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Revista mexicana de fitopatología
versão On-line ISSN 2007-8080versão impressa ISSN 0185-3309
Rev. mex. fitopatol vol.41 no.2 Texcoco Mai. 2023 Epub 11-Ago-2023
https://doi.org/10.18781/r.mex.fit.2208-2
Articles
Bacterias antagonistas contra Fusarium spp. aisladas de esclerocios de Claviceps gigantea en maíz (Zea mays)
1 Postgrado en Fitopatología, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Texcoco, Estado de México, CP 56230;
2 Universidad Autónoma del Estado de México, Campus El Cerrillo carretera Toluca-Ixtlahuaca km. 15.5, Piedras Blancas 50200, Toluca de Lerdo, México.
Los esclerocios de algunos hongos albergan bacterias nativas para el control biológico de hongos fitopatógenos. Los objetivos de esta investigación fueron: i) explorar poblaciones bacterianas asociadas a esclerocios de Claviceps gigantea en maíces de seis localidades del Estado de México, ii) evaluar el antagonismo in vitro de estas poblaciones bacterianas contra tres especies de Fusarium fitopatógenos de maíz, iii) identificar molecularmente los antagonistas más eficientes y caracterizar la producción de metabolitos in vitro. Poblaciones bacterianas en los esclerocios se calcularon por conteo directo en placa; el antagonismo in vitro contra Fusarium graminearum, F. sublgutinans y F. verticillioides se evaluó por confrontación en medio Waksman agar. Las bacterias antagonistas se identificaron por secuenciación parcial del gen 16S rRNA y se evaluaron in vitro para la producción de ácido indol-3-acético, sideróforos, actividad lipolítica, proteolítica y solubilización de fosfato mineral. La densidad bacteriana estuvo entre 2.023 a 2.397 Log10UFC g-1 de esclerocio. Veintidos cepas mostraron antagonismo in vitro contra al menos una especie de Fusarium. Se identificaron como miembros de los géneros Bacillus, Delftia, Micromonospora, Pseudomonas, Sphingobacterium, Staphylococcus y Stenotrophomonas. Los 22 antagonistas mostraron in vitro actividad lipolítica, proteolítica, produjeron sideróforos y solubilizaron fosfato; únicamente 12 (55%) produjeron ácido indol-3-acético. Las cepas Bacillus subtilis (BA1), Pseudomonas syringae (BA2) y Bacillus amyloliquefaciens (BA18) fueron antagonistas contra las tres especies de Fusarium y produjeron todos los metabolitos evaluados.
Palabras clave: Pudrición de mazorca; Bacillus; Pseudomonas; inhibición; metabolitos
Fungal sclerotia house native bacterial populations of interest for biological control of plant pathogenic fungi. The objectives of this research were: i) to explore the bacterial populations associated with Claviceps gigantea sclerotia in maize from six locations in the State of Mexico, ii) to evaluate the in vitro antagonism of these bacterial populations against three species of Fusarium phytopathogens of maize, iii) to molecularly identify the more efficient antagonists and characterize the in vitro production of metabolites. Bacterial populations in the sclerotia were calculated by direct plate count; in vitro antagonism against Fusarium graminearum, F. sublgutinans, and F. verticillioides was evaluated by confrontation in Waksman agar medium. Antagonistic bacteria were identified by partial sequencing of 16S rRNA gene and evaluated in vitro for the production of indole-3 acetic acid, siderophores, lipolytic and proteolytic activity, and mineral phosphate solubilization. The bacterial density ranged from 2.023 to 2.397 Log10UFC g-1 of sclerotia. Twenty-two strains showed in vitro antagonism against at least one Fusarium species and were identified as members of the genera Bacillus, Delftia, Micromonospora, Pseudomonas, Sphingobacterium, Staphylococcus, and Stenotrophomonas. The 22 antagonists showed in vitro lipolytic, proteolytic, siderophore-producing and phosphate-solubilizing activity; only 12 (55%) produced indole-3-acetic acid. Bacillus subtilis (BA1), Pseudomonas syringae (BA2), and Bacillus amyloliquefaciens (BA18) strains were antagonists against the three Fusarium species and produced all the metabolites evaluated.
Key words: Ear rot; Bacillus; Pseudomonas; inhibition; metabolites
El maíz (Zea mays) es el cereal más producido en el mundo, seguido de trigo y arroz (CIMMYT, 2019). México es el centro de origen del maíz (Matsuoka et al., 2002), además de ser el cultivo con la mayor superficie anual sembrada y consumo per cápita (García-López y Giraldo, 2021; Padrón et al., 2013). En México se estima que la producción y calidad de grano de este cultivo es afectado por diversas enfermedades fúngicas, destacando las enfermedades de pudrición de la mazorca (Moreno-Limón et al., 2011).
