Materiales y métodos

Material vegetal. Se emplearon semillas de Nicotiana benthamiana, las cuales fueron germinadas en recipientes de unicel de 120 mL con mezcla fina especial Sunshine #3, el cual contiene peatmoss de fibra corta, cal dolomítica y vermiculita, a 25±2 °C, con fotoperiodo de 16/8 horas luz/oscuridad y fertilización semanal con 4 mL L^-1 de Bayfolan® Forte (Bayer de México, S.A. de C.V. División CropScience).

Material fúngico. Se empleó el hongo Fusarium sp. cepa Inecol_BM-06, proporcionada por el Instituto de Ecología A. C (INECOL), el cual fue aislada del insecto ambrosial Xylosandrus morigerus en el parque ecológico Jaguaroundi, en Coatzacoalcos, Veracruz (^{Carreras-Villaseñor et al., 2022}). La cepa se mantuvo en cajas de medio PDA (Potato Dextrose Agar, BD, Difco™, Franklin Lakes, NJ, USA), con resiembras cada 30 días a temperatura ambiente y también se conservó en glicerol al 20% a -80 °C de 6 a 24 meses.

Clonación del fragmento del gen de quitina sintasa 4 de Fusarium sp. El fragmento del gen CHS4 del hongo se amplificó a partir de ADN, usando los oligos CHS4F, 5’-CAAATTATCCTCATGTCGTTC-3’ y CHS4R 5’-TCAGGATCTTTCACCATGGC-3’. Los oligos amplifican una región de 204 pb, que comprende el dominio característico de la quitina sintasa 4 de hongos filamentosos, diseñados a partir de las secuencias de Fusarium graminearum (XM_011318750.1), F. oxysporum (XM_018376225.1) y F. verticillioides (XM_018888350.1), empleando la herramienta “Primer designing tool” del National Center for Biotechology Information (NCBI, por sus siglas en inglés).

Para la estandarización se realizaron pruebas de gradiente de temperatura de alineamiento, de concentración de templado y de concentración de oligos. Las condiciones de PCR óptimas fueron las siguientes: 1 ciclo a 95 °C por 1 min, 30 ciclos de 95 °C por 20 s, 58 °C por 30 s y 72 °C por 20 s y una extensión final a 72 °C por 5 min. El producto de PCR fue ligado en el vector de clonación pGEM-T Easy (Promega®, Madison, Wi, USA), siguiendo las instrucciones del proveedor. Posteriormente los productos de la ligación se utilizaron para transformar células competentes de Escherichia coli TOP10.

Construcción del vector VIGS EuMV-YP∆CHS4. Para la construcción del vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 se empleó el vector VIGS pEuMV-YP:ΔAV1, diseñado a partir del hemidímero A del geminivirus bipartita Euphorbia mosaic virus-Yucatán península (EuMV-YP; DQ318937) (^{Villanueva-Alonzo et al., 2013}). Se liberó el fragmento de 204 pb del gen CHS4 clonado en el vector pGEM:GCHS4 con las enzimas de restricción SphI y PstI y se ligó al VIGS pEuMV-YP:ΔAV1 que previamente había sido digerido con las mismas enzimas de restricción. La construcción obtenida fue enviada a secuenciar a la compañía Macrogen Inc (Seúl, Corea del Sur). El análisis de la secuencia se realizó en la plataforma BLASTn del NCBI. Las secuencias fueron editadas con los programas Mega 6 (^{Tamura et al., 2013}) y Biedit (^{Hall, 1999}) para eliminar la secuencia correspondiente al vector.

Inoculación de plantas de N. benthamiana con Fusarium sp. Se empleó un cultivo del hongo de 15-30 días de crecimiento en medio líquido PDB (Potato Dextrose Broth, BD Difco™, Franklin Lakes, NJ, USA), se colectó el micelio y se homogenizó en una licuadora durante 1 minuto a máxima velocidad. La concentración de fragmentos se ajustó a 10⁶ fragmentos de micelio mL^-1 y se mezcló con grenetina a una concentración final de 1% (v/v). La mezcla de fragmentos de micelio se aplicó sobre un corte de bisturí de aproximadamente 0.5 mm realizado previamente en el tallo, en el área entre la raíz y el primer peciolo de cada planta. A las plantas control sin inocular (SI) con Fusarium sp. se les colocó grenetina al 1% (v/v) en el punto de corte. Las plantas se mantuvieron en las condiciones de fotoperiodo descritas previamente, durante 14 días o hasta la muerte de la planta.

