Artículos

 

Incorporación, depuración y efecto del cadmio en el mejillón verde Perna viridis (L. 1758) (Mollusca: Bivalvia)

 

Uptake, depuration and effect of cadmium on the green mussel Perna viridis (L. 1758) (Mollusca: Bivalvia)

 

Noelis Narváez¹*, César Lodeiros¹*, Osmar Nusetti², Mairin Lemus² y Alfonso N. Maeda-Martínez³

 

¹ Instituto Oceanográfico de Venezuela Universidad de Oriente Cumaná 6101, Venezuela * E-mail: noelisnarvaez@yahoo.es; clodeiro@sucre.udo.edu

² Departamento de Biología Escuela de Ciencias Universidad de Oriente Cumaná 6101, Venezuela.

³ Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste Mar Bermejo 195 Col. Playa Palo de Santa Rita, 23090 La Paz, Baja California Sur, México.

 

Recibido en diciembre de 2003;
aceptado en octubre de 2004.

 

Resumen

Se evaluó el efecto de una concentración subletal de cadmio (0.04 µg Cd L^-1) sobre la condición fisiológica de juveniles del mejillón verde Perna viridis (22.3 ± 2.33 mm de alto de la concha), recolectados en la localidad de Guayacán, Estado Sucre, Venezuela. Los organismos se expusieron a la concentración subletal durante 7 días, y después a un proceso de depuración de 52 días, en condiciones de laboratorio y en su medio natural (campo) mantenidos en cestas plásticas suspendidas de una línea madre (long-line). En ambas condiciones se midió las concentración de Cd en el tejido y se determinaron diferentes índices fisiológicos: consumo de oxígeno, excreción de amonio, proteínas totales, índice ARN/ADN y dimensión (alto), y masas secas de la concha y del tejido. Durante la exposición al metal en condiciones de laboratorio, no se observaron diferencias significativas en los índices utilizados; sin embargo, durante el proceso de depuración todos los parámetros de crecimiento, en general, aumentaron significativamente al final del experimento, en los organismos trasladados al medio natural. El índice ARN/ADN mostró gran variabilidad, lo que indica que éste no fue adecuado para evaluar el efecto del cadmio. Sin embargo, el contenido total de proteínas, la masa seca de los tejidos, el alto de la concha y, particularmente, el consumo de oxígeno y la excreción de amonio, mostraron ser índices apropiados para evaluar la condición fisiológica del mejillón expuesto a dosis subletales de cadmio.

Palabras clave: toxicología acuática, metal pesado, índices fisiológicos, contaminación marina, bivalvos.

 

Abstract

We evaluated the effect of a sublethal concentration of cadmium (0.04 µg Cd L^-1) on the physiological condition of the juvenile green mussel Perna viridis (22.3 ± 2.33 mm shell height), collected in Guayacán, Sucre State, Venezuela. The mussels were exposed to the sublethal concentration for 7 days, and were then depurated during 52 days simultaneously in the laboratory and in the field in plastic baskets suspended from a long line. In both conditions, the concentration of cadium was measured and different physiological indices were determined: oxygen consumption, ammonia excretion, total protein content in tissues, RNA/DNA ratio, and height and mass of the shell and tissues. No significant differences in the physiological indices were obtained during the depuration process in the laboratory but, in general, all the indices tested increased during depuration in the field. The RNA/DNA index showed great variability, proving to be unsuitable to evaluate the toxic effect of cadmium; however, total protein content, shell and tissue height and mass and, particularly, oxygen consumption and ammonia excretion rate proved to be suitable to evaluate the physiological condition of mussels exposed to subletal concentrations of xenobiotics.

Key words: aquatic toxicology, heavy metals, physiological indices, marine contamination, bivalves.