El hongo Fusarium causa pudriciones de mazorca que representa una limitante en la producción e inocuidad del maíz a nivel mundial. Se consigna que la mayoría de los híbridos de maíz cultivados en el mundo son susceptibles a más de 10 especies de Fusarium que causan pudrición de la mazorca (Mesterhazy et al., 2012). La mayoría de estas especies de Fusarium producen micotoxinas que afectan la salud no solo de animales sino también de los seres humanos (Holf, 2020; Mielniczuk y Skwaryło-Bednarz, 2020). En México, se reporta a F. verticillioides como la especie de mayor distribución y más importante por causar pudriciones en mazorca en los estados de Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Puebla y Nuevo León. También se han reportado a F. graminearum y F. subglutinans causando pudriciones en mazorca en los estados de México, Michoacán y Yucatán (Zenteno-Zevada, 1963).
El biocontrol de enfermedades en plantas con microorganismos antagonistas es una estrategia útil para aminorar el uso de plaguicidas en la agricultura y disminuir costos de producción e impacto ambiental (Dimkić et al., 2022; Guzmán-Guzmán y Santoyo 2022; Luo et al., 2022; Singh et al., 2022). Investigaciones previas han demostrado que los exudados en los esclerocios de hongos fitopatógenos como Sclerotium rolfsii y Sclerotinia sclerotiorum estimulan el crecimiento de poblaciones bacterianas específicas en el mismo agroecosistema con mayor actividad antifúngica hacia estos mismos hongos, que cepas bacterianas aisladas de otros nichos ecológicos (Abdullah et al., 2008; Coley-Smith y Dickenson, 1971; Gilbert y Linderman, 1971; Hou et al., 2006). Las poblaciones bacterianas que coexisten en hábitats específicos con escasos nutrientes, como es el caso de los esclerocios, promueven la producción de metabolitos que incrementan su capacidad de competencia contra otros microorganismos; por lo tanto, se considera que los esclerocios de hongos son potenciales reservorios naturales de antagonistas eficientes para el control biológico de fitopatógenos (Hou et al., 2006; Zachow et al., 2011).
El ascomiceto Claviceps gigantea causa la enfermedad “diente de caballo” así llamada por la forma de los esclerocios. Este hongo produce alcaloides principalmente ergolina, festuclavina, dihydroelymoclavina, chanoclavina y elimoclavina (Agurell et al., 1963; Solano-Báez et al., 2018) que también son tóxicos para animales y seres humanos (Mielniczuk y Skwaryło-Bednarz, 2020; Bragg et al., 2017; Hof, 2020). C. gigantea es un hongo endémico, geográficamente limitado a localidades en México con altitudes mayores a los 1800 msnm y humedad relativa ≥ 60% (Fucikovsky y Moreno, 1976; Fuentes et al., 1964; Ullstrup, 1973). En los valles altos de México (>2 000 msnm), el maíz se cultiva en ambientes con climas templados en donde las pudriciones de mazorca causadas por Fusarium spp. son comunes en infecciones simultáneas con C. gigantea causando pérdidas de hasta el 100% (CIMMYT, 2004). En el presente estudio, se infiere que los esclerocios de C. gigantea albergan poblaciones bacterianas con antagonismo eficiente contra especies de Fusarium que causan la pudrición de mazorca de maíz en México. Los objetivos de esta investigación fueron: i) explorar las poblaciones bacterianas asociadas a esclerocios de C. gigantea en el Estado de México, ii) evaluar el antagonismo in vitro de estas poblaciones bacterianas contra Fusarium graminearum, F. subglutinans y F. verticillioides, iii) identificar molecularmente los antagonistas más eficientes y caracterizar la producción in vitro de metabolitos de los antagonistas.
Materiales y métodos
Colecta de esclerocios de Claviceps gigantea
Los esclerocios de C. gigantea se colectaron en seis localidades del Estado de México con historial severo en condiciones naturales de las enfermedades diente de caballo y pudriciones de mazorca causados por Fusarium spp. (Cuadro 1; Figura 1). Los esclerocios de cada localidad se colectaron de mazorcas infectadas con C. gigantea sin síntomas de pudrición por Fusarium spp.
Cuadro 1 Colecta de esclerocios de C. gigantea en localidades del Estado de México.
| zLocalidad | Latitud (N) | Longitud (O) | Altitud (msnm) |
|---|---|---|---|
| Almoloya de Juárez | 19° 14´ 10” | 90° 42´ 07” | 2600 |
| Atlacomulco | 19° 43´ 37” | 99° 42´ 12” | 2700 |
| Calimaya | 19° 10´ 25” | 99° 32´ 12” | 2680 |
| Mina México | 19° 40´ 35” | 99° 40´ 10” | 2580 |
| Toluca | 18° 59´ 00” | 99° 40´ 58” | 2600 |
| Villa Victoria | 19° 26´ 00” | 100° 00´ 00” | 2570 |
zTamaño de muestra de 10 esclerocios por localidad estimado con el modelo de Cochran (1982).