Silenciamiento promovido por el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 durante la interacción de Fusarium sp.-N. benthamiana. Para analizar el efecto de los tratamientos con el vector VIGS durante el proceso de infección, se observaron los síntomas de caída de hojas y el necrosamiento del tallo en plantas de N. benthamiana. Para ello se evaluaron dos grupos, en cada grupo se emplearon seis plantas de tres semanas de edad por tratamiento y por día de colecta: el primer grupo de plantas de N. benthamiana fueron inoculadas con el hongo cinco días antes de ser bombardeadas con microproyectiles de oro recubiertos con el ADN del vector VIGS (procedimiento descrito posteriormente) y se tomaron muestras de tallo a los 7 y 14 días posteriores al bombardeo (dpB) correspondiente a 12 y 19 días posterior a la inoculación (dpI) con Fusarium sp. Estas plantas se nombraron como E-CHS4 (7 dpB/12 dpI y 14 dpB/19 dpI, respectivamente). El segundo grupo de plantas de N. benthamiana, fueron bombardeadas primero con el vector VIGS y cinco días después del bombardeo fueron inoculadas con el hongo, con las condiciones descritas anteriormente. Se colectaron muestras de tallo a los 7 y 14 dpI. Estas plantas se nombraron como O-CHS4 (7 dpI/ 12 dpB y 14 dpI/ 19 dpB). Todos los experimentos se realizaron con 3 réplicas con 6 plantas por réplica, teniendo un total de 18 plantas por tratamiento/día de colecta en el curso temporal.

Para ambos grupos de plantas evaluadas, se bombardearon con microproyectiles de oro de 1 µm (BioRad, Hercules, California, USA) cubiertos con 10 µg de ADN de cada componente viral; para el componente A se emplearon 5 µg del vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 y 5 µg del componente B de EuMV-YP del virus silvestre. El bombardeo se realizó a 2 cm de distancia de la planta y con 30 PSI de gas helio. Los controles empleados fueron plantas SI y plantas únicamente inoculadas con Fusarium sp (I). Se contabilizó el número de hojas pérdidas y la longitud del daño causado por el hongo durante la primera semana.

Análisis por PCR cuantitativo (qPCR) de la expresión relativa del gen CHS4 durante la interacción Fusarium sp. -N. benthamiana. Para evaluar la expresión relativa del gen CHS4, se realizó previamente la extracción del ARN de los tallos colectados, utilizando TRIzol™ Reagent (Invitrogen, Carlsband, CA, USA), siguiendo las indicaciones del proveedor. Posteriormente, para la síntesis de ADNc se emplearon 100-500 ng de ARN total y la SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsband, CA, USA). Brevemente, se emplearon 200 ng de oligo dT (Invitrogen, Carlsband, CA, USA), se incubó por 5 min a 65 °C y luego en hielo por 1 min, se agregaron 4 µL de first-strand buffer, 1 µL de 0.1M DTT, 1 µL de RNAseOUT™, se incubó a 25 °C por 5 min, posteriormente a 50 °C por 60 min, finalmente se inactivó la reacción incubando a 70 °C por 15 min (modificado de ^{Gerard et al., 1997}). Luego se emplearon de 10-20 ng de ADNc para las reacciones de qPCR. Las reacciones se realizaron en el equipo de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Life Technologies, NY, USA) de 48 pozos y usando SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Carlsband, CA, USA). Las condiciones de qPCR fueron las siguientes: un ciclo de 50 °C por 2 min y 95 °C por 5 min, 40 ciclos de 95 °C por 30s, 58 °C por 1min y 72 °C por 30 s. Los oligos utilizados fueron CHS4F, 5’-CAAATTATCCTCATGTCGTTC-3’ y CHS4R 5’-TCAGGATCTTTCACCATGGC-3’ mencionados anteriormente. Los resultados fueron normalizados con el gen de actina de Fusarium solani (XM_046282608.1). Los tratamientos empleados para evaluar la expresión fueron los siguientes: (1) Plantas sin inocular (2) Plantas inoculadas con el hongo, (3) Plantas inoculadas con el vector, (4) Plantas E-CHS4 7dpB/12dpI, (5) Plantas E-CHS14 dpB/19dpI, (6) Plantas O-CHS4 7dpI/12dpB y (7) Plantas 14dpI/19dpB. Las amplificaciones se realizaron por cuadruplicado y los niveles de expresión relativa se calcularon usando el método 2^-ΔΔCT (^{Livak y Schmittgen, 2001}).