 

Introducción

La selección de especies modelo como organismos estándares para monitorear y predecir la contaminación ambiental es fundamental para los estudios y programas de manejo preventivo de los ecosistemas. Los bivalvos han sido ampliamente utilizados para evaluar la calidad ambiental de los ecosistemas acuáticos ya que tienen la capacidad de bioacumular en sus tejidos los contaminantes presentes en el medio; además, su carácter sésil y filtrador los hace útiles como reveladores de los eventos que ocurren en las áreas donde habitan. Un buen ejemplo lo representan las ostras Crassostrea virginica y C. gigas (Scanes, 1996), y los mejillones de aguas templadas Mytilus edulis y M. galloprovincialis y de aguas tropicales Perna viridis (Beaumont et al., 1987; Pavicic et al., 1994; Hoare et al., 1995; Rojas et al., 2002). No obstante, la distribución de los bancos naturales de estas especies se limitan a zonas zoogeográficas definidas y, por lo tanto, se hace necesario la selección de especies que se puedan utilizar como modelos con un carácter más universal. En este sentido, el mejillón verde P. viridis, una especie de importancia acuícola (Gallardo et al., 1992; Tejera et al., 2000; Manoj y Appukuttan, 2003) que ha sido ampliamente utilizada como organismo bioindicador de contaminación en zonas tropicales del Océano Indopacífico (Lowe, 1995; Chidambaran, 1996; Krishnakumar et al., 1996), recientemente ha expandido su distribución hacia el Atlántico tropical (Agard et al., 1992; Lodeiros et al., 1999), lo cual permite considerarla como una especie con una distribución más amplia en los trópicos. En consecuencia, son de suma importancia los estudios sobre la respuesta fisiológica de esta especie a la contaminación presente en el ecosistema marino, como parte de los esfuerzos hacia la protección de la fauna acuática.

Se han empleado diversos índices fisiológicos para evaluar el estrés producido por contaminantes en los organismos acuáticos. Por ejemplo, Widdows (1985) sugiere evaluar el consumo de oxígeno, la excreción de amonio y medidas de crecimiento y reproducción, como parámetros de respuesta adecuados para analizar el impacto fisiológico de los contaminantes en organismos marinos. Otro índice utilizado ha sido la relación ARN/ADN, la cual permite establecer la condición fisiológica de los organismos en un momento dado (Pease, 1976; Buckley y Lough 1987; Bulow, 1987; Shcheiban, 1992; Moss, 1994). Este índice ha sido propuesto recientemente para evaluar los efectos de contaminantes en moluscos bivalvos (Acosta, 2001; Acosta y Lodeiros, 2001); sin embargo, tiene la desventaja de que puede ser modificado por eventos biológicos, distintos al crecimiento somático, que demanden energía como es el caso de la reproducción (Lodeiros et al., 1996).

Entre los contaminantes presentes en el medio ambiente marino, los metales pesados se caracterizan por ser altamente persistentes, y su peligrosidad para los organismos radica en ser tóxicos a pequeñas concentraciones (Adriano, 1986; Sadiq, 1992). Dentro de los metales, el cadmio es un elemento no esencial para el funcionamiento normal de los organismos y su presencia en el medio ambiente marino corresponde en su mayor parte a fuentes antropogénicas. En el presente trabajo se estudió el proceso de incorporación de cadmio en el tejido de P. viridis, y se evaluó el proceso de depuración de este metal, comparativamente en el laboratorio y en el mar, a través de índices fisiológicos.

 

Materiales y métodos

El estudio se llevó a cabo con ejemplares juveniles de P. viridis recolectados de la zona de Guayacán, ubicada en la parte norte de la Península de Araya, Estado Sucre, Venezuela (fig. 1). Los ejemplares fueron mantenidos en el laboratorio (26 ± 2°C, salinidad de 36%o y una saturación de oxígeno >90%) durante siete días, con recambios de agua diarios y alimentación ad libitum con la microalga Dunaliella salina. Entre estos organismos se seleccionó un grupo de 1200 mejillones de talla homogénea (22.3 ± 2.33 mm de alto de la concha), los cuales se utilizaron para el bioensayo de exposición al metal (incorporación) durante otros siete días. Se colocaron 120 mejillones por acuario de 6 L de capacidad y se establecieron cuatro réplicas, tanto para el grupo control (no expuesto) como para el grupo expuesto al metal. Este último contenía una dosis subletal de 0.04 µg Cd L^-1 en forma de Cl₂Cd. Antes del ensayo de incorporación se determinó la dosis subletal mediante el análisis de supervivencia del mejillón ante la exposición a diferentes concentraciones de cadmio (0.00, 0.2, 2, 20, 40 y 100 µg Cd L^-1) y por triplicado por un período de 96 h. La concentración subletal fue seleccionada tomando como referencia la concentración por debajo del límite inferior de confiabilidad al 95% del LC50, la cual garantiza la supervivencia de los organismos.