Aislamiento de bacterias de esclerocios de Claviceps gigantea
Se colectaron 10 esclerocios de C. gigantea en cada localidad. El tamaño de muestra del número de esclerocios se calculó con el modelo descrito por Cochran (1982). Los esclerocios (n=10) de cada localidad se molieron por separado en un mortero estéril; de aquí, se utilizó 1 g de esclerocios molidos diluído en 100 mL de agua destilada estéril para realizar diluciones seriadas hasta 10-4; de cada dilución se sembraron 100 µL en placas Petri con medio de cultivo R2A (Difco) con tres repeticiones y se incubaron a 28 °C por 24 h. Del crecimiento bacteriano se cuantificó el número de colonias por el método de conteo directo en placa. La densidad microbiana se expresó en Log10 UFC g-1 de esclerocio (Peng et al., 2009). Entre las seis localidades muestreadas, se seleccionaron 129 aislados bacterianos asociados a los esclerocios con diferente morfología de la colonia observada en un microscopio estereoscópico (American Optical AO) para el estudio posterior de antagonismo in vitro.
Antagonismo in vitro contra Fusarium spp.
Se evaluó el antagonismo in vitro de 129 cepas bacterianas contra Fusarium graminearum, F. subglutinans y F. verticillioides que causan pudrición de mazorca en las localidades muestreadas; la patogenicidad de estas cepas se evidenció experimentalmente en plántulas de tres poblaciones nativas de maíz en el Estado de México por inoculación del hongo en sustrato y se idenficaron molecularmente por amplificación de las regiones internas ITS de los genes rRNA 18S-5.8S y 5.8S-28S las cuales fueron donadas por la Dra. Dolores Briones Reyes del Postgrado de Recursos Genéticos y Productividad, del Colegio de Postgraduados. El antagonismo in vitro se evaluó por confrontación dual en placas Petri cuadradas (120 x 120 mm) con medio de cultivo Waksman agar seleccionado entre los medios B de King, R2A, agar nutritivo y papa-dextrosa agar por ser el que permitió el óptimo crecimiento tanto de Fusarium spp. como de los aislados bacterianos. Inicialmente, las cepas de Fusarium spp. se inocularon por extensión con un asa L-digralsky sobre la superficie del medio de cultivo con 300 µL de una suspensión acuosa con 1.8 x 104 conidios mL-1 cuantificados en una Cámara Neubauer de cada especie con cinco días a 28 oC en medio Waksman agar (1 L) (agar 20 g, glucosa 10 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4 0.5 g, peptona 5.0 g, pH 6.8). Las placas de Petri inoculadas se mantuvieron a temperatura ambiente por 60 min; en seguida, las bacterias (n=129) se inocularon con un inoculador multipunto (Boekel®, microplate replicator 96 puntos) y se incubaron a 28 °C por 7 días; de aquí, se seleccionaron las cepas bacterianas que evidenciaron antagonismo (halo de inhibición del crecimiento fúngico) contra una o más especies de Fusarium. Posteriormente, en otro ensayo las cepas bacterianas antagonistas se sembraron individualmente por punción de masa bacteriana con un palillo estéril bajo las mismas condiciones experiementales del ensayo anterior. Se realizaron observaciones diarias y se seleccionaron únicamente las cepas bacterianas que mostraron antagonismo evidenciado por la formación de un halo de inhibición ≥ 5mm del crecimiento del micelio contra una, dos o las tres especies de Fusarium evaluadas. El ensayo se repitió tres veces. Los testigos consistieron en placas de Petri con crecimiento de las especies de Fusarium en ausencia de las bacterias antagonistas.
Detección cualitativa de la producción de metabolitos
Las bacterias antagonsitas se caracterizaron cualitativamente en cuanto a su capacidad para producir metabolitos in vitro como el ácido indol-3-acético en el medio de cultivo caldo soja triptona (TSB); se consideraron positivas las cepas bacterianas que produjeron una coloración rojiza en el medio (Frey-Klett et al., 2005) y sideróforos en el medio universal cromo azurol S (CAS) considerando positivas las cepas bacterianas que evidenciaron un halo amarillo alrededor de la colonia (Schwyn y Neilands, 1987); actividad lipolítica en el medio agar nutritivo suplementado con Tween 80 y proteolítica en el medio TSB suplementado con leche descremada, considerando positivas las cepas bacterianas que evidenciaron un halo opaco y claro alrededor de la colonia respectivamenmte (Hantsis-Zacharov y Halpern, 2007), y solubilización de fosfato mineral en el medio TCP, considerando positivas las cepas bacterianas que evidenciaron un halo opaco alrededor de la colonia (El-Yazeid et al., 2007). Todas las evaluaciones se hicieron por triplicado.
