Materiales y métodos

Recolección de muestras. Durante octubre de 2016 a marzo de 2017, se recolectaron hojas de jitomate y chile con síntomas típicos de mancha bacteriana en 47 campos comerciales distribuidos los municipios de Ahome (8), Guasave (7), Navolato (7), Culiacán (9), Elota (5) y Escuinapa (11), en Sinaloa, México. Los cultivos se encontraban en diversas etapas de desarrollo; desde la etapa inicial hasta la etapa de producción.

Aislamiento de bacterias. Las hojas colectadas se desinfestaron superficialmente en alcohol al 70% por 30 segundos, se cortaron en pequeños trozos a partir de los márgenes de la lesión y se trituraron en agua destilada estéril. La suspensión se sembró por estrías sobre placas Petri con medio de cultivo Agar nutritivo (AN) y medio de levadura-dextrosa-carbonato de calcio (YDC) Las placas se incubaron a 28 °C durante 48 h en oscuridad continua, y posteriormente se seleccionaron y purificaron las colonias redondas, convexas, amarillas y de consistencia mucosa. Los cultivos puros se conservaron en tubos con agua a 4 °C para su almacenamiento a corto plazo y en glicerina al 20% a temperatura de -20 °C para su almacenamiento a largo plazo (^{Schaad et al., 2001}).

Reacción de hipersensibilidad. Con el fin de corroborar que las cepas aisladas fueran patógenas, se realizó la prueba de hipersensibilidad, utilizando plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) de dos meses de edad. Se preparó una solución bacteriana con una concentración de 3 ´ 10⁸ UFC mL^-1 según la escala de McFarland´s (Kyraly et al., 1974) y con una jeringa hipodérmica se infiltró la solución en el envés de la hoja, identificando cada área infiltrada con el dato o registro de la cepa. Las plantas se colocaron en condiciones de invernadero y se monitorearon durante las primeras 48 h (^{Király et al., 1974}). Aquellas cepas que indujeron una reacción de hipersensibilidad positiva fueron las que se seleccionaron para continuar con su estudio.

Pruebas bioquímicas y fisiológicas. De un total de 93 cepas aisladas, solo 47 (39 de jitomate y 8 de chile) presentaron las características fenotípicas reportadas para Xanthomonas spp., y con estas se realizaron las pruebas bioquímicas y fisiológicas (tinción de Gram, metabolismo oxidativo/fermentativo de los carbohidratos, oxidasa y almidón) descritas por ^{Schaad et al. (2001}). Todas las pruebas se realizaron en tres ocasiones.

Extracción de ADN y amplificación por PCR. La lisis celular de la bacteria se realizó por medio de choque térmico a partir de colonias jóvenes cultivadas por dos días en medio YDC. Para ello, se colocó una colonia pura en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL, conteniendo 100 µL de agua inyectable y se homogenizó la solución. Posteriormente, se colocó durante 15 min a 95 °C en un termoblock (Labnet) y después se transfirió inmediatamente a un recipiente con hielo durante 7 min. Una vez transcurrido el tiempo, se centrifugó a 10 000 x g por 15 min, se decantó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 50 µL de agua inyectable.

La amplificación por PCR se llevó a cabo con cinco pares de iniciadores (Sigma) que flanquean al gen HrpB2, especificados en el Cuadro 1 (^{Obradovic et al., 2004}), y una mezcla de reacción indicada en el Cuadro 2. Los reactivos pertenecen al kit GoTaq^® PCR Core System I. Las condiciones de amplificación fueron: una desnaturalización inicial a 95 ºC por 5 min, 35 ciclos de 94 ºC por 1 min, 56 ºC por 1 min, 75 ºC por 1 min; y una extensión final a 75 ºC por 10 min. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador Proflex PCR system (Applied Biosystem).

Los amplicones se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa a 1% usando una cámara de electroforesis (BioRad)y se sometieron a 60 V durante 50 min. Posteriormente, los geles se visualizaron en un transluminador (Benchtop) con luz UV.

Razas fisiológicas de Xanthomonas en chile. Las razas fisiológicas de Xanthomonas spp. se determinaron utilizando el material de chile cv. Early California Wonder (susceptible) y un conjunto de líneas isogénicas derivadas de Early California wonder (ECW), incluyendo a ECW-10R, ECW-20R, ECW-30R, PT235047 y ECWPLUS. Las líneas ECW-10R, ECW-20R, ECW-30R contienen los genes de resistencia 10R, 20R y 30R de Capsicum pubescens, respectivamente; mientras que la línea ECWPLUS tiene los genes 10R, 20R, 30R, 50R y 60R (Cuadro 3).

