El género Sphaeralcea perteneciente a la familia Malvaceae, está representado por alrededor de 40 especies que se encuentran principalmente en la parte occidental de Norteamérica, y más de 50% se distribuyen en México, la especie más representativa es Sphaeralcea angustifolia Cav. G. Don., una planta comúnmente conocida como vara de San José, hierba del negro o tlixihuitl en la lengua náhuatl (^{Rzedowski y Rzedowski, 2005}), la cual se encuentra ampliamente distribuida (^{McVaugh, 2001}). ^{Andrade-Ceto (2009)} reporta que ha sido utilizada por su efecto antiinflamatorio en enfermedades como tonsilitis, bronquitis, conjuntivitis, reumatismo, contusiones y hemorroides. También se utiliza como cicatrizante, en el tratamiento de desórdenes gastrointestinales como diarrea y disentería (^{García-Rodríguez et al., 2012}; ^{Calzada et al., 2017}) y la osteoartritis (^{Romero-Cerecero et al., 2013}).

Los Pucciniales (Basidiomycota) son un orden de hongos parásitos obligados de plantas vasculares, con ciclos de vida complejos y causantes de enfermedades conocidas como royas (^{Toome-Heller, 2016}; ^{Aime et al., 2018}). En la actualidad, se estima que existen de 7500 a 8500 especies descritas de Pucciniales siendo el género Puccinia el que más pérdidas económicas causa (Toome-Heller, 2016) y el que comprende el mayor número de especies reportadas con aproximadamente 4000. Por lo anterior, y por la alta especificidad con sus hospedantes, se complica el estudio de su evolución (Aime et al., 2018). Diferentes especies de los géneros Sphaeralcea, Sidalceae, Althaea, Malvastrum, Alcea (Malvaceae), son afectadas por Puccinia sherardiana (^{Horst, 2013}; ^{Demers et al., 2015}), una roya reportada como microcíclica (^{Briere y Franc, 1998}; ^{Dugan y Nazaire, 2011}), la cual se caracteriza por producir síntomas y signos tanto en el tallo como en las hojas que consisten de la presencia de telios de color café oscuro, rodeados por halos cloróticos. Estos síntomas se han reportado en Sphaeralcea grossulariaefolia, S. munroana y Sidalcea malviflora en EE. UU. (Briere y Franc, 1998; ^{Sampangi et al., 2010}). Los objetivos del presente trabajo fueron observar el ciclo de P. sherardiana en S. angustifolia, realizar una descripción morfológica detallada del hongo y verificar su patogenicidad.

Durante junio a agosto, en los años 2017 y 2018, se recolectaron plantas de S. angustifolia con desarrollo de soros, en la región de Santa María (19°51’23.60” N, 98°44’57.02” O), Axapusco, Estado de México. Para la descripción morfométrica del patógeno, los espermacios, eciosporas y teliosporas, así como secciones de los espermogonios, ecios y telios se montaron por separado en una gota de lactofenol con azul de algodón sobre portaobjetos para su observación en microscopia de luz. Se determinó la morfología y tamaño de 50 esporas a una magnificación de 40X. Las estructuras superficiales de las eciosporas y teliosporas se observaron directamente usando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (Carls Zeiss^®). Las características de los telios y teliosporas se compararon con claves taxonómicas y descripciones realizadas previamente por ^{Hotson (1934}) y ^{Arthur (1962}).

Para confirmar la identidad del hongo, se rasparon eciosporas a partir de un ecio de plantas sintomáticas colectadas en campo, a partir del cual se extrajo el ADN. La calidad del ADN se verificó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV usando un transiluminador M-26X (UVP Ltd^®, EE. UU.). Se amplificó por PCR parte del gen 28S del ADN ribosómico (incluyendo los dominios D1 y D2) usando los iniciadores LR0R y LR6 (^{Vilgalys y Hester, 1990}, ^{Aime et al., 2006}). Cada mezcla de reacción (50 μL) contenía Buffer para PCR 1X, 0.02 U µL^-1 de ADN polimerasa (Promega^®, EE. UU.), 2.5 mM de MgCl₂, 0.2 mM de dNTPs, 0.8 Μm de cada iniciador y 2 ng de ADN molde. La PCR se llevó a cabo en un termociclador Bio-Rad C1000 (Bio-Rad Laboratories^®, EE. UU.) usando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 ºC por 3 min, 35 ciclos a 95 ºC por 90 s, 50 ºC por 60 s, 72 ºC por 90 s (alineamiento), seguido de una extensión final a 72ºC por 7 min. Los productos amplificados de PCR se purificaron usando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen^®, EE. UU.), y se secuenciaron en la empresa Macrogen (Seúl, Corea). Se realizaron búsquedas utilizando el algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para obtener secuencias similares depositadas en el GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information). Las matrices fueron compiladas utilizando el programa MEGA 5.0.5. Los alineamientos fueron realizados en internet utilizando el programa MAFFT 7 mediante las estrategias E-INS-i y FFT-NS-i y los parámetros por defecto. Las matrices fueron analizadas utilizando criterios de inferencia Bayesiana.