Análisis estadístico. Los datos obtenidos de la pérdida de hojas y el tamaño de la lesión fueron analizados mediante la prueba de ANOVA y Tukey post hoc test con un nivel de significancia de p=0.05 usando el software ^{RStudio Team (2022)}. Antes de la prueba de ANOVA, se usaron la prueba de Shapiro-Wilk para probar la normalidad de los datos y la prueba de Levene para la homogeneidad de las varianzas.

Resultados

Análisis del fragmento de CHS4 clonado. Los resultados obtenidos mostraron que el fragmento del gen clonado presentó un 95% de identidad con el gen de la quitina sintasa 4 de Fusarium vanettenii (XM_003053353.1), 95% de identidad con el gen CHS4 de F. facilforme (CP104050.1) y 94% de identidad con el gen CHS4 de una cepa de F. solani (CP090036.1). Al traducir a proteína el fragmento obtenido de 204 nucleótidos, se observó una secuencia de aminoácidos de 68 residuos (Figura 1), en el que se identificó el dominio DADT, que es uno de los dominios que caracteriza a la familia 4 de las quitinas sintasas, la más distribuida en hongos filamentosos (^{Pacheco-Arjona y Ramirez-Prado, 2014}).

Figura 1 Secuencia de aminoácidos y nucleótidos del fragmento parcial de CHS4 de Fusarium sp. En el recuadro se muestra el dominio DADT, que caracteriza a la familia 4 de las quitinas sintasas de hongo. 

Evaluación de la sintomatología de la inoculación de Fusarium en N. benthamiana . Se compararon los síntomas observados en los dos grupos de plantas. Los resultados mostraron que en el tratamiento E-CHS4 la pérdida promedio de hojas fue de 4 por planta durante la primera semana de la infección con Fusarium sp., mientras que para el tratamiento O-CHS4, la pérdida promedio de hojas fue de 3 por planta. En las plantas sanas SI, el promedio de hojas pérdidas fue de 2, esta caída natural fue consecuencia del daño mecánico realizado a la planta. Las plantas control de la infección con el hongo (I) el promedio de pérdida de hojas fue de 6. En el análisis estadístico se observó diferencia significativa en la caída de hojas entre los tratamientos E-CHS4, O-CHS4 y SI con el tratamiento I, pero no se observó diferencia significativa entre los tratamientos E-CHS4 y O-CHS4, así como tampoco se obtuvo diferencia significativa entre el tratamiento O-CHS4 con el control SI, pero si se observó diferencia significativa entre el tratamiento E-CHS4 con el control SI (Figura 2A). Otra variable analizada para establecer la eficiencia de los tratamientos con VIGS fue el tamaño de la lesión causada por el hongo en el tallo de las plantas. El tamaño promedio de las lesiones en los tallos de N. benthamiana con los tratamientos E-CHS4 y O-CHS4 fue de 2 cm, mientras que las plantas con el tratamiento I tuvieron lesiones con un promedio de 3 cm y en las plantas control SI presentaron un tamaño de lesión promedio de 1 cm, este debido al daño mecánico realizado con el bisturí. El análisis estadístico mostró que el promedio del tamaño de la lesión no tuvo diferencia significativa entre los tratamientos E-CHS4 y O-CHS4, pero ambos tratamientos mostraron una diferencia significativa con las plantas I, aquellas únicamente infectadas con Fusarium sp. (Figura 2B). Estos resultados sugieren que los tratamientos con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 pueden atenuar los síntomas causados por Fusarium sp. en N. benthamia. Durante el curso del experimento se analizaron otros síntomas causados por el hongo como pérdida de turgencia, aumento del marchitamiento y la reducción del crecimiento de las plantas. En la Figura 3A línea 1, se observó que después de los 7dpB/12dpI, las plantas I presentaron síntomas como la pérdida de turgencia de las hojas superiores y el arrugamiento y marchitamiento de las mismas, mientras que las plantas con el tratamiento E-CHS4 mostraron características fisiológicas similares a las plantas control SI (Figura 3A, línea 1); sin embargo, se presentó arrugamiento en las hojas superiores y se observó una disminución del crecimiento en comparación con las plantas con el tratamiento control SI. También se observó el necrosamiento en el tallo (Figura 3A línea 2). El efecto en la atenuación de los síntomas no fue permanente, ya que a los 14 dpB/19 dpI (Figura 3B), las plantas con el tratamiento E-CHS4 mostraron síntomas de marchitamiento y arrugamiento de las hojas superiores, pérdida de turgencia de las hojas y necrosamiento del tallo (Figura 3B línea 1), específicamente el necrosamiento del tallo presentó características similares al observado en las plantas I (Figura 3B línea 2).