Las plantas se cultivaron en invernadero bajo condiciones de humedad relativa (60-70%) y temperatura (25 °C) controladas durante 60 días. Posteriormente, se llevó a cabo la infiltración, la cual se realizó con una solución bacteriana de 3 ´ 10⁸ UFC mL^-1 usando una jeringa de 5 mL sin aguja, teniendo cuidado que la infiltración abarcara gran parte del área de la hoja. Un grupo de plantas diferenciales inoculadas con agua destilada, sirvieron como control. Las plantas se evaluaron a las 48 h y a la semana después de inoculación para determinar las reacciones de hipersensibilidad (RH) y de susceptibilidad (S). En la prueba se consideró RH cuando se observaron manchas color café oscuro. En el caso exclusivo de la línea ECWPLUS, una RH se consideró como una mancha amarillenta seca; mientras que, se consideró una reacción S cuando en la hoja se observó flacidez y acuosidad. Los resultados se cotejaron con la información del Cuadro 3 (^{Stall et al., 2009}).

Razas fisiológicas de Xanthomonas en jitomate. Para la identificación de razas fisiológicas de las cepas de Xanthomonas spp. en jitomate, se utilizaron las líneas diferenciales Hawaii7998, Hawaii7891, PI114490 y LA716 (Cuadro 4). Utilizando la misma metodología mencionada anteriormente para chile. Las plantas se evaluaron a las 48 h y a la semana después de inoculación se registraron las reacciones de hipersensibilidad (RH) y de susceptibilidad (S). La prueba se consideró como RH al observar manchas color café oscuro y secas, mientras que se consideró una reacción S cuando en la hoja se observó flacidez y acuosidad. Los resultados se cotejaron con la información del Cuadro 4 (^{Stall et al., 2009}).

Resultados y discusión

Los síntomas de mancha bacteriana se observaron en las hojas de chile y jitomate al momento de recolección del material vegetal en todos los sitios que se visitaron. La incidencia de la enfermedad fue de 5-10% y de 15-25% en campos comerciales con chile y jitomate, respectivamente.

Las pruebas realizadas mostraron que, de las 93 cepas aisladas, solo 47, presentaron las características morfológicas de colonias redondas, convexas, amarillas y mucoides en medio YDC; además, de que fueron Gram y oxidasa negativas. Estas características morfológicas y bioquímicas coincidieron con las reportadas por ^{Schaad et al. (2001}) para el caso de Xanthomonas spp. Cabe resaltar que, 32 de las 47 cepas, registraron amilasa negativa.

Igualmente, de las 93 cepas aisladas, solo 47 indujeron RH en plantas de tabaco a las 24 h después de la inoculación y con base en las pruebas bioquímicas, fisiológicas y de patogenicidad, se confirmó que las 47 cepas bacterianas pertenecieron al género Xanthomonas.

Fue posible realizar la identificación de tres especies de Xanthomonas spp. relacionadas con chile y jitomate utilizando los iniciadores específicos para cada especie (Cuadro 5). Todos los productos de PCR punto final se visualizaron en un gel de agarosa como el ejemplo que se muestra en la Figura 1.

El análisis molecular donde se utilizaron iniciadores específicos confirmó que, el 83% de las 47 cepas de Xanthomonas obtenidas de campos de jitomate y chile en Sinaloa (Cuadro 5), correspondió a X. euvesicatoria, el 10.6% a X. perforans y el 6.3% a X. vesicatoria. De manera similar, ^{Lue et al. (2010}) reportaron a estas tres especies de Xanthomonas asociadas a jitomate y chile en Taiwán, y tampoco detectaron a X. gardneri.

Figura 1 Gel de agarosa para detección de especies de Xanthomonas spp. En el primer carril (M) marcador de 100 pb, segundo, iniciadores para X. euvesicatoria (E), tercero, X. vesicatoria (V), cuarto carril con banda específica para X. perforans (P), el quinto X. gardneri (G) y en sexto carril con iniciadores universales para Xanthomonas spp. (X). 

En estudios previos en México, se reportó a X. vesicatoria como la especie predominante en campos con jitomate y chile en los estados de Sinaloa (^{Bouzar et al., 1996}; ^{Carrillo-Fasio et al., 2001}) y Sonora (Bouzar et al., 1996). Esto contrastó con nuestro estudio en el cual, X. euvesicatoria fue la especie más frecuente en campos de Sinaloa; mientras que, X. perforans y X. vesicatoria fueron las especies menos frecuentes (Cuadro 5). Esta variación puede explicarse por el continuo movimiento de semilla contaminada entre países (^{Abbasi et al., 2015}; ^{Jibrin et al., 2022}).

Para el caso de las ocho cepas obtenidas de plantas de chile en campos de Sinaloa, el 62.5% correspondió a X. euvesicatoria. Esto coincidió con estudios realizados en Australia (^{Roach et al., 2018}), Tailandia (^{Sitthitanasin et al., 2020}) y Bulgaria (^{Bogatzevska et al., 2021}), donde X. euvesicatoria fue la especie predominante en el cultivo de chile.

En este estudio, X. euvesicatoria fue la especie más frecuente (87.1%) en las 39 cepas analizadas de campos de jitomate en Sinaloa. Similarmente, esta especie se ha reportado en campos con jitomate en Taiwán (^{Lue et al., 2010}), Canadá (^{Abbasi et al., 2015}), Nigeria (^{Jibrin et al., 2018}), Bulgaria (^{Bogatzevska et al., 2021}) y medio oeste de los EE. UU. (^{Rotondo et al., 2022}).

