En la actualidad, la mayoría de las comunidades rurales de Oaxaca, México mantienen elementos de los sistemas agrícolas prehispánicos tales como la organización que promueve el trabajo comunitario y la producción de cultivos locales. Frutales como Inga spuria (cuajinicuil) y Annona muricata (guanábana) son de las principales especies de importancia social y económica que se cultivan en la comunidad de Peña Negra, municipio de Santa Lucía Monteverde, Oaxaca. La comunidad está localizada a una altitud de 1200 msnm, tiene temperaturas promedio de 26 °C y humedad relativa que varía de 50 a 90% a lo largo del año. La producción de guanábana es de 0.25 t anuales y de cuajinicuil 0.5 t por año en Peña Negra. Esta producción se destina para autoconsumo y se comercializa en el mercado local.

En junio de 2019 en estos dos frutales se observaron por primera vez síntomas foliares fúngicos causando fuerte defoliación, momificación y caída del fruto, con una incidencia del 100%, es decir, todos los árboles tenían hojas enfermas. En un recorrido en las siete rancherías de San Sebastián, Nopalera: El paraíso 16° 95´ 27´´ N, 97° 82´ 11´´ O, El guayabo 16° 92´ 33´´ N, 97° 78´ 13´´ O, Buena Vista el Naranjo 16° 92´ 75´´ N, 97° 76´ 69´´ O, Peña Flor de Clavo 16° 90´ 19´´N, 97° 77´ 91´´O, Peña Negra 16° 91´ 52´´N, 97° 79´ 50´´O, Torralba de Juárez 16° 90´ 47´´N, 97° 82´ 19´´O, y Peña de Jícara 16° 93´ 86´´N, 97° 79´ 50´´, se observaron los mismos síntomas en ambos frutales.

También se recorrió parte de Putla (distrito que abarca a 50 comunidades y diversos municipios) y se observaron los mismos síntomas en guanábana y cuajuinicuil en las comunidades visitadas: Yosotiche, Simiyuvi y El Piñal. Cada ranchería tiene su propio microclima y al parecer los patógenos se han adaptado a todos. El 95% de las familias tienen pocos árboles como cultivos de traspatio. El 5% restante tiene entre 50 a 100 árboles de ambos frutales. En los árboles enfermos las pérdidas pueden alcanzar un 50% de acuerdo con información personal de los productores. Con la finalidad de atender este problema fitosanitario, el objetivo de este trabajo fue identificar a través de la amplificación y análisis de la región espaciadora transcrita interna (ITS) los hongos asociados al follaje de cuajinicuil y guanábana.

Las muestras de tejido vegetal enfermo se recolectaron de árboles de cuajinicuil y guanábana en diciembre de 2019, en 10 huertas en la ranchería de Peña Negra, San Sebastián Nopalera, municipio de Santa Lucía Monteverde, Oaxaca, México (16° 54’ 52.73’’ N; 97° 47’ 50.35’’ O; 1096 msnm). La localidad tiene una temperatura promedio de 26 °C y la humedad relativa entre mayo y octubre oscila entre 80 a 90%.

Los árboles se encontraban en etapa fenológica vegetativa. Se seleccionaron huertas de 1 ha por frutal para realizar los muestreos. En cada huerta se estableció un diseño de muestreo aleatorio de 10 árboles con síntomas foliares. De cada árbol se recolectaron al azar a una altura de 1.5 m, cinco hojas con síntomas. Para aislar los microorganismos, después de enjuagar las hojas en el laboratorio, porciones de 0.5 x 0.5 cm tomados del margen de la lesión se sumergieron por 1 min en hipoclorito de sodio al 2%, se enjuagaron tres veces, y se colocaron en cajas de Petri con agar papa dextrosa (PDA; BD Bioxon) y se incubaron a 27 ºC por siete días. A partir del crecimiento fúngico se hicieron resiembras de punta de hifa hasta obtener cultivos puros de cada aislado.