Las condiciones experimentales durante el bioensayo fueron las mismas descritas en el proceso de aclimatación, pero sin recambio de agua y sin alimentación.

Después del bioensayo de incorporación, se llevó a cabo el proceso de depuración, durante 52 días. Para ello, los mejillones de cada una de las réplicas se dividieron en dos grupos de 60 ejemplares cada uno. Uno de los grupos fue trasladado a la localidad de Turpialito, donde fueron mantenidos en cestas plásticas suspendidas de una línea madre (long-line) a una profundidad de 4 m. El otro grupo se mantuvo en el laboratorio, bajo las condiciones antes descritas y con recambios de agua y alimentación diaria con la microalga D. salina (3000 cél mL^-1). Para determinar el estado fisiológico de los organismos, se tomaron cinco ejemplares de cada grupo y réplicas al primer, tercer y séptimo día del bioensayo de incorporación y a los 3, 10 y 52 días de depuración.

En ambos estudios se determinó el consumo de oxígeno y la excreción de amonio de los organismos durante 1 h, en un respirómetro de 200 mL, con agua previamente aireada por 1 h. La concentración de oxígeno se determinó por el método de Winkler y la concentración de amonio según Solorzano (1969). A cada uno de los cinco individuos utilizados para estos análisis se les determinaron la concentración de proteínas totales, el índice ARN/ADN, las masas secas de la concha y del tejido, el alto de la concha y la concentración del metal en el tejido. Las proteínas totales se determinaron mediante la técnica colorimétrica de Biuret. La concentración de ácidos nucleicos se determinó según la técnica de fluorescencia de Canino y Calderone (1995), la masa seca del tejido blando al igual que la de la concha fue estimada deshidratándolos a 60°C durante 48 h. El incremento en la talla de la concha se determinó usando un vernier digital Mitutoyo de 0.01 mm de precisión. Para la determinación del cadmio se siguió la metodología de Leonard (1971). Para ello las muestras secas fueron digeridas con una mezcla de ácido nítrico (HNO₃) y perclórico (HCLO₄) (3:1) en baño María a 60°C por 4 h, filtradas con papel Whatman No. 42 y aforadas hasta 25 mL con agua deionizada. Posteriormente se determinó la concentración del metal por espectrofotometría de absorción atómica, usando un espectrofotómetro con llama de aire-acetileno y corrector de fondo de deuterio (Perkin Elmer; modelo 3110), a una longitud de onda de 229 nm, tomándose el promedio de tres lecturas. Para las curvas de calibración se utilizó un estándar de cadmio de 1000 ppm marca Fixanal y la precisión del método fue verificada utilizando el estándar de referencia de tejido NIST Oyster Tissue 1566a.

Antes del proceso de incorporación se tomó una muestra, la cual fue denominada "grupo inicial" y se le determinaron todos los parámetros antes señalados.

Durante los estudios se estimó la supervivencia mediante la respuesta (actividad valvar) ante un estímulo mecánico con una varilla de vidrio.

En el experimento de campo se registró la temperatura continuamente con un termógrafo electrónico (Saelog, Vemco Ltd., Halifax), y semanalmente se tomaron muestras de agua con una botella Niskin de 2 L, para determinar la biomasa fitoplanctónica estimada por clorofila a y el seston (orgánico e inorgánico), según las recomendaciones de Strickland y Parsons (1972), la salinidad con un refractómetro y el oxígeno disuelto (método Winkler) según las especificaciones descritas en Senior (1996).

Los tratamientos se evaluaron mediante la observación correlativa de las curvas obtenidas, contrastando las medias de los parámetros de los índices fisiológicos y de crecimiento a través de un ANOVA de una vía, utilizando la prueba a posteriori de Duncan, en los casos donde existieron diferencias significativas (P < 0.05). Estos análisis se aplicaron para corroborar las diferencias encontradas en los gráficos, dependiendo del análisis de correlatividad de las curvas, sea en cada punto de muestreo para todos los tratamientos o entre muestreos durante el tiempo de estudio.