Identificación molecular de las bacterias antagonistas
El ADN de los antagonistas potenciales se obtuvo de colonias individuales con 72 h de crecimiento a 28 °C en medio Waksman agar con el kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.A.) siguiendo el protocolo del fabricante. La amplificación parcial del gen 16S rRNA se realizó con los iniciadores 8F (5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’) y 1492R (3’ GGTTACCTTGTTACGACTT 5’) y las condiciones de PCR descritas por Baker et al. (2003). Los productos amplificados se secuenciaron (secuenciación Sanger) en Macrogen Inc. (Seul, Korea) (https://www.macrogen.com); las secuencias se compararon en el banco de genes (GenBank) del Centro Internacional para la Información en Biotecnología (NCBI por sus siglas en inglés) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) empleando el algoritmo Blastn (Basic Local Aligment Search Tool) 2.2.29+ (Altschul et al., 1990).
Resultados
Densidad de poblaciones bacterianas en esclerocios de Claviceps gigantea
Se observó crecimiento bacteriano en medio de cultivo R2A de los esclercios provenientes de todas las localidaes muestreadas. Del crecimiento bacteriano se cuantificó el número de colonias por el método de conteo directo en placa y la densidad bacteriana en esclerocios de C. gigantea fue diferente entre las seis localidades muestreadas en rangos desde 2.023 hasta 2.397 Log10UFC g-1 de esclerocio (Cuadro 2). La mayor densidad bacteriana se registró en los lotes de Atlacomulco (2.397) y la menor en Villa Victoria (2.023) Log10UFC g-1 de esclerocio respectivamente. Lo anterior sugiere que existen poblaciones bacterianas asocidas a los exudados de los esclerocios de C. gigantea; sin embargo, es necesario profundizar más en investigaciones que evidencien los factores que influencian la densidad y estructura bacteriana en este nicho ecológico.
Cuadro 2 Densidad bacteriana (Log10UFC g-1) en esclerocios de C. gigantea por localidad de muestreo.
| Localidad | Número de colonias | Log10UFC g-1 de esclerocio |
|---|---|---|
| Almoloya de Juárez | z204.1 | 2.309 |
| Atlacomulco | 249.9 | 2.397 |
| Calimaya | 188.8 | 2.276 |
| Mina México | 200.4 | 2.301 |
| Toluca | 133.6 | 2.125 |
| Villa Victoria | 105.6 | 2.023 |
Z Promedio del número de colonias aisladas de 10 esclerocios de C. gigantea por localidad muesetreada mediante conteo directo en placa en medio R2A con tres repeticiones.
Antagonismo in vitro contra Fusarium spp.
De 129 cepas bacterianas morfológicamente diferentes aisladas de esclerocios, 22 (17%) se identificaron por su antagonismo in vitro (halo de inhibición del crecimiento fúngico ≥ 5 mm) contra una o más especies de Fusarium (Cuadro 3). Entre estas, 13 cepas bacterianas (59%) fueron aisladas de la localidad de Atlacomulco, y tres cepas (13%) en cada una de las localidaes Calimaya, Mina y Toluca. Entre los antagonistas (n=22), 10 (45%) cepas fueron antagonistas a F. verticilliodes, 14 (63%) a F. subglutinans y 17 (81%) a F. graminearum. Entre las bacterias antagonistas destacaron las cepas Bacillus subtilis (BA1), Pseudomonas syringae (BA2) y Bacillus amyloliquefaciens (BA18) las cuales fueron antagonistas contra las tres especies de Fusarium evaluados. Estas tres cepas tuvieron origen en la Localidad de Atlacomulco (Cuadro 3).
Cuadro 3 Identificación molecular, origen, antagonismo contra Fusarium spp. y producción de metabolitos de 22 cepas antagonistas aisladas de esclerocios de Claviceps gigantea.
