Nota de Investigación

 

Ejercicio interlaboratorio de bioensayos para la evaluación de la calidad ambiental de sedimentos costeros. V. Ensayo de toxicidad sobre sedimento con juveniles del bivalvo Ruditapes philippinarum

 

Interlaboratory assessment of marine bioassays to evaluate the environmental quality of coastal sediments in Spain. V. Whole sediment toxicity test using juveniles of the bivalve Ruditapes philippinarum

 

MC Casado-Martínez^1*, J Blasco², MA González-Castromil³, I Riba², TA DelValls^1*

 

¹ Departamento de Química Física, Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales, Polígono Río San Pedro s/n, 11510 Puerto Real, Cádiz, España. * E-mail: mcarmen.casado@uca.es

² Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía, Polígono Río San Pedro s/n, 11510 Puerto Real, Cádiz, España.

³ CIS Centro de Investigaciones Submarinas, Laboratorio de Calidad y Medioambiental, Vía Nobel 9, 15890 Santiago de Compostela, A Coruña, España.

 

Recibido en noviembre de 2004;
aceptado en septiembre de 2005.

 

Resumen

Este estudio resume los resultados del ejercicio interlaboratorio realizado en tres laboratorios para evaluar el uso del ensayo con la almeja comercial de Manila Ruditapes philippinarum. Seis muestras de sedimentos dragados se estudiaron mediante dos medidas finales distintas: mortalidad tras dos periodos de exposición distintos (7 y 14 días) y la medida subletal que estudia el porcentaje de organismos enterrados tras 48 h desde el inicio de la exposición. La medida de la letalidad fue sólo sensible tras el periodo más largo de exposición y la contaminación metálica más elevada. La actividad de enterramiento mostró resultados muy variables y altamente dependientes del operador responsable. De acuerdo con estos resultados se recomienda la revisión del protocolo para mejorar su uso en la gestión de dragados portuarios especialmente si se trata de zonas no afectadas por contaminación metálica.

Palabras clave: almeja de Manila, material de dragado, tasa de enterramiento.

 

Abstract

Several species of bivalves and procedures have been used to characterize sediment toxicity. Here we report the results of an interlaboratory exercise that included three different laboratories to evaluate the use of the bioassay using the commercial clam Ruditapes philippinarum. Six different dredged sediments were studied using two different endpoints: lethality after two different exposure periods (7 and 14 days) and burrowing activity after 48 h of exposure. The lethal endpoint was only sensitive to characterize samples with high metallic concentration and following the 14-day exposure period. The burrowing activity showed very variable results that evidence the unsuitability of this endpoint for dredged material characterization. According to these results, a new design is recommended for the test using juvenile bivalves if it is to be used to characterize sediment samples on a regulatory context especially if sediments are not affected by metallic contamination.

Key words: Manila clam, dredged material, burrowing activity.

 

Introducción

Varias especies de moluscos bivalvos han sido identificadas como indicadores de contaminantes, especialmente de origen metálico, en sedimentos, como por ejemplo Scrobicularia plana (Byrne y O'Halloran 1999, Riba et al. 2003, 2004a), Macoma balthica (Bryan et al. 1985, Duquesne et al. 2004), Tapes decussatus (Mariño-Balsa et al. 2003), o Mya arenaria (Phelps 1990). La almeja Tapes semidecussatus, o Ruditapes philippinarum (Reeves 1864) como también se la conoce, es un molusco bivalvo que se entierra en sedimentos blandos y que puede soportar un amplio rango de salinidad y temperatura (Carter 2004), por lo presenta la ventaja de poder ser usada para evaluar la toxicidad de sedimentos estuáricos. Además, cumple la mayoría de los criterios establecidos para seleccionar especies para realizar ensayos de toxicidad: está disponible a lo largo de todo el año ya que es una especie comercial en España, es fácil de mantener bajo condiciones de laboratorio, es económicamente relevante y además tiene una amplia distribución geográfica.