Figura 2 Número de hojas perdidas y tamaño promedio de lesión en cm, durante tratamiento E-CHS4 y O-CHS4 con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4. A. Número promedio de hojas perdidas en plantas de N. benthamiana con el tratamiento E-CHS4 y O-CHS4, plantas control sana (SI) y plantas inoculadas con Fusarium sp. (I). B. Tamaño promedio de lesión en cm en plantas con el tratamiento E-CHS4, O-CHS4, SI e I. Las letras arriba de la barra indican las diferencias significativas, con una prueba de análisis de Tukey’s con una p < 0.05. vector treatment 14 days post inoculation with Fusarium sp. I: inoculated control plants. 

Figura 3 Análisis de síntomas en plantas de N. benthamiana inoculadas con Fusarium sp. y posteriormente inoculadas con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 (tratamiento E-CHS4). A. Plantas de N. benthamiana a los 7dpB/12dpI y B. Plantas de N. benthamiana a los 14dpB/19 dpI; SI: plantas control sana, I: plantas inoculadas con Fusarium sp. y E-CHS4: plantas inoculadas con Fusarium sp. e inoculadas con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4. 1: Vista superior y 2: Vista lateral de las plantas. 

En el tratamiento O-CHS4, se observó que las plantas a los 7 dpI/12 dpB mostraron menor nivel de síntomas en comparación con las plantas I y mostraron características similares a las plantas control SI (Figura 4A línea 1), solo se observó el daño en la base del tallo (Figura 4A línea 2). La disminución de los síntomas en este tratamiento no fue un efecto permanente, ya que a los 14dpI/19dpB (Figura 4B línea 1), los síntomas de marchitamiento y pérdida de turgencia de las hojas aumentó y fue similar a lo observado en las plantas control de infección con el hongo I. El daño de la base del tallo de las plantas con el tratamiento O-CHS4 fue similar a lo observado en las plantas I (Figura 4B línea 2). Estos resultados mostraron que el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 es capaz de retrasar los síntomas en la interacción Fusarium sp.-N. benthamiana, durante el establecimiento de la infección, pero este efecto es transitorio.

Figura 4 Análisis de síntomas en plantas de N. benthamiana inoculadas con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 y posteriormente inoculadas con Fusarium sp. (tratamiento O-CHS4). A. Plantas a los 7dpI/12dpB. B. Plantas con 14 dpI y 19 dpB; SI: plantas control sana, I: plantas inoculadas con Fusarium sp y E-chs4: plantas inoculadas con Fusarium sp. e inoculadas con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4. 1: Vista superior y 2: Vista lateral de las plantas. 