| Antagonismo in vitro | Producción de metabolitos in vitro | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ID cepa | Localidad | Identificación por secuenciación parcial del gen 16S rRNA | No. acceso de secuencias tipo de la especie (NCBI) | % de identidad | zFg | Fs | Fv | AIA | LIP | PRO | SID | SFM |
| BA1 | Atlacomulco | Bacillus subtilis | KF021537.1 | 99.39 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| BA2 | Atlacomulco | Pseudomonas syringae | NR_043716.1 | 99.28 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| BA3 | Atlacomulco | Delftia lacustris | KF054933.1 | 99.46 | + | - | + | - | + | + | + | + |
| BA4 | Mina | Stenotrophomonas sp. | AM913974.1 | 99.40 | + | - | + | - | + | + | + | + |
| BA5 | Calimaya | Delftia acidovorans | EF564190.1 | 99.38 | + | - | + | - | + | + | + | + |
| BA6 | Calimaya | Sphingobacterium sp. | KF777439.1 | 99.41 | + | - | - | - | + | + | + | + |
| BA7 | Atlacomulco | Pseudomonas geniculata | JX042457.1 | 99.44 | + | - | - | - | + | + | + | + |
| BA8 | Mina | Micromonospora sp. | KY015111.1 | 99.44 | - | + | - | - | + | + | + | + |
| BA9 | Mina | Stenotrophomonas maltophilia | FJ859699.1 | 99.37 | - | + | - | - | + | + | + | + |
| BA10 | Calimaya | Staphylococcus aureus | LN929738.1 | 99.49 | + | + | - | - | + | + | + | + |
| BA11 | Atlacomulco | Pseudomonas putida | KC582298.1 | 99.05 | + | + | - | + | + | + | + | + |
| BA12 | Toluca | Bacillus sp. | HM032893.1 | 99.48 | + | + | - | + | + | + | + | + |
| BA13 | Atlacomulco | Pseudomonas fluorescens | GU198115.1 | 99.47 | + | + | - | + | + | + | + | + |
| BA14 | Atlacomulco | Bacillus subtilis | KF527828.1 | 99.35 | + | + | - | - | + | + | + | + |
| BA15 | Atlacomulco | Bacillus amyloliquefaciens | KC494392.1 | 99.02 | + | + | - | + | + | + | + | + |
| BA16 | Atlacomulco | Pseudomonas putida | KC582298.1 | 99.16 | + | + | - | + | + | + | + | + |
| BA17 | Atlacomulco | Pseudomonas fluorescens | GU198113.1 | 99.40 | - | + | - | + | + | + | + | + |
| BA18 | Atlacomulco | Bacillus amyloliquefaciens | MH781489.1 | 99.02 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| BA19 | Atlacomulco | Pseudomonas sp. | DQ991143.2 | 99.05 | - | + | + | - | + | + | + | + |
| BA20 | Toluca | Bacillus amyloliquefaciens | MF765339.1 | 99.48 | + | - | + | + | + | + | + | + |
| BA21 | Atlacomulco | Pseudomonas putida | JX120503.1 | 99.15 | + | - | + | + | + | + | + | + |
| BA22 | Toluca | Bacillus sp. | MF510169.1 | 99.48 | - | - | + | + | + | + | + | + |
zFg= Fusarium graminearum; Fs=Fusarium subglutinans; Fv=Fusarium verticillioides; AIA = producción de ácido indol-3-acético; LIP= actividad lipolítica; PRO= actividad proteolítica; SID= producción de sideróforos; SFM= solubilización de fosfato mineral.
Identificación molecular de antagonistas
La amplificación parcial del gen 16S rRNA permitió la identificación de las 22 cepas antagonistas entre 99.02 y 99.49% de similitud de acuerdo al alineamiento en el banco de genes del NCBI (Cuadro 3). Las cepas antagonistas pertenecieron a los géneros Pseudomonas (36.3%), Bacillus (31.8%), Delftia (9.09%), Stenotrophomonas (9.09%), Micromonospora (4.5%), Sphingobacterium (4.5%) y Staphylococcus (4.5%). Entre las especies de Pseudomonas, se identificaron a P. putida (37.5%), P. fluorescens (25%), P. geniculata y P. syringae (12.5%); entre las especies de Bacillus a B. amyloliquefaciens (57.1%) y B. subtilis (28.5%). El mayor número de antagonistas (n=13) se aisló de la localidad de Atlacomulco (59%) y el resto en igual proporción (n= 3) (14.3%) de las localidades de Calimaya, Mina y Toluca respectivamente (Cuadro 2). Las 22 cepas antagonistas se distribuyeron taxonómicamente en cuatro Phyla y seis órdenes. Se registró mayor abundancia de los géneros Bacillus y Pseudomonas en los Phyla Firmicutes (Gram positivas) y Proteobacteria (Gram negativas) y en los órdenes Bacillales y Pseudomonadales respectivamente. La menor abundancia en los géneros Micromonospora, Sphingobacterium y Staphylococcus, en los Phyla Firmicutes (Gram positivas) Bacteroidetes (Gram negativas), en los órdenes Actinomycetales, Sphingobacteriales y Bacillales respectivamente (Cuadro 4).