El uso potencial de esta especie como organismo de ensayo para la evaluación de la toxicidad de sedimentos ha sido investigado en distintos estudios y bajo distintos diseños de ensayo. Byrne y O'Halloran (1999) estudiaron la mortalidad tras 21 días y el enterramiento después del periodo de exposición. También, Phelps (1990) estudió el enterramiento de los organismos y comparó, por medio del análisis Logit, los efectos de la toxicidad mediante el tiempo efectivo en el que se entierran 50% de los organismos. En España se ha utilizado una modificación de estos dos protocolos para evaluar la calidad de sedimentos contaminados mediante el análisis de la mortalidad y del enterramiento (Riba et al. 2004b). Para este ejercicio interlaboratorio se escogió el ensayo con juveniles de R. philippinarum y la mortalidad tras 7 y 14 días, así como la actividad de enterramiento en el sedimento problema, como medidas para la caracterización de la toxicidad de materiales de dragado.

 

Material y métodos

Las almejas fueron obtenidas de un cultivo comercial por cada uno de los laboratorios participantes. Los individuos se recibieron en menos de 24 h y se aclimataron a las condiciones de laboratorio en agua de mar limpia durante al menos dos semanas antes del inicio del ensayo. Durante este periodo los organismos se alimentaron de una mezcla de microalgas (Tetraselmis chuii, Isochrysis galvana y Chaetoceros gracilis) y se mantuvieron en un sistema abierto.

Las condiciones y los parámetros para el desarrollo del ensayo se presentan en la tabla 1. Los sedimentos se añadieron a las cámaras de exposición hasta obtener una profundidad de al menos 5 cm, añadiendo agua de mar en relación 1:3, y se airearon al menos 12 h previamente a la introducción de los organismos. El día de inicio del bioensayo se seleccionaron entre 20 y 40 organismos que fueron introducidos a cada uno de los replicados sucesivamente.

El ensayo subletal finalizó tras 48 h. El número de organismos enterrados en cada uno de los replicados se contabilizó tras 15, 30 y 45 min, y 1, 1.5, 3, 6, 12, 24 y 48 h del inicio de la exposición. Para el cálculo del tiempo estimado en el que se han enterrado 50% de las almejas (TE50) se usó una modificación del análisis Logit. Tras 7 y 14 días se contabilizó el número de organismos vivos mediante el tamizado del sedimento (0.5 mm) y se calculó el porcentaje de mortalidad.

Para el estudio de la variabilidad interlaboratorio se calculó el coeficiente de varianza (CV) de cada muestra dividiendo la desviación estándar (SD) por el valor de la media de los laboratorios (X):

Además, para el estudio de los posibles efectos de esta variabilidad en la clasificación de las muestras como tóxicas o no tóxicas se estudiaron los resultados de cada laboratorio individualmente para establecer diferencias entre el control de toxicidad negativo (muestra A) y cada una de las muestras de sedimentos analizadas, comparando los resultados obtenidos en los distintos laboratorios. Aunque el número de casos fue suficiente para cada muestra (dos replicados con 40 organismos cada uno), los datos no cumplían las condiciones para la utilización de un análisis estadístico paramétrico, por lo que se aplicó el test de Fisher utilizando el programa informático Simple Interactive Statistical Analysis (SISA; http://home.clara.net/sisa/). Los resultados del enterramiento se estudiaron mediante un ensayo de tipo ANOVA y, en caso necesario, se aplicó el test de Tukey para establecer diferencias entre las respuestas. Se utilizó el programa estadístico SPSS 11.0.

 

Resultados

Los laboratorios 1 y 2 realizaron el ensayo dentro de las primeras dos semanas tras el muestreo del sedimento (tabla 1). El laboratorio 3 realizó un primer ensayo, pero los resultados no cumplieron el criterio de aceptabilidad debido a la elevada mortalidad registrada con el control de toxicidad negativo. Este laboratorio realizó un segundo ensayo con las muestras, sin embargo, en esta ocasión el tiempo de almacenamiento fue demasiado largo para estar dentro de los rangos recomendados.

