Los bananos y plátanos (Musa spp.) constituyen una importante fuente de alimento para una gran parte de la población mundial. Sin embargo, la producción de las musáceas se encuentra amenazada por la incidencia de enfermedades como la marchitez por Fusarium. Esta enfermedad causada por Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC) representa una de las enfermedades más destructivas y de importancia económica en el género Musa. El control del patógeno vascular con el uso de agroquímicos resulta costoso y causa serios daños al medio ambiente (^{FAOSTAT, 2020}). Por ello, en los últimos años se ha considerado al mejoramiento genético para la resistencia como la única forma de control efectivo y segura (^{Saraswathi et al., 2016}). En este sentido, la utilización de técnicas biotecnológicas en apoyo al mejoramiento genético para la resistencia a la marchitez por Fusarium en banano ha permitido introducir los resultados de la mejora con mayor rapidez; en comparación con los métodos del mejoramiento genético convencional (^{García et al., 2021}). Por otro lado, han permitido aumentar la eficiencia de los programas de mejoramiento genético en el cultivo (^{Saraswathi et al., 2016}). ^{Ventura et al. (2015}) mediante el uso combinado del cultivo de tejidos y la mutagénesis in vitro en ápices meristemáticos del cultivar ‘Zanzíbar’ (grupo AAB) obtuvieron una amplia variabilidad genética en el clon ‘Zanzíbar’ donde seleccionaron 15 mutantes. Las líneas ‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ’Z 30 A’ resultaron los mejores materiales promisorios para el mejoramiento genético en el cultivo por su alto rendimiento; por la eliminación de los cormos superficiales; por la disminución en la altura; y por el ahijmiento ordenado. El presente trabajo se realizó con el objetivo de evaluar la resistencia a marchitez por Fusarium raza 1 en nuevos clones de banano ‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ’Z 30 A’ obtenidos mediante técnicas biotecnológicas en Cuba.

La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Interacción Planta - Patógeno del Centro de Bioplantas de la Universidad de Ciego de Ávila ¨Máximo Gómez Báez¨, Cuba.

Líneas evaluadas del clon ‘Zanzíbar’ (grupo AAB). Se utilizaron las líneas seleccionadas del clon ‘Zanzíbar’ (grupo AAB) (‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ’Z 30 A’). Las cuales fueron obtenidas en el programa de mejoramiento genético de Musa spp. que se desarrolló en el Instituto Nacional de Investigaciones en Viandas Tropicales de Santo Domingo, Villa Clara, Cuba (INIVIT). En el cual mediante la utilización de radiaciones ionizantes (rayos gamma) en ápices meristemáticos del clon ‘Zanzíbar’, a partir del cultivo in vitro lograron la selección de 15 mutantes. Posteriormente, en condiciones de campo, y durante tres ciclos vegetativos seleccionaron las líneas ‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ’Z 30 A’ como los materiales más avanzados para el mejoramiento genético en el cultivo. Los cuales son propuestos para ser registrados por el Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA) como nuevos genotipos en Musa spp. (^{Ventura et al. 2015}).

Material vegetal. Se utilizaron muestras foliares de las líneas ‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ‘Z 30 A’ de ocho a nueve meses de plantadas en el Banco de Germoplasma de Banano del INIVIT.

Cepa fúngica. Se utilizó un aislado de FOC raza 1 (perteneciente al grupo de compatibilidad vegetativa (GCV) [01210] procedente del cepario del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV), La Habana, Cuba.

Filtrado del cultivo del hongo (FC). Para obtener el cultivo en medio líquido del hongo, se tomaron discos de micelio de 8 mm de diámetro próximos a la periferia de la colonia crecida en placas de Petri con medio de cultivo Agar Papa Dextrosa. Se añadió 100 mL de medio de cultivo Caldo Czapek con un pH 5.5, en un matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad. En el matraz se sembró un disco de micelio y se incubó durante 24 días a 28±2 °C, 56 µmol m^-2 s^-1 de intensidad luminosa; y con un fotoperíodo de 12 horas luz/12 horas oscuridad. El FC del hongo se cosechó a los 24 días, donde se filtró mediante cuatro capas de gasa y luego por papel de filtro Whatman No. 1. Se centrifugó a 8000 rpm durante 20 minutos en una centrífuga Sigma-201M para eliminar los restos de micelio y conidios. El sobrenadante se pasó a través de filtros con poros de 0.22 mm de diámetro (Sartorius, NG, Göttingen, Alemania). El FC se concentró por rotoevaporación (en rotoevaporador Heidolph, Bioblock, París, Francia) al 80% (v/v). Para llevar a cabo el experimento se utilizaron dos tratamientos que consistieron: 1) el FC del hongo concentrado (medio de cultivo Caldo Czapek inoculado con el hongo e incubado durante 24 días); y 2) el medio de cultivo Caldo Czapek, sin el hongo e incubado durante 24 días, y que se utilizó como tratamiento testigo.