Cuadro 4 Distribución taxonómica de 22 cepas bacterianas antagonistas in vitro contra Fusarium spp. aisladas de esclerocios de C. gigantea.
| Phylum | Clase | Orden | Familia | Género | Frecuencia % |
|---|---|---|---|---|---|
| Proteobacteria | Gammaproteobacteria | Pseudomonadales | Pseudomonadaceae | Pseudomonas | 36.3 |
| Firmicutes | Bacilli | Bacillales | Bacillaceae | Bacillus | 31.8 |
| Proteobacteria | Beta Proteobacteria | Burkholderiales | Comamonadaceae | Delftia | 9.1 |
| Proteobacteria | Gammaproteobacteria | Xanthomonadales | Xanthomonadaceae | Stenotrophomonas | 9.1 |
| Bacteroidetes | Sphingobacteria | Sphingobacteriales | Sphingobacteriaceae | Sphingobacterium | 4.5 |
| Actinobacteria | Actinobacteria | Actinomycetales | Micromonosporaceae | Micromonospora | 4.5 |
| Firmicutes | Bacilli | Bacillales | Staphylococcaceae | Staphylococcus | 4.5 |
Producción cualitatitava in vitro de metabolitos
Los 22 antagonistas mostraron in vitro actividad lipolítica, proteolítica, produjeron sideróforos y solubilizaron fosfato mineral; sin embargo, solamente 12 (55%) produjeron ácido indol-3-acético. Únicamente las cepas Bacillus subtilis (BA1), Pseudomonas syringae (BA2) y Bacillus amyloliquefaciens (BA18) fueron antagonistas contra las tres especies de Fusarium y produjeron todos los metabolitos evaluados (Figura 2, Cuadro 3).
Figura 2 Antagonismo in vitro. A) esclerocio de C. gigantea, B) crecimiento bacteriano a partir de 1 g de esclerocio en medio R2A, C) antagonismo in vitro de bacterias en medio de cultivo Waksman agar inoculadas con un inoculador multipunto (Boekel®, microplate replicator 96 puntos) contra Fusarium spp. D) selección de cepas bacterianas antagonistas evidenciando halos de inhibición ≥5 mm del crecimiento fúngico de Fusarium spp. Producción in vitro de metabolitos por antagonistas. E) producción de ácido indol-3-acético, F) producción de sideróforos, G) actividad proteolítica, H) solubilización de fósfato mineral, I) actividad lipolítica. Se consideraron positivas las cepas que evidenciaron coloración rojiza del medio, halo amarillo, claro y opaco alrededor de la colonia respectivamente.
Discusión
En esta investigación se estimó la densidad bacteriana en esclerocios de C. gigantea y se evaluó su antagonismo in vitro contra tres especies de Fusarium causantes de pudrición de mazorca en maíz. Los resultados mostraron diferente densidad bacteriana asociada a esclerocios de C. gigantea en las diferentes localidades muestreadas; la mayor densidad bacteriana se registró en los lotes de Atlacomulco (2.397) y la menor en Villa Victoria (2.023) Log10UFC g-1 de esclerocio respectivamente. Lo anterior puede deberse a la utilización de productos y/o residuos agroquímicos utilizados como parte del manejo agronómico del cultivo que pudieron afectar la diversidad y densidad de microorganismos asociados al cultivo del maíz (FAO, 2010), lo cual sugiere la necesidad de conducir estudios sobre los residuos de agroquímicos utilizados en los sitios muestreados y su efecto en la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas en los esclerocios. Así mismo, se ha demostrado que la densidad bacteriana esta estrechamente relacionada con las fuentes de carbono contenidas en los exudados de esclerocios (Coley-Smith y Dickenson, 1971) por lo que investigaciones futuras deberán enfocarse en determinar las fuentes de carbono presentes en los exudados de los esclerocios de C. gigantea y en que cantidad se encuentran. La presencia de bacterias asociadas a esclerocios se ha evidenciado en otras investigaciones. Coley-Smith y Dickenson (1971) evidenciaron que los esclerocios del hongo Sclerotium cepivorum, favorecen el crecimiento de bacterias específicas debido a los exudados que contienen fuentes de carbono como etanol, trealosa, glucosa y manitol y que este microambiente constituye un nicho ecológico específico. Gilbert y Linderman (1971) reportaron cambios cualitativos e incremento de la actividad microbiana en el suelo cercano a los esclerocios de Sclerotium rolfsii atribuido a los exudados en los esclerocios de este patógeno. Estos autores denominaron “micosfera” a la porción de suelo influenciado por los esclerocios y demostraron que albergan poblaciones bacterianas con mayor representatividad de especies antagónicas contra S. rolfsii que las obtenidas de otros nichos ecológicos.
En esta investigación, de 129 cepas bacterianas aisladas de esclerocios de las diferentes localidades muestreadas, 22 (17%) de ellas se identificaron por su antagonismo in vitro (halo de inhibición del crecimiento fúngico ≥ 5 mm) contra una o más especies de Fusarium que causan pudrición de mazorca de maíz. Mediante la secuenciación parcial del gen 16S rRNA, fue posible identificar a las 22 cepas bacterianas antagonistas pertenecientes a los géneros Bacillus, Delftia, Micromonospora, Pseudomonas, Sphingobacterium, Staphylococcus y Stenotrophomonas
Los antagonistas más abundantes en esclerocios de C. gigantea pertenecieron a los géneros Pseudomonas (Pseudomonadaceae) (36.3%) y Bacillus (Bacillaceae) (31.8%). En ambos géneros se han dilucidado sus mecanismos para el biocontrol de fitopatógenos mediado por antibiosis, competencia por nutrientes y espacios, promoción del crecimiento e inducción de resistencia en plantas (Cui et al., 2019; Dimkić et al., 2022; Fira et al., 2018; Guzmán-Guzmán y Santoyo, 2022; Luo et al., 2022; Singh et al., 2022).