Expresión relativa del gen CHS4 de Fusarium sp. durante su interacción con plantas de N. benthamiana. En las plantas con el tratamiento E-CHS4 se observó que después de los 7 dpB la expresión del gen CHS4 se incrementó cuatro veces más comparado con el control I, en cambio a los 14 dpB con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4, la expresión del gen CHS4 disminuyó su expresión relativa un 20% con respecto al control infectado (Figura 5). En el caso de las plantas con el tratamiento O-CHS4 se observó una disminución en la expresión relativa de CHS4 después de los 7 dpI, del 30% con respecto a las plantas control infectadas, sin embargo, a los 14 dpI la expresión relativa del gen CHS4 aumentó 2.5 veces con respecto al control infectado (Figura 6). Estos resultados indican que el efecto observado en la sintomatología de las plantas E-CHS4 y O-CHS4 puede estar relacionado con el silenciamiento transitorio del gen CHS4, producto de la presencia del vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 y su replicación en las plantas de N. benthamiana.

Figura 5 Cuantificación relativa mediante análisis qPCR del fragmento del gen CHS4 de Fusarium sp. en tallos de plantas con el tratamiento E-CHS4. Se empleó el gen de la actina de Fusarium para normalizar los datos. E-CHS4 7dpB: Expresión relativa de CHS4 en plantas inoculadas con Fusarium sp. a los siete días con el tratamiento E-CHS4; E-CHS4 14dpB: expresión relativa de CHS4 en plantas de N. benthamiana con Fusarium sp. a los 14 días con el tratamiento E-CHS4. I: Plantas control inoculadas. 

Figura 6 Cuantificación relativa mediante análisis qPCR del fragmento del gen CHS4 de Fusarium sp. en tallos de plantas con el tratamiento O-CHS4. Se empleó el gen de la actina de Fusarium para normalizar los datos. O-CHS4 7dpI: Expresión relativa de CHS4 en plantas de N. benthamiana con tratamiento con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 siete días posterior a la inoculación con Fusarium sp.; O-CHS4 14 dpI: expresión relativa de CHS4 en plantas de N. benthamiana con tratamiento con el vector EuMV-YP∆CHS4 14 días posteriores a la inoculación con Fusarium sp. I: plantas control inoculadas. 

Discusión

En la interacción planta-patógeno el intercambio bidireccional permite el establecimiento de una infección por parte del patógeno, así como la activación de la defensa del hospedero (^{Cai et al., 2019}). En este estudio, se evaluó el efecto de la aplicación de un vector VIGS basado en el Euphorbia mosaic virus-Yucatán península (EuMV-YP), para inducir el silenciamiento del gen CHS4 de Fusarium sp. durante la interacción con N. benthamiana. Los resultados obtenidos demostraron la disminución de síntomas en las plantas infectadas con Fusarium sp. y bombardeadas con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4, sin la producción de plantas transgénicas estables o del uso de mutantes del hongo, que son los métodos empleados para el análisis de genes fúngicos.