Procedimiento para evaluar la resistencia a marchitez por Fusarium raza 1. Para evaluar la resistencia y/o susceptibilidad se establecieron seis momentos de evaluación (cada dos meses en el mismo año del desarrollo de la experimentación). Se realizó la colecta en campo de hojas sanas de mediana edad según la posición en la planta (hojas 3, 4 y 5) de cada línea a evaluar (‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ’Z 30 A’). En cada hoja se realizaron 18 punteaduras con una aguja estéril en el lado adaxial del limbo de la hoja con 3 cm de separación entre ellas; y en tres posiciones diferentes (distal, medio y proximal). Después del daño, se agregaron 5 µL del filtrado de cultivo del hongo (FC) y 5 µL del medio de cultivo sin el hongo y concentrado (tratamiento testigo). Las hojas se incubaron durante 48 horas a 28 ± 2 °C, 56 µmol m^-2 s^-1 de intensidad luminosa, fotoperiodo de 12 horas luz y 12 horas oscuridad y 70% de humedad relativa. Transcurridas las 48 horas se midió el área de las lesiones elíptica (mm²) de las hojas de acuerdo a ^{Companioni et al. (2005}); y se extrajeron fragmentos de hoja con las lesiones elípticas de (5 x 5 cm) que se colocaron en nitrógeno líquido para los posteriores análisis bioquímicos. Se evaluaron los siguientes indicadores bioquímicos: actividad peroxidasa, niveles de pigmentos clorofílicos (a, b y totales), contenido de fenoles libres y ligados a las paredes celulares, malondialdehído, otros aldehídos y proteínas.

La actividad peroxidasa se determinó según el método de ^{Pascual et al. (1983}). Los fragmentos de hoja de 100.0 mg se maceraron en nitrógeno líquido. La extracción se realizó con solución amortiguadora tris-HCl (0.01 mol L^-1, pH 7.0). La mezcla de la reacción incluyó: 0.1 mL de extracto de hojas, 1.0 mL de solución amortiguadora tris-HCl (0.01 mol L^-1), 0.15 mL de guayacol (100 mmol L^-1) y 20 µL de peróxido de hidrógeno. Se evaluó la absorbancia 470 nm cada 15 segundos durante tres minutos. El promedio de la variación de la absorbancia de la sección lineal de la curva se tomó para estimar la actividad peroxidasa. En cada determinación se consideró la reacción espontánea en el tiempo de los sustratos guayacol y peróxido de hidrógeno. La actividad enzimática guayacol peroxidasa fue expresada como unidades U g^-1 masa fresca de la hoja donde 1 U corresponde a 1 µmol de sustrato transformado en 1 minuto.

El contenido de pigmentos clorofílicos se determinó según ^{Porras (1991}). Los fragmentos de hoja de 100.0 mg se maceraron en nitrógeno líquido y posteriormente se adicionaron 0.5 mL de acetona al 80%. Las muestras se centrifugaron a 12 100 xg, 4 °C durante 15 minutos. Se colectó el sobrenadante y se evaluó la absorbancia 647 nm y 664 nm. El contenido de clorofila se calculó de la siguiente forma: 13.19*Absorbancia_664nm - 2.57*Absorbancia_647nm. El contenido de clorofila b se midió a través de la diferencia de 22.10*Absorbancia_647nm - 5.26*Absorbancia_664nm. El contenido total de pigmentos clorofílicos se obtuvo a partir de la suma de 7.93*Absorbancia_664nm + 19.53*Absorbancia_647nm.