Los resultados de esta investigación coinciden con los obtenidos en otras investigaciones en donde destacan la mayor abundancia de ambos géneros colonizando esclerocios de Rhizoctonia solani (Zachow et al., 2011) y Sclerotium cepivorum (Backhouse y Stewart, 1989; Utkhede y Rahe, 1980) evidenciando fuerte antagonismo contra estos patógenos, además del género Stenetrophomonas el cual también se identificó en esta investigación. Wong y Hughes (1986) demostraron que el 80% de los antagonistas aislados de muestras de suelo y esclerocios de S. cepivorum fueron especies del género Bacillus. Este género incluye un grupo de bacterias Gram positivas con alta heterogeneidad fenotípica y genética considerados entre los colonizadores más comunes en diversos nichos ecológicos (Abriouel et al., 2011). En este estudio, la mayoría de las cepas identificadas fueron antagonistas in vitro contra una o dos especies de Fusarium; sin embrago, las cepas Bacillus amyloliquefaciens (BA18), B. subtilis (BA1) y Pseudomonas syringae (BA2) fueron antagonistas contra las tres especies de Fusarium evaluados (F. graminearum, F. subglutinas y F. verticillioides) causantes de pudrición de mazorca de maíz.
En otras investigaciones, B. amyloliquefaciens se ha reportado como antagonista con alto potencial para el biocontrol de otras especies de Fusarium en espinaca (Spinacia oleracea) (Zhao et al., 2014), banano (Musa sp.) (Tian et al., 2021), tomate (Solanum lycopersicum) (Elanchezhiyan et al., 2018; Proca et al., 2020) y trigo (Triticum sp.) (Ursan et al., 2019). Algunas cepas de B. amyloliquefaciens se han reportado como antagonistas y eficientes agentes de biocontrol de F. graminearum (de Ángel et al., 2021; Gu et al., 2017; Liu et al., 2019) y F. verticillioides (Xu et al., 2021).
La prevalencia y antagonismo de B. subtilis aislado de esclerocios de C. gigantea, coincide con otros estudios. Utkhede y Rahe (1980) demostraron que existe mayor prevalencia de B. subtilis en esclerocios de S. cepivorum colectados de varias partes del mundo y que la mayoría de estas cepas protegieron significativamente a la cebolla (Allium cepa) de la pudrición blanca causado por este patógeno cuando se inocularon en semilla al momento de la siembra. Estos autores atribuyeron la prevalencia de B. subtilis a los carbohidratos específicos contenidos en los exudados de los esclerocios de S. cepivorum. También, cepas de B. subtilis han mostrado antagonismo y eficiente biocontrol contra F. graminearum y F. verticillioides en trigo y maíz respectivamente (Cavaglieri et al., 2005; Guimarães et al., 2021; Wang et al., 2020; Yu et al., 2021).
El género Pseudomonas incluye especies Gram negativas las cuales han sido ampliamente estudiadas como una opción en el control biológico de fitopatógenos y promoción del crecimiento de plantas (Dimkić et al., 2022; Guzmán-Guzmán y Santoyo 2022; Singh et al., 2022). Pseudomonas syringae identificada en este estudio como antagonista contra las tres especies de Fusarium pertenece al complejo de especies de P. fluorescens y se ha descrito como una especie importante como agente de biocontrol junto con P. aeruginosa, P. aureofaciens, P. chlororaphis P. fluorescens y P. putida y (Panpatte et al., 2016). Pseudomonas syringae es un complejo de especies que incluye cepas fitopatógenas en un amplio rango de plantas hospedantes (Baltrus et al., 2017); sin embargo, se han identificado cepas de P. syringae no fitopatógenas cuyo genoma alberga un extenso grupo de genes relacionados con el biocontrol de fitopatógenos, promoción de crecimiento e inducción de resistencia en plantas (Passera et al., 2019). Yu et al. (2017), demostraron que la cepa Pseudomonas syringaeBAF.1 inhibió completamente la germinación de conidios y afectó la estructura del micelio de Fusarium oxysporum proponiéndolo como un promisorio agente de biocontrol contra este patógeno.