Los sistemas VIGS son una herramienta desarrollada originalmente para el análisis génico en plantas, pero el desarrollo de nuevos protocolos y vectores virales han demostrado su utilidad para el análisis en hongos, como una estrategia directa y fácil de realizar, reduciendo costos y tiempo de trabajo (^{Tinoco et al., 2010}; ^{Mascia et al., 2014}). La aplicación del vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 disminuyó los síntomas característicos provocados por la infección con Fusarium sp. en plantas de N. benthamiana, como la caída de hojas y el tamaño de la lesión (Figura 2). Resultados similares se reportaron en trabajos en los que se aplica la tecnología HIGS (host inducing gene silencing), por ejemplo, en plantas de A. thaliana que expresaban un ARNds contra el gen de la citocromo P450 lanosterol C-14α-demetilasa (CYP5) de F. graminearum, las plantas infectadas con el hongo no presentaron síntomas de infección en comparación con el control infectado sin transformar con el ARNds a los tres días después de la inoculación, además, mostraron un porcentaje de área foliar infectada de 0.9%, en contraste con el 77% que presentó el control infectado (^{Koch et al., 2013}). Por otro lado, en plantas de trigo que expresaban ARNds con estructura de horquilla para el gen de la quitina sintasa 3 (Chs3b) de F. graminearum, presentaron síntomas débiles de infección y una reducción en la longitud de la lesión de 8.5 mm a 6.7, 6.6, 5.7 y hasta 4.5 mm en todas las construcciones evaluadas para este gen (Cheng et al., 2015). En el caso de tecnologías de silenciamiento como SIGS (Spray-induced gene silencing), ^{Höfle et al. (2020}), mostraron que la aplicación de ARNds del gen CYP5 de diferentes longitudes en hojas de A. thaliana reducía los síntomas de infección por F. graminearum en hasta un 82% en comparación del control. Este resultado es comparable con lo observado en este trabajo empleando VIGS, donde se reportó una reducción del tamaño de la lesión de 3 cm presente en las plantas inoculadas unicamente con Fusarium sp. a 2 cm en las plantas que contenían el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4. Con base en estos datos se sugiere que los mecanismos de silenciamiento presentarán diferentes respuestas y fenotipos, aún cuando se aplique a genes con actividades relacionadas o a la misma especie de hongo.

Si bien la técnica de HIGS se ha presentado como una estrategia para el estudio de la interacción hongo-planta, esta herramienta se realiza mediante la generación de plantas transgénicas capaces de producir ARNi (^{Nowara et al., 2010}; ^{Panwar et al., 2013}; Cheng et al., 2015), lo que provoca que tenga poca aceptación para su uso por los consumidores y poca confiabilidad debido al desconocimiento de sus repercusiones ambientales (^{Cai et al., 2019}; ^{Wang et al., 2016}), por lo que el empleo de los vectores VIGS es un mecanismo alternativo al sistema HIGS, como parte de la nueva generación de fungicidas basados en ARNs (^{Padilla-Roji et al., 2023}).

Se ha reportado previamente la aplicación de VIGS para silenciar la expresión de genes de hongos, utilizando al Barley stripe mosaic virus (BSMV) como vehículo VIGS, para expresar ARNds dirigidos a genes asociados al haustorio de Puccinia triticina f. sp. tritici (Pst) (^{Yin et al., 2011}). Estos resultados mostraron que el silenciamiento fue más eficiente en las células del haustorio que estaban en mayor contacto con las células del hospedero (Yin et al., 2011). Por otra parte, en plantas de trigo utilizando al BSMV como VIGS, se evaluaron ARNi contra tres genes de Puccinia triticina (Pt), el gen PtCYC1 (cyclophilin), PtMAPK1 (una proteína quinasa) y PtCNB (una unidad regulatoria de calcineurina), los cuales participan en la patogenicidad. En este estudio se observó que el silenciamiento de cualquiera de los tres genes blanco produjo una disminución en el tamaño de la lesión ocasionada durante el proceso infectivo (^{Panwar et al., 2013}). Así mismo, el análisis del silenciamiento del efector PstCFEM de Pst, empleando BSMV en plantas de trigo, mostraron la reducción en la esporulación, lo que disminuyó significativamente la biomasa del hongo y el área de infección (^{Bai et al., 2022}). En este trabajo, empleando al EuMV-YP como vector VIGS, se observó la disminución del daño foliar (caída de las hojas y arrugamiento), así como la disminución del tamaño de la lesión por la infección con Fusarium sp., como efecto de la presencia del vector VIGS EuMV-YP∆CHS4. Lo anterior nos sugiere que la aplicación de vectores VIGS son alternativas no transgénicas, novedosas y amigables para el medio ambiente, así como para el estudio y análisis de nuevas herramientas contra el combate de patógenos y de plagas de insectos de plantas (^{Coleman, 2016}; ^{Dinolfo et al., 2017}; ^{Martín-Udíroz et al., 2004}), así mismo, muestra las posibilidades de aplicación de vectores VIGS basados en el EuMV-YP.