Como puede observarse en los resultados de mortalidad a 7 días, ésta no parece una medida lo suficientemente sensible para este tipo de muestras: la mortalidad tras 7 días en todos los laboratorios y para todas las muestras fueron inferiores a 5%, excepto para la muestra C (tabla 2). La muestra C obtuvo valores de 28.8%, 41.8% y 100% en los laboratorios 1, 2 y 3, respectivamente. Con excepción de esta muestra en todos los laboratorios, el análisis estadístico (fig. 1) clasificó todas las muestras como estadísticamente similares al control (P ≤ 0.05). En cuanto a la mortalidad tras 14 días, ésta alcanzó valores ligeramente superiores para las muestras E y F mientras las muestras B y D mantuvieron mortalidades similares al control negativo. La muestra C aumentó en mortalidad y obtuvo una media de 69.17%. El resultado de los análisis estadísticos mostró diferencias significativas (P ≤ 0.05) para la muestra C pero también para las muestras E y F. A pesar de esta homogeneidad en la clasificación de las respuestas, la variabilidad de los resultados estimada mediante el CV fue elevada debido a las bajas mortalidades. La muestra C, la única con valores de mortalidad superiores, obtuvo un CV de 66.7% aunque éste se redujo a 38% en los resultados tras 14 días.

El estudio de la medida subletal (tabla 3) muestra que los resultados del laboratorio 3 no fueron comparables con los de los otros laboratorios. El principal factor que pudo haber afectado a esta medida es la diferencia entre el número de organismos expuestos ya que este laboratorio utilizó 20 organismos por replicado y encontró dificultades para contar los enterrados debido a la gran velocidad de enterramiento, según el informe enviado con los resultados. Los resultados en los otros laboratorios fueron también muy variables y sólo podrían considerarse importantes las diferencias registradas para la muestra C en el laboratorio 2 (fig. 1).

 

Discusión

De acuerdo con los resultados de este ejercicio, la mortalidad parece una medida que sólo es sensible para la evaluación de toxicidad en muestras con altas concentraciones de compuestos metálicos (Casado-Martínez et al. 2006). Los resultados para la muestra C, con altas concentraciones de As y Cu y en menor medida Hg, Pb y Zn, son los únicos que mostraron diferencias al control negativo tras 7 días de exposición. Al aumentar el tiempo de exposición a 14 días aumentó la mortalidad de las muestras E y F, afectadas por contaminación de tipo metálica (Cu, Cd y Hg) y además con concentraciones altas de PCBs. Distintos autores han relacionado la mortalidad en esta especie de bivalvo con la presencia de contaminantes metálicos (Byrne y O'Halloran 2000, Shin et al. 2002), especialmente con Cd, Cu, Pb y Zn. Por el contrario, la mortalidad registrada en las muestras afectadas por contaminación de tipo orgánica (muestras B y D) fue similar a la mostrada por el control de toxicidad negativo. No se han encontrado referencias bibliográficas que relacionen directamente la mortalidad de esta especie con la presencia de contaminantes orgánicos, pero estos resultados son similares a los encontrados por Riba et al. (2004b), quienes encontraron mortalidades similares a los controles de toxicidad negativos en muestras de sedimentos costeros con concentraciones de Hg y PCBs superiores a los Niveles de Acción 2. De acuerdo con estos resultados, se considera que la letalidad no es una medida sensible para la caracterización de sedimentos afectados únicamente por compuestos de tipo orgánico.