Las pruebas de patogenicidad se realizaron en 10 hojas de guanábana sanas, colocándolas en 10 cámaras húmedas por separado, manteniéndolas a 25 °C. Cada una de ellas se inoculó colocando un disco con micelio de 5 mm de diámetro. El control negativo se inoculó con agua destilada estéril y se monitorearon hasta la aparición de síntomas.

En cuajinicuil, para verificar la patogenicidad del aislado se siguió la metodología anteriormente descrita. Además, se inocularon hojas de 10 plantas de 30 cm de altura. Una hoja por planta, las cuales se mantuvieron a una temperatura de 25 °C y la humedad se mantuvo con algodón húmedo dentro de las cámaras húmedas. Una vez que aparecieron los síntomas, a partir del tejido enfermo se aislaron los patógenos en PDA. Los dos hongos aislados de cada cultivo fueron diferentes morfológicamente, por lo tanto, se realizó la secuenciación del ITS de cada uno.

El ADN genómico se extrajo a partir del crecimiento micelial de los cultivos puros de cada aislado con el kit Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA) siguiendo el protocolo del proveedor. La concentración y pureza del ADN se verificó en un Nanodrop 2000c (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA); la integridad se determinó por electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (Thermo Fisher, Darmstadt, Alemania).

La región ITS se amplificó con los iniciadores universales ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (^{White et al., 1990}) en un termociclador Bio-Rad T100 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) en un volumen total de reacción de 25 μL, conteniendo 50-100 ng de ADN genómico, 0.4 μM de cada iniciador y 1X de Platinum Green Hot Start PCR Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C por 5 min, 30 ciclos a 95 °C por 1 min, alineamiento a 55 °C por 2 min, extensión a 72 °C por 1 min y extensión final a 72 °C por 5 min. El fragmento esperado (550 pares de bases) se corroboró por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se purificó con el kit ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA). Los productos purificados de PCR se secuenciaron por la técnica de Sanger, por la empresa Macrogen, Inc, (Corea del Sur).

Las secuencias de este estudio, se compararon individualmente con secuencias de referencia de la base de datos del GenBank (NCBI) con el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Posteriormente, el programa Clustal X v2.1 se utilizó para realizar el alineamiento múltiple de secuencias. Una vez alineadas, se recortaron de sus extremos 5’ y 3’ con SeaView v4.4.2 y se determinó el mejor modelo de sustitución nucleotídica con el programa SMS (Smart Model Selection) incorporado en PhyML v3.0. Un árbol filogenético se calculó con el método de máxima verosimilitud en PhyML v3.0 con el modelo TN93. La confiabilidad de cada nodo se estimó por medio de análisis de bootstrap después de 1000 réplicas y se incluyó la secuencia de Alternaria alternata KX377683.1 como grupo externo. El árbol generado se visualizó en el programa iTOL (Interactive Tree of Life).

En cuajinicuil, los síntomas de la enfermedad fueron manchas pequeñas redondas a irregulares, de color castaño claro a oscuro con halo clorótico, sobre cualquier parte del foliolo. Las manchas se presentan en agrupaciones que llegan a formar pequeñas áreas de tejido necrosado. Las lesiones abarcan más del 50% del foliolo, finalmente las hojas se tornan amarillas y se defolian (Figura 1). Los síntomas foliares en guanábana tienen una coloración marrón con margen amarillo, irregulares, inician en la punta y avanzan hacia la base del foliolo. El tejido necrosado se vuelve quebradizo, después las hojas se marchitan, se tornan cafés con apariencia de quemadura por fuego. Las ramas se defolian por completo.

Figura 1 Síntomas foliares en árboles frutales de la comunidad de San Sebastián Nopalera, Oaxaca, México. A-B. Síntomas de necrosamiento foliar en árboles de Cuajinicuil; C. Defoliación en cuajinicuil; D-E-F. Síntomas de lesiones con amarillamiento y puntos de color café en árboles de Guanábana. 