Plantas de S. angustifolia se reprodujeron bajo condiciones aisladas en invernadero. Las plantas se colocaron en bolsas de polietileno con sustrato a base de agrolita, turba y tierra de monte en una proporción de 20, 30 y 50%, respectivamente; la mezcla se desinfestó en autoclave a 121 lb tres veces durante 30 min cada vez. Cuando las plantas alcanzaron una edad de seis semanas, las hojas se inocularon mediante aspersión con una suspensión de teliosporas a una concentración de 1 ´ 10⁴ teliosporas mL^-1, estas se obtuvieron a partir de plantas con signos del patógeno. Las plantas inoculadas se conservaron bajo condiciones de invernadero (temperatura promedio de 22 °C en el día y 18 °C durante la noche y 60 % de humedad relativa). El ensayo se repitió dos veces.

En campo, los síntomas iniciaron con una decoloración verde claro en forma de manchas circulares que se observaron por ambos lados de la hoja (adaxial y abaxial) (Figura 1A y 1B); en el centro se desarrollaron pequeños puntos de color café claro que correspondieron a la formación de los espermogonios; posteriormente, las manchas se tornaron de color amarillo claro y crecieron en tamaño de forma irregular, en esta etapa en la parte abaxial se observó el desarrollo de ecios y eciosporas de color amarillo (Figura 1C, 1D y 1E). Posteriormente, se formaron los telios (Figura 1F) y estos dieron origen a teliosporas, ambos casos sucedieron únicamente en la parte abaxial, así como en el tallo (Figura 1G); los telios estuvieron delimitados por halos cloróticos, en la parte adaxial se distinguieron lesiones de color café delimitadas por el halo clorótico (Figura 1H).

Figura 1 Síntomas y signos inducidos por Puccinia sherardiana en plantas de Sphaeralcea angustifolia. A, B) Manchas circulares de color verde claro; C, D y E) Desarrollo de ecios de color amarillo; F y G) Desarrollo de telios en hoja y tallo; H) Telios delimitados por una halo clorótico. 

Los picnios (espermogonios) se desarrollaron en grupos pequeños y fueron epífilos, subepidermales, del grupo V tipo 4 (de acuerdo con la clasificación de ^{Cummins y Hiratsuka, 2003}), cafés claros, localizados en lados opuestos del ecio, globosos, de 120-150 µm de diámetro (Figura 2A). Las picniosporas (espermacios) fueron hialinos a amarillentos, no septados, elipsoidales a subglobosos, de 3.5 × 2.5 µm. Los ecios fueron hipófilos, cupulados, agrupados, café claro, de 219-230 µm de diámetro (Figura 2B, 2C). Las eciosporas fueron oblongas a elipsoidales, finamente equinuladas, de 16.46 × 14.38 µm, con pared hialina de 1.5 µm de grosor, pero con la parte interior café claro o amarillento (Figura 2D). Los telios sobre tallos fueron hipófilos, pulvinados, verrucosos, regularmente confluentes, café rojizo a café oscuro. Las teliosporas se presentaron en grupos, mayormente elipsoidales a oblongas, con una constricción central, bicelulares, con poro apical, de tamaño promedio de 15 × 42 µm, lisa, café oscuro a café, con pared de 0.5-1.5 µm de grosor a los lados y 1.5-3 µm apicalmente (Figura 2E, 2F). Los pedicelos de las teliosporas usualmente fueron amarillentas, persistentes, de 105 µm de longitud y con paredes lisas de 1.5 µm de grosor. Basados en características morfológicas de las teliosporas, la roya se identificó como Puccinia sherardiana (^{Arthur, 1962}; ^{Dugan y Nazaire, 2011}; ^{Demers et al., 2015}). El estado uredinial no se presentó durante el periodo de observaciones.