En esta investigación, las cepas Bacillus subtilis (BA1), Pseudomonas syringae (BA2) y Bacillus amyloliquefaciens (BA18) fueron antagonistas contra las tres especies de Fusarium y produjeron in vitro todos los metabolitos evaluados (producción de ácido indol-3-acético; enzimas lipolíticas y proteolíticas, sideróforos y solubilización de fosfato mineral) (Cuadro 3). Se ha evidenciado que la producción de estos metabolitos juega un papel importante en el biocontrol de hongos fitopatógenos y promoción del crecimiento de plantas (Sagar et al., 2022). Las enzimas proteolíticas y lipolíticas producidas por especies de Bacillus y Pseudomonas causan lisis celular de hongos; los sideróforos son compuestos antimicrobianos que facilitan la movilización de hierro y solubilización de nutrientes no disponibles por las plantas (Admassie et al., 2022). La producción de reguladores del crecimiento vegetal como el ácido indol-3-acético estimula el desarrollo del sistema radical de las plantas e inducen resistencia a patógenos; en tanto que la solubilización de minerales como el fósforo promueve el desarrollo de las plantas, inducen resistencia a patógenos y mejoran la absorción de agua y otros nutrientes (Mahapatra et al., 2022; Sagar et al., 2022).
Se ha sugerido que en especies de Bacillus y Pseudomonas, la supresión de enfermedades, promoción de crecimiento e inducción de resistencia en plantas son resultado de su capacidad para producir una amplia gama de metabolitos secundarios codificados por diversos grupos de genes (Andrić et al., 2020; Dimkić et al., 2022; Luo et al., 2022); sin embargo, se consigna que la proporción de estos genes en el genoma involucrada en la síntesis de compuestos antimicrobianos y otros metabolitos secundarios bioactivos dependen de la especie y la cepa (Devi et al., 2019), por lo que se sugiere profundizar en el conocimiento sobre las características del genoma de estas tres cepas antagonistas identificadas en esta investigación, previo al registro de las secuencias 16S rRNA en el GenBank del NCBI. Se ha demostrado que la inoculación de cepas de Bacillus y Pseudomonas spp. promueven el crecimiento e inducen la resistencia en plantas de maíz (Egamberdiyeva et al., 2007).
Especies del género Bacillus son promisorios agentes de control biológico debido a sus características genéticas, alta resistencia al calor y desecación por la formación de endosporas (Luo et al., 2022); se consideran cepas que no representan un riesgo a la salud humana por lo cual no hay restricciones para su uso como agentes de biocontrol de acuerdo con la Agencia de Protección Ambiental de EUA (Dimkić et al., 2022; Hou et al., 2006). Así mismo, formulaciones comerciales de P. syringae están aprobadas para el manejo de Fusarium spp. en postcosecha en EUA y Canadá (Al-Mughrabi et al., 2013). Por lo anterior, las cepas Bacillus subtilis (BA1), Pseudomonas syringae (BA2) y B. amyloliquefaciens (BA18) identificadas en esta investigación, aisladas de esclerocios de C. gigantea antagonistas in vitro contra tres especies de Fusarium causantes de pudrición en mazorca de maíz, multifuncionales en la producción de metabolitos secundarios, son un recurso biotecnológico importante para futuras investigaciones como agentes de biocontrol contra este patógeno en el cultivo de maíz en México.
Conclusiones
Los esclerocios de C. gigantea albergan diferente densidad de poblaciones bacterianas. En los esclerocios con origen en la localidad de Atlacomulco Estado de México hay mayor densidad bacteriana que en el resto de las localidades. Entre las poblaciones bacterianas que colonizan los esclerocios existen cepas antagonistas contra al menos una especie de Fusarium que causan pudrición de mazorca en maíz y producen diversos metabolitos posiblemente implicados con el antagonismo y promoción del crecimiento de plantas. De 22 cepas bacterianas antagonistas, la secuenciación parcial del gen 16S rRNA identificó a los géneros Bacillus y Pseudomonas como las bacterias antagonistas más abundantes en esclerocios de C. gigantea. Fusarium verticillioides es menos sensible que F. subglutinans y F. graminaerum al antagonismo in vitro de las cepas bacterianas aisladas de esclerocios de C. gigantea; Fusarium gramanieraum es la más sensible entre las tres especies de Fusarium evaluadas. Las cepas Bacillus subtilis (BA1), Pseudomonas syringae (BA2) y Bacillus amyloliquefaciens (BA18) son antagonistas in vitro eficientes contra las tres especies de Fusarium y una potencial alternativa para el biocontrol de estos patógenos en el cultivo de maíz en México.
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). A la Dra. Dolores Briones Reyes del Postgrado de Recursos Genéticos y Productividad del Colegio de Postgraduados campus Montecillo por la donación de las cepas de Fusarium spp. utilizadas en esta investigación.
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Recibido: 03 de Agosto de 2022; Aprobado: 25 de Marzo de 2023
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