 

Resultados

En el presente estudio no se registraron organismos muertos. Al inicio del experimento los organismos presentaron una concentración de cadmio de 1.91 ± 0.43 µg Cd g^-1. Durante la fase de exposición al metal se observó un aumento significativo (P < 0.05) en la concentración, hasta alcanzar un valor medio de 10.84 ± 1.15 µg Cd g^-1 a los siete días de exposición. Esta concentración fue unas cinco veces superior a la determinada en los organismos del grupo inicial (fig. 2), y cuyos valores se mantuvieron sin cambios (P > 0.05) a lo largo del experimento. En la fase de depuración, la concentración de cadmio disminuyó en los mejillones mantenidos en el laboratorio (1.86 ± 0.123 µg Cd g^-1), llegando, al final del experimento, a alcanzar valores similares a los del grupo inicial. Un efecto similar fue observado en los organismos depurados en el medio natural, pero la tasa de depuración fue más rápida, alcanzando concentraciones incluso menores (0.34 ± 0.22 µg Cd g^-1) que las del grupo inicial en solamente tres días (día 10).

Los parámetros alto y masa seca de la concha, consumo de oxígeno y excreción de amonio no mostraron diferencias significativas en ninguno de los tratamientos desarrollados en el laboratorio; no obstante, los organismos que fueron llevados al medio natural mostraron incrementos significativos (P < 0.05) hasta el final del experimento, alcanzando los organismos no expuestos al cadmio valores medios significativamente (P < 0.05) superiores a los alcanzados por los organismos previamente expuestos al cadmio (figs. 3, 4).

Al primer día de la fase de exposición al metal se observó una pérdida de aproximadamente 50% de la masa seca del tejido, así como una disminución en el contenido de proteínas, tanto en los organismos no expuestos, como en los expuestos al metal, con respecto a los organismos del grupo inicial. Posteriormente, durante el proceso de depuración, se observó una disminución en la masa seca del tejido de los organismos expuestos previamente al cadmio que se mantuvieron en el laboratorio, particularmente durante los primeros 10 días de depuración, mientras que su contenido de proteínas se mantuvo estable hasta el final del experimento. Los organismos no expuestos al cadmio mantuvieron su masa seca durante el periodo de depuración en el laboratorio. En aquellos organismos que fueron trasladados al mar se observó un incremento progresivo de la masa seca del tejido y del contenido de proteínas en ambos tratamientos, alcanzando al final del estudio valores medios iguales (P > 0.05; fig. 3).

El índice ARN/ADN mostró diferencias significativas (P < 0.05) entre el grupo no expuesto y el expuesto, sólamente al tercer día de exposición al metal, siendo mayor el valor alcanzado por los no expuestos (3.21 ± 0.535). Después del proceso de incorporación, en los organismos que se mantuvieron en el laboratorio se observó un aumento en los valores medios de este índice hasta los 10 días, para luego mantenerse sin cambios significativos (P > 0.05) hasta el final del experimento. En los organismos depurados en el campo se observó en este índice una tendencia a disminuir con ambos tratamientos a los 52 días de depuración (fig. 4). En estos organismos los índices de dispersión con respecto a la media fueron notablemente menores que los de los organismos mantenidos en el laboratorio.

En la figura 5 se muestra la variación de los factores ambientales durante el periodo de estudio. La temperatura varió entre 23°C y 25°C en el mes de julio, excepto hacia finales de éste cuando aumenta para alcanzar temperaturas altas (26-27°C) en el mes de agosto. Contrariamente, la biomasa fitoplanctónica, estimada por la clorofila a, a principios de julio mostró valores altos, alcanzando niveles superiores a 4 µg L^-1, mientras que durante el mes de agosto se mantuvo en valores bajos, generalmente <1 µg L^-1. Principalmente a finales del mes de agosto se registró un periodo con alto contenido de material particulado (12-15 mg), con un 15-43% de seston orgánico, mientras que durante el mes de julio éste se mantuvo sin grandes cambios, oscilando sus valores entre 6 y 9 mg, aunque con valores más elevados de seston orgánico, generalmente de 24% a 42% del seston total. Ni la concentración de oxígeno ni la salinidad mostraron variaciones relevantes durante toda la experimentación. El oxígeno generalmente se mantuvo entre 5.5 y 7.0 mg L^-1 y la salinidad entre 36% y 38%.