Además de las diferencias observadas en la sintomatología de las plantas infectadas con Fusarium sp. y tratadas con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 en comparación con las plantas que solo fueron infectadas con Fusarium sp., también se observó el silenciamiento de hasta el 20% en la expresión del gen CHS4 en las plantas con el tratamiento E-CHS4 (Figura 5) y de 30% de silenciamiento en las plantas con el tratamiento O-CHS4 (Figura 6). Con todo, el silenciamiento de solo el gen de quitina sintasa 4 no fue suficiente para evitar el desarrollo de la infección del hongo y por lo tanto no permitió la supervivencia o recuperación de las plantas.

Este efecto de pérdida de silenciamiento puede estar relacionado con la multiplicidad de las quitinas sintasas, ya que se ha reportado que la perturbación en la síntesis de la pared puede desencadenar una respuesta compensatoria para garantizar la integridad de la pared celular de hongos, principalmente un aumento en la síntesis de quitina a través de otros miembros de las quitina sintasa (^{Kappel et al., 2020}); pero también están involucrados procesos como la sobre-expresión de enzimas como las desacetilasas, que permiten la conversión de quitina a quitosano (Kappel et al., 2020). Además, se ha observado que la expresión de uno o más genes de quitina sintasa está relacionada con la etapa de desarrollo del hongo (^{Roncero et al., 2003}; Kappel et al., 2020). Por ejemplo: mutantes de F. oxysporum en un solo gen quitina sintasa (1, 2 o 7) no mostraron diferencias en la morfología de las colonias o la producción de quitina comparadas con la cepa silvestre (^{Martín-Udíroz et al., 2004}). Mientras que la eliminación del gen CHS5 en cepas de F. oxysporum mostraron hifas hinchadas e hipersensibles al H₂O₂ (Roncero et al., 2003), demostrando que la pérdida de actividad de un solo gen de quitina sintasa puede generar cambios estructurales importantes, mientras que en otras interacciones está perdida puede no influenciar en la virulencia o desarrollo del hongo: por ejemplo, en plantas de jitomate infectadas con una cepa de F. oxysporum con una mutante letal del gen CHS5, mostró una disminución en su capacidad para colonizar eficientemente el sistema vascular del jitomate, además de presentar menor tasa de crecimiento (^{Madrid et al., 2003}), mientras que el análisis de cepas mutantes letales de los genes CHS1 y CHS2 de F. oxysporum no generaron efectos en el contenido de quitina ni en la esporulación, además de que fue imposible obtener una mutante viable del gen CHS3 (Martín-Udíroz et al., 2004). Por otro lado, Cheng et al. (2015), expresaron construcciones del CHS3 que silenciaron la expresión del gen en F. graminearum durante su interacción en plantas de trigo, lo que resultó en un 61% menos de espigas infectadas.

Por otro lado, la interrupción del gen CHS4 no provocó cambios en el fenotipo de B. cinerea, pero en especies como Aspergillus sp. y Neurospora crassa, donde se ha reportado como una enzima con actividad redundante, su eliminación no produjo cambios morfológicos aparentes en la pared del hongo, pero generó una disminución en la concentración de quitina de la pared (^{Din et al., 1996}). En Saccharomyces cerevisiae, por el contrario, el producto del gen CHS4, es el responsable de la producción del 90% de la quitina de la pared celular y además está relacionado con el cambio en el ciclo sexual (^{Morcx et al., 2013}). Así mismo, el silenciamineto del gen CHS4 de Penicillium chrysogenum, disminuyó 91% de la expresión del gen lo que resultó en la reducción del tamaño de la colonia y del número de conidios (^{Liu et al., 2013}). Por lo contrario, en especies de hongos como F. oxysporum, el aislamiento de CHS4 no fue posible y solo mediante análisis in silico con datos de F. graminearum, se determinó la existencia de uno o más genes CHS4 en F. oxysporum, así como su relación con CHS7 (^{Martín-Udíroz et al., 2004}). Por ello, el análisis de genes múltiples o genes difíciles de aislar mediante la tecnología VIGS evita la necesidad de eliminarlos completamente, lo que permite estudiar genes esenciales, cuya mutación es letal (^{Mascia et al., 2014}). En este trabajo, mediante VIGS se observó el silenciamiento transitorio de CHS4 de Fusarium sp., lo que permite analizar su posible participación en el proceso de infección en N. benthamiana y sugiere la posible aplicación de vectores VIGS basados en EuMV-YP, para el análisis de otros genes pertenecientes a esta familia.

