Materiales y métodos

Colecta de material biológico. 20 muestras de hojas de cada una de las enfermedades de mancha foliar y antracnosis se colectaron en plantaciones de palma camedor de ocho años de edad ubicados en los Ejidos Sierra Morena (16° 08´51.6” LN - 93° 36´ 30.06” LW) y Plan de Ayala (15°90´47.22¨ LN-93°21´25.00¨ LW) del municipio de Villa Corzo, Chiapas. Las muestras se colocaron en bolsas de plástico acondicionadas con papel absorbente, se etiquetaron y trasladaron al Laboratorio de Biofertilizantes y Bioinsecticidas de la Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas, Sede Villa Corzo y se conservaron en un recipiente con agua hasta su uso.

Aislamiento y purificación de los hongos. Las hojas de palma camedor con síntomas de mancha foliar y antracnosis se diseccionaron en trozos de 0.5 cm², se lavaron con etanol al 70 % por 3 minutos y con hipoclorito de sodio al 10 % por 10 min, posteriormente se lavaron dos veces con agua destilada estéril por 2 min. Se sembraron 10 trozos de cada uno de los síntomas en medio papa dextrosa agar (PDA) por triplicado e incubados a 28 °C, fotoperiodo 12:12 luz/oscuridad por 10 días, el crecimiento micelial de los hongos fue monitoreado cada 24 horas y purificados por punta de hifa y cultivo monospórico (^{Ruiz-Cisneros et al., 2017}).

Identificación morfológica. De los 30 trozos de tejido sembrados en PDA se aislaron 10 hongos de cada uno de los síntomas de mancha foliar y antracnosis que fueron los primeros que emergieron de los tejidos después de 48 h, se identificaron morfológicamente a nivel de género mediante sus estructuras de reproducción observadas en un microscopio óptico (Axiolab 5, Carl Zeiss) y con el apoyo de claves taxonómicas (^{Barnett and Hunter, 2006}; ^{Watanabe, 2002}).

Identificación molecular. Para la identificación molecular, el hongo aislado de las hojas con síntomas de mancha foliar y el hongo de antracnosis se sembraron en cajas petri con PDA cubierto con un celofán estéril y se incubó por 7 días a 28 ºC. El micelio fue cosechado y congelado con nitrógeno líquido, se extrajo el ADN siguiendo el protocolo de ^{Raeder and Broda (1989}). El ADN total se utilizó para amplificar el espaciador de transcrito interno (ITS) del 18S del rADN utilizando los oligos ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) con las siguientes condiciones de amplificación de una etapa inicial de desnaturalización de 94 ºC por 5 minutos, seguidos de 30 ciclos (extensión 94 ºC 30 s, alineamiento 60 ºC 30 s, extensión 72 ºC por 45 s) y una extensión final de 72 ºC por 10 minutos, donde el fragmento puede ser de 710 a 850 pb según la especie de hongo (^{White et al., 1990}). Los amplicones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron secuenciados por el método de Sanger en un secuenciador ABI (Applied Biosystems). Las secuencias fueron comparadas con la base de datos NCBI usando el algoritmo de BLAST (^{Altschul et al., 1990}).

Prueba de patogenicidad. Los postulados de Koch se realizaron en condiciones de campo bajo sombra en las instalaciones de la Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas (UNICACH), se usaron plántulas de dos años de edad sembradas en bolsa de polietileno de 5 kg y sustrato suelo natural de las mismas plantaciones. Los dos hongos aislados e identificados previamente se cultivaron en medio PDA a 28 ºC fotoperiodo 12:12 luz/oscuridad por 15 días. La inoculación de Neopestalotiopsis sp. se realizó de manera directa y consistió en tomar los picnidios de los acérvulos con una aguja hipodérmica e inocular las hojas de las plantas a través de una ligera herida a la epidermis (^{Rebollar et al., 2020}) y para C. karstii se utilizó una solución de conidias de 1x 10⁶ esporas mL^-1 y se inocularon 10 µL. Para ambos hongos se inocularon cinco plantas (dos hojas por planta). Las plantas inoculadas se asperjaron agua destilada estéril, se cubrieron con bolsas de plástico y se descubrieron al tercer día. Se mantuvieron en irrigaciones regulares y en observación hasta que aparecieron los síntomas de las enfermedades. De los síntomas obtenidos se tomaron muestras y se reaislaron los hongos inoculados siguiendo el protocolo previamente descrito. Se utilizaron cinco plantas control inoculadas con agua estéril y el experimento se realizó por duplicado.