En cuajinicuil, el hongo sujeto a los postulados de Koch indujo síntomas a los 13 días después de la inoculación en plantas, mientas que en hojas desprendidas los síntomas se presentaron 10 días después de ser inoculadas. Las hojas presentaron manchas redondas a irregulares amarillentas características de la enfermedad original inicial. Al reaislar los hongos de ambas pruebas se confirmó que fueron similares a los hongos aislados inicialmente. El crecimiento de 8.5 cm de la colonia se logró en siete días. Las características de la colonia se describen en el Cuadro 1.

Cuadro 1 Nomenclatura, asignación taxonómica y características de los hongos patógenos de cuajinicuil y guanábana. 

Fruit tree	Strain/NCBI accession number	Genus	Culture characteristics	Colonies in PDA
Cuajinicuil	HCUA1/MW418007	Diaporthe sp. (Sordariomycetes, Diaporthaceae)	Aerial mycelia growth in cream concentric rings with lobulated edge and the vegetative growth in gray. After few days, mycelium becomes cottony and dense, grayish sepia color on the reverse
Soursop	HGUA1/MW418003	Lasiodiplodia sp. (Dothideomycetes, Botryosphaeriaceae)	White dense aerial mycelia. Few days later, the mycelia turns olive gray to dark gray.

En guanábana, el hongo inoculado indujo síntomas similares a los observados en inicialmente en campo, 10 días después de la inoculación. Las manchas fueron color marrón con margen amarillo e irregulares. En el reaislamiento, el hongo mostró similitud con el aislado inicialmente. Las características del crecimiento de la colonia (Cuadro 1) coinciden con las reportadas por ^{Picos-Muñoz et al. (2015}) descritas para el hongo Lasiodiplodia theobromae obtenido de papaya.

Los hongos aislados de cuajinicuil presentaron conidios ovoides, aseptados y hialinos, mientras que los conidios del hongo de guanábana fueron subovoides a elipsoidales, con ápices redondeados, hialinos y aceptados (inmaduros), con un septo y color café (maduros).

Las secuencias de ADN obtenidas a partir de los hongos aislados presentaron porcentajes de identidad de 99% después de realizar un BLAST en NCBI para los géneros Diaporthe y Lasiodiplodia. Con base en el análisis filogenético de la región ITS se determinó la relación filogenética de los aislados con secuencias depositadas en la base de datos del GenBank, resultando en la identificación de Diaporthe sp. para el hongo aislado de cuajinicuil, y Lasiodiplodia sp. para el hongo aislado de guanábana (Figura 2). Las secuencias nucleotídicas de ambos patógenos fueron depositadas en la base de datos del GenBank donde se les asignó un número de acceso (Cuadro 1).

Figura 2 Árbol filogenético de máxima verosimilitud de los hongos Diaporthe sp. recuperado de cuajinicuil (HCUA1) y Lasiodiplodia sp. aislado de guanábana (HGUA1). Alternaria alternata (KX377683.1) se utilizó como grupo externo. La confiabilidad en cada nodo se evaluó mediante 1000 réplicas de bootstrap. Los aislados indicados en este estudio están marcados en azul. 

Las especies de Diaporthe (Phomopsis) pueden ser fitopatógenos, endófitos o saprofitos, en una amplia gama de hospedantes, además nuevas especies se reportan recientemente en diversas regiones (^{Sun et al., 2021}; ^{Guo et al., 2020}). El hongo causa pudrición de raíces y frutos, cancro, manchas foliares, muerte descendente y marchitez (^{Gomes et al., 2013}), en cítricos causa melanosis, pudrición del pedúnculo y gomosis (^{Guarnaccia y Crous, 2018}; ^{Mondal et al., 2007}). Hasta la fecha no hay reportes de este hongo afectando cuajinicuil. Diaporthe pudo haber estado asociado al árbol como epifito, y ante ciertas condiciones climáticas, el hongo se empezó a comportar como patógeno. En revisión exhaustiva de investigaciones recientes, no se encontraron reportes de la presencia Diaporthe en el cultivo de cuajinicuil, causando síntomas foliares. Un aspecto interesante de este género es que, siendo endófitos, en ocasiones pueden comportarse como patógenos oportunistas de las plantas. Un ejemplo de ello es D. foeniculina, el cual es endófito y patógeno oportunista en diversas malezas, en plantas ornamentales y árboles frutales (Mondal et al., 2007). Este hallazgo de este género en cuajinicuil representa un aporte importante para el manejo del hongo en el frutal, en las pequeñas comunidades rurales de Oaxaca, México.