El contenido de fenoles libres y ligados a las paredes celulares se determinó de acuerdo a ^{Gurr et al. (1992}). Los fragmentos de hoja de 100.0 mg se maceraron en nitrógeno líquido y luego se adicionó 0.5 mL de metanol. Las muestras fueron agitadas en un vortex y se centrifugaron a 12 100 xg, durante 15 minutos. El precipitado se sometió a dos ciclos adicionales de extracción con metanol, como se describió anteriormente. El sobrenadante se colectó siempre y se consideró como la fracción de los fenoles libres. El precipitado se incubó con 0.25 mL de hidróxido de sodio (2.0 mol L^-1) durante 16 horas a 70 °C. Se adicionó ácido clorhídrico (0.25 mL, 2.0 mol L^-1) después de la incubación. Las muestras se centrifugaron a 12 100 xg, durante 15 minutos. El precipitado se descartó y el sobrenadante se consideró como el reservorio de los fenoles ligados a las paredes celulares. Con el objetivo de cuantificar los niveles de fenoles libres y ligados a las paredes celulares, 20 μL del sobrenadante se mezclaron con 980.0 μL de agua destilada. Se adicionó 100.0 μL del reactivo de Folin-Ciocalteau, y las muestras se incubaron durante 5 minutos. Se adicionó bicarbonato de sodio (600.0 μL, saturado con hidróxido de sodio (0.1 mol L^-1)) y transcurrido 60 minutos se determinó la absorbancia a 725 nm. El contenido de fenoles se expresó en mg de fenoles g^-1 de masa fresca de la hoja referidos a una curva patrón de ácido clorogénico.

El contenido de malondialdehído y otros aldehídos se evaluó según ^{Heath y Packer (1968}). Los fragmentos de hoja de 100.0 mg se maceraron en nitrógeno líquido. Las muestras maceradas se mezclaron con 1.4 mL de agua destilada, y se agitaron brevemente en un vortex. Se adicionaron 1.5 mL de ácido tiobarbitúrico (0.5%, m/v; en ácido tricloacético 20%, v/v), y las muestras se incubaron en baño de María a 100 °C, durante 25 minutos. Más tarde, las muestras se enfriaron en hielo por un tiempo de 15 minutos, y se centrifugaron a 756 xg, durante 10 minutos. Se evaluó la absorbancia del sobrenadante a 455 nm, 532 nm y 600 nm. La absorbancia no específica del producto de la reacción se midió a 600 nm, y se sustrajo de la absorbancia máxima a 532 nm para las mediciones del malondialdehído, y a 455 nm para otros aldehídos. Para los cálculos de las concentraciones del malondialdehído se utilizó un coeficiente de extinción de 155 mmol^-1 cm^-1 a 532 nm. Para los otros aldehídos, el coeficiente de extinción fue de 45.7 mmol^-1 cm^-1 (promedio de los coeficientes de extinción del propanal, butanal, hexanal, y propanal-dimetilacetal) a 532 nm.

La concentración de proteínas se determinó según ^{Bradford (1976}). Los fragmentos de hoja de 100.0 mg se maceraron en nitrógeno líquido. La extracción se realizó con solución amortiguadora tris-HCl (0.01 mol L^-1, pH 7.0). El extracto de hoja de 0.1 mL se mezcló con 1.0 mL de reactivo de Bradford. Se evaluó la absorbancia a 595 nm. El contenido de proteínas se expresó en mg de proteínas g^-1 de masa fresca de la hoja referido a una curva patrón de albúmina de suero bovino (BSA). El contenido de proteínas presente en el filtrado del cultivo del hongo se le restó al contenido total de proteínas determinado en las hojas, a las 48 horas después de la aplicación del filtrado del cultivo del hongo.

Cada tratamiento incluyó tres hojas de plantas diferentes en cada línea evaluada (‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ’Z 30 A’). Se evaluaron las áreas de la lesión elíptica de 54 punteadura/tratamiento (18 punteadura/hoja) y cada determinación bioquímica implicó a tres muestras independientes (una de cada hoja). Con las mediciones citadas se evaluó cada planta en las funciones discriminantes descritas por ^{Companioni et al. (2005}) para conocer si eran clasificadas correctamente (Cuadro 1).

Como las áreas de las lesiones se habían medido en tres grupos de 18 lesiones cada uno, y cada determinación bioquímica se había repetido tres veces, entonces se disponía de tres juegos de datos por cada planta de la matriz original. Los tres juegos de datos de cada planta se evaluaron en la función discriminante para clones resistentes y en la función discriminante para clones susceptibles. Los resultados obtenidos se compararon mediante la prueba paramétrica t-test para conocer si los resultados de cada función eran estadísticamente diferentes. La probabilidad máxima de cometer error de tipo I fue 0.05. En el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el utilitario Statistical Package for Social Sciences (SPSS para Windows, versión 8, Copyright SPSS Inc., 1989-1997). Por otra parte, el procedimiento descrito anteriormente para la evaluación de la resistencia por Fusarium raza 1 en las líneas del clon ‘Zanzíbar’ se presenta a continuación según ^{Companioni et al. (2012}) (Figura 1).

Figura 1 Método para la diferenciación a nivel foliar de la resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 1 en banano según ^{Companioni et al. (2012}). 