Incidencia y severidad en campo. Para cuantificar la incidencia de las enfermedades foliares de palma camedor, se seleccionó una parcela de 1 ha de ocho años de edad ubicada en el ejido Sierra Morena, se hizo un muestreo de cinco de oros, en cada punto se etiquetaron y muestrearon 20 plantas, se cuantificó el número de plantas con síntomas de un total de 100 plantas, los muestreos se realizaron cada dos meses durante un año en los mismos puntos y mismas plantas y en cada uno se promedió los valores de los cinco puntos. Para la severidad de las enfermedades se construyó una escala pictográfica de daño con valores de 1-5; donde 1 representa (0% de daño), 2 (1-25% de daño), 3 (26-50% de daño), 4 (51-75% de daño) y 5 (76-100% de daño) (Figura 1), el porcentaje de daño se midió de manera directa de cada una de las plantas cuantificadas en la incidencia de la enfermedad. Los porcentajes de incidencia y severidad de la enfermedad se transformaron a valores de áreas bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) (^{Pedroza y Samaniego, 2009}).

Figura 1 Escalas pictográficas de daño con valores de 1-5, donde 1 representa (0% de daño), 2 (1-25% de daño), 3 (26-50% de daño), 4 (51-75% de daño) y 5 (76-100% de daño) para las enfermedades mancha foliar (A) y antracnosis (B). 

Resultados y discusión

Identificación morfológica y molecular. De las hojas con síntomas de mancha foliar se aisló y purificó 10 colonias de hongos, que con base a los análisis morfológicos formadas en medio PDA todas fueron identificadas como Neopestalotiopsis sp., ya que presentaron características de hongo filamentoso algodonoso con hifas elevadas inicialmente de color blanco, acérvulos que parecen pequeñas pústulas de color negro brillante con abundante conidios de forma fusiformes con tres células centrales pigmentadas y las basales hialinas (dimensiones de 13.22 a 15.88 µm de longitud x 2.82 a 3.59 µm de ancho), con dos a cuatro sétulas apicales (medidas 5.99 x 8.49 µm de longitud y 0.67 x 1.21 µm de ancho) y un pedicelo en las células basales (^{Barnett and Hunter, 2006}; ^{Watanabe, 2002}) (Figura 2). Estructuras con características similares fueron reportadas por ^{Rebollar et al. (2020}) en cultivo de fresa y ^{Gerardo-Lugo et al. (2020}) en cultivo de mango, tres células centrales pigmentadas de color amarillo y 3 sétulas apicales con un pedicelo en las células basales; sin embargo, las características morfológicas de los hongos fitopatógenos y en especial Neopestalotiopsis pueden variar y ser modificadas por las condiciones ambientales y estas no son confiables como medio de identificación (^{Maharachchikumbura et al., 2011}). Estudios realizados por ^{Acosta-González (2022}) confirman que hay diferencias en el diámetro del crecimiento final, así como la coloración, la textura del micelio, la producción de acérvulos, la elevación del micelio y los márgenes del género Neopestalotiopsis. La identificación molecular se basó en el análisis de la secuencia consenso del gen 18S rDNA (ITS5/ITS4) que presentó una alta similitud con Neopestalotiopsis sp. con una cobertura de 99% y un porcentaje de similitud de 99.48%, la secuencia fue registrada en el GenBank con número de acceso ON860658 (^{White et al., 1990}).

Figura 2 Síntoma de manchas foliar en hojas de palma camedor en campo, manchas ovaladas de color café claro con un punto negro en el centro afectando a los foliolos de la hoja (A), colonia blanca-marrón con micelio algodonoso y abundante acérvulos en el centro (B), acérvulos de color negro brillante con abundante conidios (C) y conidios con tres células pigmentadas en el centro y basales hialinas, con sétulas apicales y pedicelo basal (D) de Neopestalotiopsis sp formadas en PDA, síntomas presentados a los cuatro (E) y ocho (F) días después de la inoculación, conidias reaisladas producidas en PDA de las pruebas de patogenicidad (E) y planta control (F). 