 

Discusión

En el presente trabajo se determinó una correlación en el proceso de incorporación del cadmio con respecto al tiempo de exposición, incorporando hacia el final del periodo de incorporación más de cuatro veces la concentración inicial. No obstante, todos los organismos sobrevivieron a dicho proceso, lo cual indica que la incorporación del metal no llegó a un estado de afección severo, reafirmando el carácter subletal de la concentración utilizada. Esta hipótesis es soportada por la ausencia de diferencias significativas en los índices fisiológicos utilizados (crecimiento, proteínas, consumo de oxígeno, excreción de amonio, ARN/ADN) entre los organismos expuestos al cadmio en el experimento y los no expuestos.

La incorporación del cadmio en P. viridis fue muy rápida. Al primer día de exposición ya se había producido la incorporación de metal en el tejido de los organismos, en una proporción notablemente superior a la registrada inicialmente. Esto probablemente se debió a la gran capacidad de filtración que poseen los bivalvos, particularmente los mitílidos. Phillips y Rainbow (1993) indican que especies del género Mytilus acumulan metales en concentraciones considerablemente superiores a las encontradas en el ambiente.

Al igual que la incorporación, el proceso depurativo se caracterizó por ser rápido, sobretodo en los organismos que fueron trasladados al campo, los cuales lograron disminuir significativamente la concentración de metal en el tejido en tan sólo tres días. El tiempo de depuración de los metales por los organismos puede ser considerado corto (10 días para el Cu; Viarengo et al., 1985), intermedio (32 días para As; Ünlü y Fowler, 1979) o prolongado (>120 días para el Cd en los mejillones M. edulis y M. galloprovincialis; Borchardt, 1983; Viarengo et al., 1985). En la presente investigación, la concentración de cadmio en el tejido de P. viridis disminuyó, en un tiempo menor a 52 días, a niveles inferiores a los que traían del medio donde fueron recolectados. Las diferencias encontradas entre los estudios podrían deberse a la concentración utilizada y al tiempo de exposición, así como a la diferenciación en cuanto a la especie y a una mayor capacidad de depuración en el medio natural que en el laboratorio.

En la fase de depuración, a pesar de que los organismos en condiciones de laboratorio fueron alimentados diariamente, no se observó crecimiento alguno, manteniéndose tanto la masa de los tejidos como las capacidades de respiración (consumo de oxígeno) y de excreción (producción de amonio) en valores similares. Esto sugiere que la energía suministrada a través del alimento fue suficiente para soportar el metabolismo básico, aunque con una capacidad anabólica limitada. En contraste, los mejillones mantenidos en el medio natural mostraron crecimiento y aumento en los índices fisiológicos estudiados, como resultado del excedente energético para el crecimiento del organismo.

Durante los procesos de exposición y depuración del metal, en general, no se observaron diferencias significativas en el índice ARN/ADN entre los juveniles del mejillón mantenidos en el laboratorio ni con cada uno de los tratamientos, mostrando una gran variabilidad revelada por sus altos índices de dispersión. Sin embargo, en los organismos que fueron llevados al campo, los valores medios de este índice, para cada uno de los tratamientos, mostraron valores de dispersión de menor magnitud. Inclusive los organismos previamente expuestos al cadmio, al final del experimento, mostraron índices de ARN/ ADN mayores, lo que sugiere una mayor actividad metabólica para el crecimiento, contraria al crecimiento observado tanto por en el tejido como en la concha del bivalvo. Estos resultados, comparados con el resto de los índices fisiológicos estudiados, muestran que el índice ARN/ADN no es adecuado para el análisis de procesos fisiológicos en evaluaciones que involucren diversos estados fisiológicos de los organismos con efectos exógenos tanto ambientales como generados por contaminantes. En un escenario de disponibilidad y canalización energética similar, Lodeiros et al. (1996) y Villegas (2000) sugieren precaución en la utilización del índice de ARN/ADN cuando se involucran procesos fisiológicos como la reproducción, que pudieran disminuir la canalización de energía al crecimiento somático, sobretodo cuando la disponibilidad de alimento no es suficiente para generar la energía necesaria para los dos procesos fisiológicos (crecimiento somático y reproductivo).