La evaluación de la resistencia a marchitez por Fusarium raza 1 GCV [01210] en cada línea evaluada y en cada momento de evaluación según las funciones discriminantes se describen a continuación (Cuadro 2). Después de las 48 horas de la aplicación de los tratamientos descritos, y el posterior análisis bioquímico en las hojas de las líneas del clon ‘Zanzíbar’ se pudo observar que las funciones discriminantes clasificaron como resistente al 93.3% de las plantas evaluadas del mutante ‘Z 30’ (56 plantas de 60). Mientras, que en la línea ‘Z 13’ se clasificaron como resistentes el 91.6% de las plantas evaluadas (55 plantas de 60). Por último, en la línea ’Z 30A’ se observó que las funciones discriminantes en este cultivar clasificaron al 96.6% de las plantas como resistente (58 plantas de 60). Los resultados evidenciaron que las líneas seleccionadas del clon ‘Zanzíbar’ irradiado (‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ‘Z 30 A’) pueden ser materiales promisorios para el mejoramiento genético en el cultivo, dirigido a la resistencia a FOC raza 1 GCV [01210], donde su resistencia osciló del 91.6 al 96.6%. Sin embargo, no se descarta la necesidad de continuar estudios adicionales en campo para verificar la resistencia en las líneas evaluadas. El primero y más crucial de todos los pasos al evaluar un nuevo clon de banano consiste en la evaluación de la resistencia en plantas frente a las diferentes ‘formae specialis’ de Fusarium oxysporum (^{Buddenhagen, 2009}).

Por otro lado, aunque se realicen evaluaciones de la resistencia in vitro, las plantas supuestamente resistentes deben someterse a estudios en campo (^{Dita et al., 2018}). En este sentido, ^{Saraswathi et al. (2016}) realizaron la selección de los mutantes de banano del cultivar Rasthali (Silk, AAB) con resistencia a la raza 1 del GCV [0124/5] de FOC mediante la selección in vitro. Para ello, utilizaron como agentes de selección toxina (ácido fusárico), y FC del patógeno. Los brotes individuales de los mutantes de banano obtenidos después del tercer o cuarto subcultivo fueron transferidos al medio de cultivo de multiplicación, suplementado con diferentes concentraciones de la toxina (ácido fusárico comercial) (Sigma Aldrich, EE. UU.) (0.0125; 0.025; 0.0375; 0.05 y 0.0625 mM); y a las concentraciones de 3; 4; 5; 6; 7 y 8% del FC del patógeno. Además, añadieron el regulador de crecimiento. Después de tres semanas observaron el 50% de supervivencia de los explantes en la concentración de 0.050 mM de la toxina; y 7% con el FC del hongo. En concentraciones superiores observaron una rápida disminución en el crecimiento de los brotes de los mutantes de banano. A los tres meses siguientes, los mutantes seleccionados fueron transferidos para realizar las pruebas en macetas, en condiciones controladas mediante la inoculación al sustrato con una suspensión de esporas de 12 × 10⁹ conidios mL^-1 del hongo. Posterior a los seis meses del proceso de evaluación de la resistencia obtuvieron tres mutantes putativos resistentes a la raza 1 de FOC. Los cuales fueron multiplicado in vitro de forma masiva para continuar otros estudios en la interacción. Es importante señalar que para el establecimiento de sistemas de selección de la resistencia la determinación de una concentración correcta del FC del patógeno o toxina, para la expresión de la actividad fitotóxica diferencial entre variedades es necesaria. Lo cual incrementa las posibilidades de obtener líneas estables de plantas con resistencia a las enfermedades (^{Portal et al. 2021}). Como se puede mostrar, aunque se realicen selecciones in vitro las plantas supuestamente resistentes deben someterse a estudios en campo.

Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las líneas seleccionadas del clon ‘Zanzíbar’ irradiado (‘Z 13’, ‘Z 30’ y el ‘Z 30 A’) evaluadas en los diferentes momentos de la selección mostraron resistencia a FOC raza 1 GCV [01210] según el método para la diferenciación de la susceptibilidad o resistencia a marchitez por Fusarium descrito por ^{Companioni et al. (2005}; 2012). Por otra parte, se evidencia la facilidad para realizar el trabajo de evaluación de la resistencia con FC del hongo; así como la reducción del tiempo necesario de respuesta para conocer si una planta es resistente o susceptible (48 horas). Por último, permite evaluar un número importante de muestras en condiciones de laboratorio, y de esta manera acelerar los programas de mejoramiento genético a esta enfermedad. Lo cual evidencia el potencial de la biotecnología en el campo del mejoramiento genético en el cultivo.