Para el síntoma de antracnosis se identificó a Colletotrichum karstii como agente causal de esta enfermedad, la identificación se realizó a partir de 10 aislamientos frecuentes de hongos las cuales se caracterizan por ser filamentoso, las colonias forman esporodoquios de reproducción asexual con conidios hialinos, marrón pálido semi esféricos, simples o ramificados o erectos (dimensiones de 6.47 a 8.59 µm de longitud x 2.69 a 3.31 µm de ancho), conidióforos de 17.04 a 33.35 µm de altura (^{Barnett and Hunter, 2006}; ^{Watanabe, 2002}) (Figura 3). Características similares de este hongo fueron reportados en otros cultivos como la fresa en Brasil (^{Soares, 2021}) y cultivo de papaya en México (^{Pacheco et al., 2022}). La identificación molecular se obtuvo a través del análisis de la secuencia consenso obtenida por la amplificación del gen 18S rDNA (ITS5/ITS4) que presentó alta similitud con Colletotrichum karstii con una cobertura de 100% y un porcentaje de similitud de 99.83%, se registró en el GenBank con el número de acceso ON799261 (^{White et al., 1990}).

Pruebas de patogenicidad. Las plantas inoculadas con Neopestalotiopsis sp. presentaron los primeros síntomas de mancha foliar a los cuatro días posteriores y a los ocho días, los síntomas de pequeñas manchas ovaladas con un punto negro en el centro fueron marcados y definidos, iguales a los observados en campo. El control no presentó ninguna sintomatología. Las plantas con síntomas se utilizaron para reaislar el patógeno y se corroboró que Neopestalotiopsis sp. es el agente causal de la enfermedad de mancha foliar (Figura 2). Estos resultados concuerdan con lo reportado por ^{Khoo et al. (2022}) que encontró que las plantas de Ixora chinensis inoculadas con Neopestalotiopsis cubana manifestaron los síntomas a los siete días, mientras que las plantas de mango inoculadas con Neopestalotiopsis sp., y de fresa inoculadas con Neopestalotiopsis rosae presentaron los síntomas a los 10 días después de la inoculación (^{Gerardo-Lugo et al., 2020}; ^{Rebollar et al., 2020}).

En la prueba de patogenicidad con el hongo Colletotrichum karstii, los síntomas de antracnosis se manifestaron a partir del tercer día con pequeñas manchas café obscuras poco definidas y a los 11 días las manchas irregulares estaban bien marcadas reproduciendo los mismos síntomas observados en campo, el hongo fue reaislado e identificado como C. karstii (Figura 3). De acuerdo a lo reportado por ^{Ayvar-Serna et al. (2021}) en frutos de aguacate inoculados con el mismo patógeno manifestaron los síntomas a los cinco días, por su parte ^{Fernández-Herrera (2020}) coincide en que lo síntomas se empiezan a manifestarse a los tres días posteriores a la inoculación en plantas de orquídeas de Dendrobium nobile y a los siete días en frutos de chile (^{Saini et al., 2016}).

Figura 3 Síntoma de antracnosis en palma camedor en campo, manchas irregulares de color negro afectando a los foliolos de la hoja (A), colonia de color marrón pálido con abundante esporodoquios (B), conidióforos y conidios hialinos semiesféricos (C) de Colletotrichum karstii formadas en PDA, síntomas manifestados a los tres (D) y 11 días (E) después de la inoculación de la prueba de patogenicidad y planta control (F). 