Se ha reportado que algunos de los síntomas causados por diversas especies de Lasiodiplodia son cancro, gomosis, muerte regresiva, tizón foliar y daño en la corona en diversos cultivos (^{Shahbaz et al., 2009}). Muchos patógenos tienen una etapa latente en su ciclo de vida y no causan síntomas en su hospedante. ^{Salvatore et al. (2020}) mencionan que la duración de la etapa latente es muy variable, y el cambio patogénico puede depender de cambios en la susceptibilidad del hospedante (algún tipo de estrés), que pueden desencadenar un comportamiento más agresivo en el patógeno. Es conocido que los miembros de Botryosphaeriaceae son patógenos latentes de muchos hospedantes (^{Sakalidis et al., 2011}; ^{Slippers et al., 2007}). Además, una característica de Lasiodiplodia spp. es que se adapta fácilmente en regiones tropicales y subtropicales (^{Mehl et al., 2017}) como los microclimas de Oaxaca; incluso, el aumento de la temperatura puede generar la expansión del rango de hospedantes.

Se ha reportado a Lasiodiplodia theobromae afectando cultivos como lima (^{Valle-De la Paz et al., 2019}), cacao, aguacate, plátano, durazno (^{Picos-Muñoz et al., 2015}) entre otros. En el caso particular de guanábana, L. theobromae se identificó como agente causal de pudriciones en fruto en Nayarit, México por ^{Cambero-Ayón et al. (2019}), y en la Isla Mauricio por ^{Lutchmeah (1988}), aunque estos autores no realizaron estudios en follaje. Las características morfológicas de Lasiodiplodia aislado en este estudio coinciden con las de la especie L. theobromae, sin embargo, se requiere analizar morfológica (características de colonia y conidios) y molecularmente, con el uso de más marcadores genéticos (26S ARNr, calmodulina y β-tubulina) para lograr su identificación a nivel de especie.

Este estudio representa un primer acercamiento a los hongos que afectan el follaje de árboles de guanábana y cuajinicuil. La identificación de los organismos causales de una enfermedad permite inicialmente el diseño del manejo integrado de ésta. Ambas enfermedades están causando una severidad del 50% en cada cultivo. La dispersión y emergencia de fitopatógenos en nuevas regiones en las que no se tenía reporte de su presencia, representa un compromiso para explorarlos y a partir de su identificación, establecer planes de control fitosanitario que contribuyan al manejo integrado del cultivo. Este trabajo representa una línea base para realizar estudios más profundos de los hongos que limitan la producción de alimentos en pequeñas comunidades del país. Por lo que es importante ampliar el muestreo a otras parcelas de la misma región, así como la revisión microscópica de más aislados fúngicos, a los cuales se les realizará el análisis de los genes que codifican para el factor de elongación 1-α (TEF 1-α) y β-Tubulina (β-Tub).

De acuerdo con los postulados de Koch y a la identificación molecular, Diaporthe sp. se asoció como patógeno foliar de cuajinicuil en la localidad de Peña Negra, San Sebastián Nopalera, Oaxaca. Por otra parte, en síntomas foliares en guanábana se identificó Lasiodiplodia sp. en la misma localidad de Oaxaca, donde estos cultivos son de traspatio.