Como ya se ha mencionado anteriormente, los resultados para los distintos laboratorios son homogéneos y la clasificación de las muestras fue similar entre laboratorios. La gran variabilidad interlaboratorio según los altos CV no afecta a la clasificación de las muestras, más bien refleja lo poco adecuado que es este valor para expresar la variabilidad interlaboratorio especialmente para muestras con bajas toxicidades (como en este caso) y si se dispone de un número pequeño de laboratorios. Todos los laboratorios obtuvieron valores de mortalidad bajos para todas las muestras excepto la C: los laboratorios 1 y 2 obtuvieron bajas mortalidades y el laboratorio 3 no registró mortalidad alguna (0%). Al aumentar el tiempo de exposición a 14 días la mortalidad en los dos primeros laboratorios aumentó pero no en el laboratorio 3, lo que hace aumentar los CV de 0-114% tras 7 días a 86.6-173% tras 14 días, aún siendo los resultados homogéneos. En cambio, para la muestra C el aumento de las mortalidades en los dos primeros laboratorios hace descender los CV de 66.7% a 39%. Esta diferencia en los porcentajes de mortalidad, además de influenciar críticamente la noción de variabilidad interlabora-torio ofrecida por los CV, podría deberse a los distintos tiempos de almacenamiento de los sedimentos previamente al ensayo, ya que no se ha identificado ningún otro factor de confusión. El análisis estadístico de los resultados tras 7 días de exposición (fig. 1) clasifica la muestra C como estadísticamente diferente (P ≤ 0.05) al control negativo de toxicidad aunque tras 14 días de exposición lo son también las muestras E y F según los laboratorios 1 y 2. La diferencia en el tiempo de almacenamiento pudo afectar las muestras con concentraciones intermedias de contaminación, y aunque también era de esperarse una disminución de la toxicidad en la muestra C, éste no fue el caso.

En cuanto a los resultados de enterramiento, éstos han demostrado ser una medida inadecuada, al menos siguiendo el protocolo actual. Se han encontrado efectos adversos en la velocidad de enterramiento de organismos en sedimentos contaminados artificialmente con distintos metales (Roper et al. 1995, Shin et al. 2002), y diversos autores han utilizado con éxito el enterramiento como medida subletal para evaluar la toxicidad de sedimentos costeros (Byrne y O'Halloran 1999, Riba et al. 2004b) bajo distintos protocolos. Existen referencias previas en la literatura en las que se utiliza este ensayo para evaluar muestras de sedimentos de puertos (Byrne y O'Halloran 2000), aunque la medida del enterramiento se ha tomado en sedimento limpio, pero tras 10 y 20 días de exposición a los sedimentos contaminados. Estudios previos de esta medida subletal la han relacionado directamente con la contaminación metálica de las muestras, pero no existen datos para la contaminación de tipo orgánico a excepción de los registrados para sedimentos contaminados con crudo en los que la velocidad de enterramiento ha mostrado una disminución de (Olla y Bejda 1983). Esos resultados parecen confirmar la respuesta registrada para la muestra C, con valores elevados de los componentes metálicos analizados (Casado-Martínez et al. 2006), pero no la obtenida con el resto de las muestras, las cuales presentaban contaminación de tipo orgánico. De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, en este sentido no se consideraría recomendable la medida del enterramiento en los sedimentos al inicio de la exposición. Aunque esta medida subletal pudiera ser una medida eficaz para predecir efectos potenciales dado que el enterramiento se considera un método de defensa contra la depredación, si se requiere utilizar en ensayos de toxicidad debería cambiarse el protocolo de ensayo y posiblemente adaptarlo al utilizado por Byrne y O'Halloran (2000).

Aunque este ensayo puede ser utilizado con éxito para la evaluación de la toxicidad de sedimentos costeros afectados por contaminación metálica mediante el uso de la medida letal y subletal, el protocolo aplicado no parece recomendable para la evaluación de la toxicidad de materiales de dragado. La baja sensibilidad de esta especie para clasificar los sedimentos como tóxicos de acuerdo con sus efectos letales, posiblemente debida a la disponibilidad de la contaminación presente a este tipo de organismos filtradores, podría aumentarse mediante la exposición de los organismos durante periodos de tiempo más largos, aunque esto aumentaría la relación coste-eficacia del ensayo. En el caso de la medida subletal, se han encontrado dificultades en cuanto al número de laboratorios capaces de desarrollar con éxito el ensayo. De acuerdo con estos resultados, pareció inadecuado considerar valores límites de toxicidad para la clasificación de materiales de dragado. En cualquier caso, y si el laboratorio lo cree conveniente, este ensayo puede ser incluido como parte de una serie más amplia de estudios para la caracterización de dragados portuarios ya que ofrece información útil y complementaria a otros bioensayos.