Incidencia y severidad en campo. Durante el período de muestreo en campo de la enfermedad ocasionada por Neopestalotiopsis sp. se observó que la incidencia y la severidad presentaron una intensidad dependiente del clima y manejo durante el progreso de la enfermedad (Figura 4). Para el mes de junio se registró una incidencia de 12% (ABCPE=732), correspondiente a uno de los meses más secos de muestreo de verano, mientras que en agosto correspondiente a la temporada húmeda por las lluvias y de mayor actividad antropogénica por los cortes de hojas de palma, se presentó el valor más alto 45% (ABCPE= 2790). Para la severidad se registró un comportamiento similar a la incidencia, el mes más seco abril, se registró 25% de severidad (ABCPE=1525), mientras que el mes mas lluvioso y húmedo octubre 50% (ABCPE= 3355) (Figura 4). En este sentido se ha reportado que la enfermedad de manchas foliares provocada por Neopestalotiopsis en hojas de eucalipto, las lesiones son mas severas cuando la interacción del patógeno y la plantas se exponen a periodos prolongados de humedad (^{Belisario et al., 2019}). Según lo reportado por ^{Maharachchikumbura et al. (2011}) la incidencia y la severidad están asociadas al grosor de la lámina foliar y a la etapa de maduración de las hojas ya que las hifas penetran en los espacios de las células de las hojas cuando se encuentran en estado maduro por lo que, la susceptibilidad de éstas, también depende del grosor de la cutícula y de la producción de fitotoxinas como pestalopironas, hidroxipestalopironas y pestalocidos. Es importante señalar que, aunque se haya registrado una incidencia mínima de 12% y severidad del 25% las palmas no pueden ser comercializadas, ya que la parte comercial de la palma camedor son sus hojas y con el mínimo daño que presenten, no cumplen con los estándares de calidad establecidos por el mercado según lo menciona ^{De los Santos (2005}), en el informe de mercado de la palma camedor en México.

Figura 4 Incidencia y severidad (área bajo la curva del progreso de la enfermedad) de la mancha foliar provocada por Neopestalotiopsis sp. en plantaciones comerciales de palma camedor de ocho años de edad en el año 2021. 

En cuanto al comportamiento de la enfermedad ocasionada por Colletotrichum karstii en el mes de junio se presentó una incidencia de 13% (ABCPE= 793) que corresponde a una estación de calor e inicio de las lluvias en la región, mientras que el valor más alto se registró en el mes de diciembre con 37% (ABCPE= 2257), época que se presentan temperaturas frescas y alta humedad relativa (Figura 5). Con respecto a la severidad la enfermedad tuvo un comportamiento similar al de incidencia donde el valor más bajo se registró en junio con 35% (ABCPE= 2135), y en agosto a octubre donde la temperatura es más fresca con alta humedad relativa por las lluvias torrenciales se presentó una severidad de 65% (ABCPE= 4030) y 75% (ABCPE= 4575) respectivamente (Figura 5). En este sentido, los factores ambientales son importantes para la diseminación y progreso de la enfermedad, principalmente humedad relativa y precipitación juegan un papel en la epidemiología de Colletotrichum karstii en huertos de cítricos (^{Mayorking et al., 2019}). Estudios realizados por ^{Velho et al. (2014}) mencionan que la incidencia y severidad provocada por este patógeno puede defoliar los árboles de manzana y se ve favorecido por la alta humedad y la temperatura. Asimismo, se ha reportado a Colletotrichum y Pestalotiopsis como hongos potenciales, agentes causales de manchas foliares en palma donde la enfermedad es diseminada por esporas fácilmente dispersada por el viento y la lluvia (^{Tariq et al., 2015}).

Figura 5 Incidencia y severidad (área bajo la curva del progreso de la enfermedad) de antracnosis provocada por Colletotrichum karstii en plantaciones comerciales de palma camedor de ocho años de edad en el año 2021. 

Conclusiones

De acuerdo con la caracterización morfológica, molecular y las pruebas de patogenicidad, se concluye que Neopestalotiopsis sp. es el agente causal de las manchas foliares y Colletotrichum karstii responsable de la enfermedad antracnosis en palma camedor. El progreso de la incidencia y severidad de estas enfermedades son dependientes de los factores de humedad relativa ocasionada por las lluvias y manejo agronómico, esto reduce la calidad y producción de palma, por lo cual, este es el primer reporte en México de estos patógenos asociados al cultivo de palma camedor (Chamaedorea quezalteca).