Figura 2 Estructuras de reproducción de Puccinia sherardiana vistas en microscopia de luz (A) y microscopia electrónica de barrido (B-F). A) Corte longitudinal de un espermogonio. B-C) Ecios. D) Eciosporas. E-F) Teliosporas. 

Los síntomas y signos foliares se observaron a los 15 días después de la inoculación en invernadero, tiempo en el cual se presentaron ecios en formación, los cuales posteriormente dieron origen a la formación de eciosporas, después de romper la epidermis de la hoja. Cinco días después se observó la formación de telios y teliosporas, estás últimas fueron observadas para completar los Postulados de Koch, sus características correspondieron con las observadas previamente para el caso de P. sherardiana.

La secuencia generada en este estudio se depositó en la base del GenBank con número de acceso MN967778.1. El análisis filogenético generado con la secuencia parcial del gen 28S y usando el criterio de inferencia Bayesiana mostró un valor de 0.99 de probabilidad posterior con secuencias de los aislados BPI871783 y BPI102198 de P. sherardiana (Figura 3).

Figura 3 Árbol Bayesiano generado a partir de alineamiento de secuencias parciales del gen 28S de especies de Puccinia. Los valores de probabilidad posterior Bayesianos arriba de 0.50 se muestran en los nodos. El aislado BPI863541 de Pucciniosira pallidula se usó como grupo externo. 

Puccinia sherardiana se ha reportado en los EE. UU. (Arizona, California, Colorado, Nevada, Oregón, Washington, Idaho, Nebraska, Nuevo México, Texas, Utah, Wyoming, Montana y North Dakota) infectando diferentes especies de los géneros Alcea, Malvastrum, Sidalcea y Sphaeralcea, dentro de la familia Malvaceae (^{Arthur, 1962}; ^{Briere y Franc, 1998}; ^{Dugan y Nazaire, 2011}; ^{Demers et al., 2015}). En el caso de México, Arthur (1962) mencionó que P. sherardiana está presente en el país; sin embargo, no se proporcionaron datos del sitio de colecta ni del hospedante; por su parte Demers et al. (2015), identificaron a esta roya en dos especímenes (de origen desconocido) de Sphaeralcea sp., en intercepciones realizadas en El Paso, Texas, en mercancía que entraba por la frontera de México. En lo que respecta a la morfometría, las características de las teliosporas de P. sherardiana identificadas sobre S. angustifolia fueron similares a las reportadas por Arthur (1962), Briere y Franc (1998), Dugan y Nazaire (2011) y Demers et al. (2015). Sin embargo, en este estudio se presentaron diferencias, por ejemplo, las teliosporas fueron más angostas (15.8 µm), respecto al tamaño reportado (27-30 µm) por los autores anteriormente mencionados en diferentes hospedantes, 30.85 µm en Sphaeralcea grossulariaefolia y S. munroana, 21-25 µm en Sidalcea malviflora, y de 18-30 µm en Alcea rosea. Con respecto al desarrollo de telios, Briere y Franc (1998) reportaron que están presentes en ambos lados de la hoja en S. grossulariaefolia y S. munroana. Por su parte, Dugan y Nazaire (2011) observaron telios principalmente en la parte adaxial de hojas de Sidalcea malviflora, mientras que en este estudio solo se presentaron en la parte abaxial. Los síntomas foliares son factibles de reproducir mediante la inoculación de plantas de S. angustifolia de seis semanas de edad con teliosporas de P. sherardiana en condiciones de invernadero y en un período de 15 días con temperatura promedio de 22 °C en el día y 18 °C durante la noche. Por su parte, Briere y Franc (1998) completaron los postulados de Koch en un período de tiempo de 13 días al utilizar plantas de 8 semanas de edad y temperatura de 20 y 15 °C durante el día y noche, respectivamente. Es importante mencionar que en este trabajo se describen por primera vez las características morfométricas de los picnios y picniosporas y se reporta la fase ecial con la respectiva descripción de los ecios y eciosporas, con lo cual se presentan las primeras evidencias para una posible reclasificación de P. sherardiana como una roya demicíclica y no microcíclica como se ha reportado anteriormente por Arthur (1962), Briere y Franc (1998) y Dugan y Nazaire (2011) al mencionar que la roya carece de la fase ecial y uredinial. Sin embargo, aún se desconoce si presenta o no la parte uredinal.