 

Agradecimientos

Nuestro agradecimiento a Rosa Vázquez y al personal de la planta de cultivos marinos de la Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales por su ayuda durante la aclimatación de los organismos. Los autores agradecen a Laura Martín y Natalia Jiménez su ayuda durante el ejercicio. Este trabajo fue financiado parcialmente por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (REN2002 01699/TECNO). El diseño de los ensayos de toxicidad para la caracterización de material de dragado se realizó mediante un proyecto conjunto entre el CEDEX y la Universidad de Cádiz (2001 y 2003). MC Casado fue financiada por el Ministerio Español de Educación y Ciencia en el programa de Formación de Personal Investigador (FPI). Nuestro agradecimiento a A. Luque por sus comentarios durante la preparación del manuscrito final.

 

Referencias

Bryan GW, Langston WJ, Hummerstone LG, Burt GR. 1985. A guide to the assessment of heavy-metal contamination in estuaries using biological indicators. Mar. Biol. Assoc. UK Occ. Publ. 4: 1-92.         [ Links ]

Byrne PA, O'Halloran J. 1999. Aspects of assaying sediment toxicity in Irish estuarine ecosystems. Mar. Pollut. Bull. 39: 97-105.         [ Links ]

Byrne PA, O'Halloran J. 2000. Acute and sublethal toxicity of estuarine sediments to the Manila clam, Tapes semidecussatus. Environ. Toxicol. 15: 456-468.         [ Links ]

Carter MC. 2004. Tapes philippinarum. Manila clam. Marine Life Information Network: Biology and Sensitivity Key Information Sub-programme [on-line]. Plymouth: Marine Biological Association of the United Kingdom [cited 28/06/2005]. Available from http://www.marlin.ac.uk/species/Tapesphilippinarum.htm.         [ Links ]

Casado-Martínez MC, Buceta JL, Forja JM, DelValls TA. 2006. Interlaboratory assessment of marine bioassays to evaluate the environmental quality of coastal sediments in Spain. I. Exercise description and sediment quality. Cienc. Mar. (this issue).

Duquesne S, Liess M, Bird DJ. 2004. Sublethal effects of metal exposure: Physiological and behavioral responses of the estuarine bivalve Macoma balthica. Mar. Environ. Res. 58: 245-250.         [ Links ]

Mariño-Balsa JC, Pérez P, Estévez-Blanco P, Saco-Álvarez L, Fernández E, Beiras R. 2003. Assessment of the toxicity of sediment and seawater polluted by the Prestige fuel spill using bioassays with clams (Venerupis pullastra, Tapes decussatus and Venerupis rhomboideus) and the microalga Skeletonema costatum. Cienc. Mar. 29: 115-122.         [ Links ]

Olla BL, Bejda AJ. 1983. Effects of oiled sediment on the burrowing behaviour of the hard clam, Mercenaria mercenaria. Mar. Environ. Res. 9: 183-193.         [ Links ]

Phelps HL. 1990. Development of an estuarine sediment burrowing bioassay for shipboard use. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 45: 722-728.         [ Links ]

Riba I, Zitko V, Forja JM, DelValls, TA. 2003. Deriving sediment quality guidelines in the Guadalquivir Estuary associated with the Aznalcóllar mining spill: A comparison of different approaches. Cienc. Mar. 29: 261-264.         [ Links ]

Riba I, Casado-Martínez MC, Blasco J, Delvalls TA. 2004a. Effects of heavy metals bound to sediments affected by a mining spill using Solea senegalensis and Scrobicularia plana. Mar. Environ. Res. 58: 395-399.         [ Links ]

Riba I, Casado-Martínez MC, Forja JM, DelValls TA. 2004b. Sediment quality on the Atlantic coast of Spain. Environ. Toxicol. Chem. 23: 271-282.         [ Links ]

Roper DS, Nipper MG, Hickey CW, Martin ML, Weatherhead MA. 1995. Burial, crawling and drifting behaviour of the bivalve Macomona liliana in response to common sediment contaminants. Mar. Pollut. Bull. 31: 471-478.         [ Links ]

Shin PKS, Ng AWM, Cheung RYH. 2002. Burrowing responses of the short-neck clam Ruditapes philippinarum to sediment contaminants. Mar. Pollut. Bull. 44: 133-136.         [ Links ]