Ni la concentración de oxígeno ni la salinidad mostraron variaciones relevantes durante todo la experimentación (entre 5.5 y 7.0 mg L^-1 y 36% y 38%, respectivamente), descartándose una influencia significativa de estos factores debido a su reducida variabilidad anual en la zona de estudio (Lodeiros y Himmelman, 1994, 2000). Tampoco se observó una correlación positiva entre la abundancia fitoplanctónica y el crecimiento de la especie. Sin embargo, para el periodo de agosto se registraron las mayores concentraciones del seston total y las temperaturas más elevadas, coincidiendo con las mayores tasas de crecimiento en los organismos que fueron llevados al ambiente natural, lo que podría indicar que estos factores son posibles moduladores del crecimiento de P. viridis en condiciones de cultivo en el Golfo de Cariaco.

Es importante señalar que al final del experimento no se observaron diferencias significativas en el valor medio alcanzado por la masa seca del tejido entre tratamientos; sin embargo, la concha presentó tanto longitudes como masas significativamente menores en los organismos expuestos al cadmio que las alcanzadas por los organismos no expuestos al metal. Esto podría sugerir que el efecto pudo haberse dado a nivel de la concha y no en el tejido. Villegas (2000) reportó una menor regeneración de la concha en ejemplares de Pinctada imbricata expuestos previamente a una dosis subletal de cadmio con respecto al grupo control. Probablemente, el metal induce procesos de protección, antitóxicos, lo cual deriva en la reducción de la velocidad de regeneración de la concha. En este sentido, los organismos distribuyen la energía acumulada de tal manera que se garanticen los procesos fisiológicos básicos.

En general, la respuesta de un organismo ante el estrés es la utilización de sus reservas energéticas, la cual puede ser medida en términos de utilización de carbohidratos, lípidos y proteínas; sin embargo, es necesario emplear para ello índices más sensibles (Widdows, 1985). El consumo de oxígeno y la excreción de amonio son índices que permiten medir la condición fisiológica de los individuos, tal y como lo señalan estudios realizados en diferentes especies y condiciones (Sivaramakrishna et al., 1991; Sobral y Widdows, 1997). En el presente estudio, tanto el consumo de oxígeno como la tasa de excreción de amonio en condiciones de laboratorio no mostraron diferencias significativas. Sin embargo, los organismos que fueron llevados al medio natural mostraron, al final del ensayo, un aumento significativo en el consumo de oxígeno y en la tasa de excreción de amonio, ambos expresados como valores proporcionales (miligramos de oxígeno o amonio en relación con la masa seca del tejido), manteniéndose los valores medidos en los organismos no contaminados por encima de los de los organismos expuestos al metal. Esto sugiere que durante la exposición al cadmio se generó un efecto crónico que fue detectado a través de la tasa respiratoria y de la excreción. La presencia del metal, en principio, pudo haber afectado la capacidad metabólica mitocondrial, uniéndose a enzimas específicas. De esta manera se generó una probable reducción en la eficiencia de conversión de energía, desacoplando la fosforilación oxidativa, causando estrés oxidativo (Di Guilio et al., 1995). Una vez que los organismos habían disminuido la concentración del metal, la actividad mitocondrial pudo reestablecerse, produciéndose un aumento en la tasa de consumo de oxígeno al final del experimento. En consecuencia, del aumento del consumo de oxígeno (mayor metabolismo) se generaría el aumento de la excreción de amonio observado. En este sentido, para verificar esta hipótesis se sugiere un estudio de la actividad enzimática con especial énfasis a nivel mitocondrial, analizando particularmente procesos catabólicos relativos a la excreción de amonio.

De todos los índices fisiológicos considerados en este estudio, la relación ARN/ADN fue la que no demostró ser un índice adecuado para evaluar el efecto tóxico de metales del cadmio en P. viridis en un análisis de efectos subletales causados por la exposición a xenobióticos. Sin embargo, la determinación de proteínas totales, masa seca de los tejidos, alto de la concha y particularmente el consumo de oxígeno y excreción de amonio, mostraron ser indices apropiados apropiados para evaluar la condición fisiológica de P. viridis expuesto a concentraciones subletales de xenobióticos.

 

Agradecimientos

La investigación fue financieramente soportada por el Fondo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (FONACIT) de Venezuela, el Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente y el CIBNOR, de México. Se agradece la colaboración del Departamento de Oceanografia y de Biología Marina del Instituto Oceanográfico de Venezuela por la asistencia en la determinación de los análisis, de igual manera a C. Graziani por el apoyo logístico para el desarrollo de la investigación.

 

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