo para analizar niveles de LH en muestras de sangre e hipófisis de lubina. La LH intacta se usó para la curva patrón, la subunidad LHβ para revestir ("coating") los pocillos y los AbLHβ de lubina para la detección. En la puesta a punto del ELISA se realizaron pruebas de dilución para determinar las diluciones adecuadas del antígeno (paso de recubrimiento) y del anticuerpo específico (paso de competencia), para conseguir valores de absorbancia máxima (B₀) alrededor de 1. Los mejores resultados de sensibilidad y exactitud se obtuvieron con tiempos de incubación comprendidos entre 75 y 120 min, a 37°C (en las microplacas), precedidos por una preincubación durante toda la noche a 4°C. En la incubación del anticuerpo secundario (GAR-HRP), los valores B₀ alcanzaron la saturación a los 20 min y con concentraciones no mayores de 1:3.000. En condiciones óptimas, el límite de detección de la curva patrón estuvo alrededor de 25 pg/pocillo (B_i/B₀ 85%) y 50% de desplazamiento ocurrió a 80 pg/pocillo (B_i/B₀ 50%). En la figura 3 se muestra una curva patrón típica del ELISA, junto con desplazamientos paralelos de curvas de dilución de muestras de plasma e hipófisis. La precisión del ensayo se determinó calculando los coeficientes de variación (CV) intra e interensayo. El intraensayo, calculado por análisis de replicados de la misma muestra dentro de un mismo ensayo, dio CVs del 13.5% (n = 8) y 11.7% (n = 8), para muestras de hipófisis con alta (B_i/B₀ 35 ± 1.6%) y baja (B_i/B₀ 55 ± 2.3%) concentración de LH, respectivamente. El interensayo se calculó midiendo replicados de la misma muestra en ensayos diferentes (n = 10), dando CVs de 8.6%, 11.0% y 6.5%, al 28 ± 0.8%, 51 ± 1.8% y 73 ± 1.5% de desplazamiento (B_i/B₀), respectivamente. La curva de dilución del extracto hipofisiario de lubina fue paralela a las curvas obtenidas con extractos hipofisiarios de otras especies de peces (fig. 3b), lo que permite emplear el ELISA en el análisis de LH en estas especies de peces perciformes.

La validación fisiológica del ELISA se realizó analizando los niveles plasmáticos de LH en hembras de lubina tratadas con diferentes dosis de GnRHa ([D-Ala⁶, Pro⁹Net]-LHRH). Todas las dosis de GnRHa provocaron un rápido incremento (1.5 h p.t.) de la LH plasmática, de similar magnitud, alcanzando unos 30 ng mL^-1 en los animales tratados, frente a niveles no detectables en los controles (fig. 4). La LH plasmática se mantuvo significativamente elevada con respecto a los controles durante 24 h en todos los grupos tratados. Dosis altas (50 μg kg^-1) y medias (25 μg kg^-1) de GnRHa tuvieron un efecto similar en la inducción de la secreción de LH y fueron significativamente más potentes que la dosis baja (5 μg kg^-1), entre las 6 y 12 h posteriores a la inyección.

 

Discusión

En este estudio se purificó la LH de lubina por métodos cromatográficos similares a los descritos para el aislamiento de las GTHs de salmónidos (Kawauchi et al. 1989, Swanson et al. 1991) y lubina americana (Mañanós et al. 1997). Se ha demostrado, por métodos químicos, que este procedimiento de purificación da lugar a preparaciones de gran pureza de LH intacta y de sus subunidades α y β. El peso molecular de la LH intacta determinado por SDS-PAGE fue de 31 kD, similar a los de otras LHs de teleósteos, que varían entre 27 y 39 kD, dependiendo de la especie (Swanson et al. 1991, Van Der Kraak et al. 1992, Koide et al. 1993, Okada et al. 1994, Mañanós et al. 1997, Weltzien et al. 2003). En cuanto a las subunidades α y β, que eluyeron como bandas únicas en SDS-PAGE, éstas dieron pesos moleculares de 12 y 22 kD respectivamente, valores situados en el rango de 15 a 22 kD para GPα y de 18 a 24 kD para LHβ, descrito en otras especies de peces (Swanson et al. 1991, Van Der Kraak et al. 1992, Tanaka et al. 1993, Okada et al. 1994, Mañanós et al. 1997, Weltzien et al. 2003). En nuestro estudio, el peso molecular de las subunidades se determinó también con mayor precisión por espectrofotometría de MALDI-TOF, lo que dió pesos moleculares de 12.4 kD para la GPα y de 15.1 kD para la LHβ. Esta sobreestimación de los valores obtenidos por SDS-PAGE, respecto al MALDI-TOF, es probablemente debida al efecto que las cadenas de carbohidratos tienen en la movilidad proteica en los geles de SDS-PAGE.

La LH purificada de lubina, eluída como un pico único en FPLC, se separó en dos picos cuando se sometió a rpHPLC en condiciones ácidas mostrando que la preparación contenía una única molécula compuesta por dos subunidades. Por otro lado, los picos en rpHPLC de las subunidades α y β tenían forma multidentada, reflejo probablemente de la presencia de diferentes isoformas glicosiladas de las subunidades. La presencia de isoformas de LH, demostrada en peces y otros vertebrados, es una característica importante de la LH, que confiere a la hormona diferentes grados de actividad biológica (Ulloa-Aguirre et al. 2001).