Con respecto a los resultados obtenidos en ambos tratamientos, E-CHS4 y O-CHS4, se observó una disminución de los síntomas en las plantas infectadas con el hongo, independientemente del momento de inoculación con el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4. Previamente, ^{Villanueva-Alonzo et al. (2013}) y ^{Luna-Rivero et al. (2016}) demostraron que el vector pEuMV-YP:∆AV1 se mueve de manera sistémica y uniforme durante la infección, permitiendo la replicación del fragmento del gen a evaluar, por lo que el silenciamiento observado del gen CHS4 de Fusarium sp. puede deberse al movimiento de los ARNi del sitio de infección en N. benthamiana hacia toda la planta y a las células del hongo. Esta es una ventaja del silenciamiento mediado por VIGS sobre otros enfoques de ARNi en las plantas, donde los ARNi pueden moverse de manera sistémica desde el sitio de inoculación hacia todo el organismo (^{Mascia et al., 2014}).

Diversos estudios han demostrado que el intercambio de ARNs y ARNi entre diferentes reinos durante la interacción planta-patógeno, es un proceso bidireccional que permite a los patógenos suprimir la defensa de las plantas, pero que también proporciona a las plantas resistencia a las enfermedades hasta en un 60% (^{Mapuranga et al., 2023}). Al ser un proceso bidireccional entre patógeno y hospedero, es posible encontrar evidencia de estos intercambios, por ejemplo: ^{Zhang et al. (2016}), reportaron que al aislar el hongo Verticillium dhaliae de plantas de algodón, obtuvieron secuencias de microARN que eran compatibles principalmente con secuencias de microARN de algodón más que con el hongo, lo que sugiere que estos ARNs se transportaron del algodón al hongo durante el proceso de infección. En otro reporte se demostró la capacidad de las células fúngicas de B. cinerea para absorber exomas de plantas, a través de la exposición in vitro del hongo con exomas de A. thaliana marcados con TET8-GFP (un marcador específico de exomas, similar al observado en mamíferos). Se concluyó que después de dos horas los exomas se encontraban dentro de las células fúngicas y se mantuvieron hasta que éstas fueron lisadas con Tritón X-100 (^{Cai et al., 2018}). Por otro lado, se ha reportado que la aspersión de ARNds sobre hojas de cebada inhibió cerca del 50% de la infección con F. graminearum mediante construcciones cuyo blanco fueron los genes AGO y DCL (genes que además de participar en el silenciamiento, en F. graminearum contribuyen en la producción de micotoxinas y en el desarrollo de la enfermedad en la planta); esto demuestra la capacidad de los patógenos fúngicos para absorber los ARN del ambiente (^{Werner et al., 2020}).

Los resultados obtenidos mostraron que la tecnología VIGS permite el análisis de un gen durante la interacción planta-hongo, sin la necesidad de desarrollar protocolos para la transformación de hongos o la generación de plantas transgénicas, como sucede con metodologías como HIGS (^{Hua et al., 2018}), así como evitar la dependencia a la obtención de cultivares resistentes o el riesgo de la inestabilidad que pueden presentan los ARNds en la metodología SIGS (Hua et al., 2018).

Conclusiones

El vector VIGS EuMV-YP∆CHS4, basado en el EuMV-YP, tuvo la capacidad de silenciar parcialmente al gen CHS4, durante el proceso infectivo de Fusarium sp. en plantas de N. benthamiana. El principal efecto del silenciamiento provocado por el vector VIGS EuMV-YP∆CHS4 fue la reducción de síntomas como menor caída de hojas, disminución del tamaño de la lesión en tallo, así como menor pérdida de turgencia en las plantas. La evaluación de este vector VIGS durante la interacción planta- patógeno, demuestra su potencial para estudiar la importancia de los genes en la viabilidad o patogenicidad de los hongos.