Xanthomonas perforans fue la segunda especie más común en nuestro estudio con un 10.6% de frecuencia en campos con jitomate y chile en Sinaloa. Esta especie se detectó previamente en campos con jitomate en Taiwán (^{Lue et al., 2010}), Canadá (^{Abbasi et al., 2015}), Australia (^{Roach et al., 2018}), Tailandia (^{Sitthitanasin et al., 2020}) y medio oeste de los EE. UU. (^{Rotondo et al., 2022}),

Xanthomonas vesicatoria fue la especie menos frecuente (6.4%) de las cepas aisladas de campos con jitomate y chile en Sinaloa, coincidiendo ampliamente con el estudio de ^{Lue et al. (2010}), quienes encontraron a esta especie en menor frecuencia y menos distribuida en campos de jitomate en Taiwán en comparación con X. euvesicatoria y X. perforans. Por el contrario, ^{Bogatzevska et al. (2021}) señalaron que X. vesicatoria fue la especie más frecuente y ampliamente distribuida en el mismo cultivo, en Bulgaria.

De las cepas de X. euvesicatoria que se aislaron de campos con chile en Sinaloa, se identificaron las razas P0, P3, P6, P8 y P10. De manera similar, estas razas también se han detectado en campos con chile en Bulgaria (^{Bogatzevska et al., 2021}). Mientras que, de las cepas aisladas de jitomate, se encontraron que seis fueron capaces de atacar a plantas de chile siendo las razas P0 y P8.

Comparando con los resultados previos obtenidos por ^{Carrillo-Fasio et al. (2001}), en el estudio de razas de Xanthomonas spp. en Sinaloa, se observó que después de más de 15 años; las razas P1 y P2 no se encontraron en este estudio debido a probablemente a que no están presentes en las zonas de producción muestreadas o que la fecha de muestreo no coincidió con la presencia del patógeno. Entretanto, las razas P6 y P10 se detectaron por primera vez; mientras que, las razas P0 y P3 continúan en la población de Xanthomonas spp. Las razas que predominaron en Sinaloa fueron P0, P6 y P8, a diferencia del año 2001, en el cual la raza predominante fue la P3.

En el cultivo de jitomate en campos de Sinaloa, se detectaron las razas TI, T2, T3 y T5 de Xanthomonas. Con base en datos de distribución y frecuencia de las cepas, al norte del estado de Sinaloa (Ahome y Guasave) se encuentran las razas T1 y T3; en el centro (Culiacán, Navolato y Elota) las razas T1, T2 y T3; al sur (Escuinapa) las razas T1, T2, T3 y T5, siendo las razas T1 y T3, las predominantes en todo el estado (Figura 2). En el caso de chile, las razas de Xanthomonas spp. se distribuyeron de la siguiente manera: al norte (Ahome y Guasave) se encontraron las razas P0, P6, P8 y P10; en el centro (Culiacán, Navolato y Elota) las razas P0, P3, P6 y P8; al sur (Escuinapa) las razas P0, P6 y P8; siendo las razas P0, P6 y P8 las predominantes en todo el estado (Figura 2).

Figura 2 Distribución de especies y razas de Xanthomonas aisladas de jitomate y chile en campos distribuidos en el estado de Sinaloa, México durante el ciclo 2016-2017. 

Además de la identificación de Xanthomonas spp. mediante iniciadores específicos, existen algunos estudios que han analizado secuencias de ADN y realizado análisis filogenéticos multilocus para la distinción de las diversas especies de Xanthomonas que infectan a jitomate y chile en diversos países (^{Abbasi et al., 2015}; ^{Schwartz et al., 2015}; ^{Timilsina et al., 2015}; ^{Roach et al., 2018}). Por lo que, se sugiere realizar posteriores estudios filogenéticos con secuencias de ADN de Xanthomonas spp. para obtener mayor información sobre su origen y diversidad genética en el estado de Sinaloa y en otros estados productores de jitomate y chile en México.

Conclusiones

La información generada en este estudio confirmó que en campos con jitomate en el estado de Sinaloa se encuentran las especies X. euvesicatoria, X. perforans y X. vesicatoria. Mientras que, en campos con chile se detectó a X. euvesicatoria y X. perforans. Además, se registró la presencia de las razas T1, T2, T3 y T5 para jitomate; así como, las razas P0, P3, P6, P8 y P10 para chile. Este es el primer reporte de la presencia de X. perforans en México. Por lo que se requiere de estudios posteriores para depositar secuencias representativas de cada especie de Xanthomonas en el GenBank, conocer la sensibilidad de estas cepas a bactericidas; además de, generar datos sobre epidemiología y manejo de estas bacterias fitopatógenas en México. Asimismo, es importante resaltar que no se detectó la presencia de X. gardneri.