A pesar de una concienzuda búsqueda, mediante rpHPLC y secuenciación N-terminal, no se encontraron trazas de FSHβ durante el proceso de purificación. Esto ha sido observado, en mayor o menor medida, en todos los estudios que han abordado la purificación de FSHβ en peces no salmónidos, poniendo de relieve grandes dificultades en la purificación de la FSH en estas especies (Mañanós et al. 1997, Weltzien et al. 2003). Además, es posible que las hipófisis de lubina empleadas en nuestro proceso de purificación, tuvieran inicialmente un contenido bajo en FSH, ya que se obtuvieron de lubinas en época de prepuesta. Los estudios en salmónidos han revelado que en este momento reproductivo el contenido hipofisiario de FSH es bajo, en contraste con un alto contenido en LH, lo cual refleja el papel funcional que desempeña cada hormona en las diferentes fases del desarrollo gonadal (Breton et al. 1993, Slater et al. 1994, Swanson et al. 2003).

La disponibilidad de preparaciones puras de LH y LHβ, así como la obtención de anticuerpos específicos LHβ, permitió el desarrollo de un ELISA específico para la LH de lubina. Este inmunoensayo se optimizó a una sensibilidad de alrededor de 0.65 ng mL^-1, aunque se detecta desplazamiento significativo de la unión del anticuerpo a concentraciones de 0.15 ng mL^-1. La sensibilidad de los RIAs, previamente desarrollados para la LH de otras especies de peces, varía entre 0.3 y 7 ng mL^-1 (Zohar et al. 1990, Tanaka et al. 1993, Hernández et al. 2002), mientras que para los ELISAs de LH descritos varía entre 70 y 156 pg mL^-1 (Kah et al. 1989, Salbert et al. 1990, Mañanós et al. 1997).

Se validó el ELISA para el análisis de LH en muestras de plasma e hipófisis de lubina. Asimismo, también se demostró su validez para otras especies de Perciformes, comprobando el paralelismo de sus extractos hipofisarios con la curva patrón del ELISA y con la curva de desplazamiento de hipófisis de lubina. Este alto grado de reconocimiento inter-especies del AbLHβ de lubina, probablemente es reflejo de la similitud estructural (secuencia aminoacídica) existente entre las LHβs de especies filogenéticamente cercanas (Quérat et al. 2000, Mateos et al. 2003).

El tratamiento de lubinas con GnRHa provocó una elevación brusca de los niveles de LH plasmática. El GnRHa es un potente inductor de la secreción de LH hipofisaria (Zohar y Mylonas 2001) y se utiliza ampliamente para la inducción hormonal a la puesta en especies acuícolas (Mylonas y Zohar 2001). Las dosis analizadas en este estudio (5, 25 y 50 GnRHa μg kg^-1) corresponden al rango de dosis normalmente empleado en las terapias de inducción a la puesta en peces. Una inyección de GnRHa de 15 μg kg^-1 induce la puesta del 100% de las hembras maduras de lubina a los 2-3 días pt (Fornies et al. 2001). La inducción de la puesta de huevos por el GnRHa es consecuencia de la estimulación de los procesos de maduración final de la gónada y ovulación, a través de una cascada hormonal iniciada por el efecto estimulador de la GnRHa sobre la secreción hipofisiaria de LH. En nuestro estudio, analizando los niveles plasmáticos de LH, se observó una primera elevación de los niveles de LH a los 90 min de la inyección, manteniéndose niveles elevados por encima de los controles durante 24 h. A pesar de que el aumento de LH se induce de forma similar con las tres dosis de GnRHa, a las 12 h pt los niveles de LH son significativamente mayores en los peces tratados con dosis altas que en los tratados con dosis bajas. Es posible que, en una primera fase, las tres dosis de GnRHa induzcan la rápida secreción (1.5 h pt) de la LH almacenada en la hipofisis, actuando con una potencia similar, mientras que en una fase posterior (12 h pt), se podría estar produciendo también la secreción de LH sintetizada de novo en la hipófisis, lo cual podría estar estimulado de forma diferente por cada una de las dosis de GnRHa (Mañanós et al. 2002). El efecto estimulador del GnRHa sobre la síntesis de LH se ha demostrado en varias especies de peces. En lubina europea (Mateos et al. 2003) y carpín dorado (Khakoo et al. 1994), el tratamiento con GnRHa incrementa los niveles de mRNA de las subununidades GPα y LHβ. Se desconoce si diferentes grados de síntesis de la LH, inducidos por diferentes dosis de GnRHa, podrían dar lugar a efectos fisiológicos distintos en el proceso de estimulación de la maduración final de las gónadas y la ovulación, y por tanto, tener consecuencias sobre la cantidad y calidad de las puestas inducidas hormonalmente.

En conclusión, se obtuvieron preparaciones de gran pureza de LH y sus subunidades α y β, a partir de hipófisis de lubina, que permitieron el desarrollo de un ELISA específico para analizar niveles de LH en muestras de plasma e hipófisis de lubina. Tambien se ha comprobado la validez de este inmunoensayo para analizar LH en varias especies de peces filogenéticamente cercanas a la lubina. El ELISA desarrollado ha mostrado buenas características de sensibilidad, precisión y exactitud. La disponibilidad de este inmunoensayo permitirá avanzar en la investigación de la endocrinología de la reproducción de la lubina y será una herramienta habitual en la optimización de terapias hormonales de inducción a la puesta.

 

Agradecimientos

Este estudio ha sido financiado por la Comunidad Europea (proyecto FAIR CT97-3785) y el gobierno español (proyecto CICYT MAR1998-1542CE).

 

Referencias

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