La caña de azúcar (Saccharum officinarum) es uno de los principales cultivos industriales en México con una producción nacional de 5.7 millones de toneladas de azúcar. Los campos cañeros se encuentran distribuidos en siete regiones estratégicas; San Luis Potosí pertenece a la región Noroeste que cuenta con una producción de 1,156,265 t (CONADESUCA, 2021). En 2021, en el municipio de Tamasopo perteneciente a la Huasteca Potosina, se produjeron 653,028 t (^{SIAP, 2022}).

La marchitez de la caña de azúcar o pokkah boeng (PB) es una enfermedad grave que afecta el tallo, los síntomas iniciales se observan en hojas jóvenes que desarrollan zonas cloróticas en la base (^{Vishwakarma et al., 2013}). Si la infección queda limitada a las hojas la planta se recupera lentamente, en etapa avanzada y grave la enfermedad penetra el tallo a través de un punto de crecimiento causando pudrición superior, las hojas jóvenes mueren y se desarrollan en el tejido áreas necróticas asimétricas rojizas (^{Jeyakumar y Zhang, 2020}). Esta enfermedad produce pérdidas de 45.2 a 51.2% en la producción del cultivo y de 42.8 a 59.2% en el contenido de jugo de los tallos (^{Kumar et al., 2015}). La calidad del jugo se reduce (^{Viswanathan, 2020}).

Varias especies del género Fusarium como F. sacchari, F. verticillioides y F. proliferatum (^{Lin et al., 2014}; ^{Zhang y Jeyakumar, 2018}) han sido identificadas como el agente causal de la enfermedad de PB (^{Viswanathan, 2020}). Estas pueden crecer en una gran variedad de sustratos y tienen un eficiente mecanismo de diseminación que les permite distribuirse globalmente. Fusarium sacchari es el principal agente causante de PB en la India (^{Viswanathan et al., 2017}), de acuerdo con estudios de patogenicidad una vez que ingresa al hospedante causa daños severos al cultivo, su mecanismo de entrada al mismo no se ha estudiado en detalle (^{Viswanathan, 2020}).

Las raíces de las plantas de caña de azúcar se infectan en las primeras etapas de crecimiento del cultivo; sin embargo, se desconoce la forma de avance de F. sacchari desde las raíces hasta el tallo, probablemente los factores ambientales y de suelo juegan un papel vital en el desarrollo de la enfermedad en los tallos y la severidad con que se presenta (^{Viswanathan, 2020}). Las especies del género Fusarium inactivan sustancias tóxicas de defensa producidas por el hospedante, producen toxinas propias que aumentan su virulencia como eniatinas y ácido fusárico (^{Agrios, 2005}). En este trabajo se evaluó la sensibilidad in vitro de Fusarium sacchari aislado de caña de azúcar con síntomas de PB, a cinco fungicidas de diferentes grupos químicos y se determinó la concentración media efectiva (EC₅₀) para cada uno de los fungicidas.

En febrero y abril de 2019 con base en un muestreo en zigzag se colectaron plantas de caña de azúcar de 1 m de altura en etapa de maduración con síntomas de marchitez en nueve campos cañeros (cuatro plantas por campo) de Tamasopo (22° 09’ 41.0” N 99° 19’ 30.4” S) en la Huasteca Potosina. Las 36 muestras obtenidas fueron trasladas en bolsas de papel al Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León para su análisis. Fragmentos de tejido con síntomas de necrosis fueron desinfectados con NaClO al 2% por tres minutos, enjuagados tres veces con agua destilada estéril y secados en papel absorbente estéril. El tejido fue sembrado en cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA-Difco^®) que fueron incubadas a 25 ± 1 °C en oscuridad por siete días. Dos aislados representativos (HP1 y HP2) fueron seleccionados y transferidos a medio de cultivo PDA e incubados a 25 ± 1 °C en oscuridad hasta la formación de esporas. Suspensiones de conidios a concentración de 1 x 10³ fueron preparadas con agua destilada estéril para su siembra por estriado en cajas Petri con medio de cultivo PDA, y a partir de los conidios germinados los aislados se purificaron con la técnica de cultivo monospórico.

La caracterización morfológica de los aislados monospóricos de HP1 y HP2 se realizó por el color y pigmentación de las colonias, así como las características de los conidios, fiálides e hifas en montajes temporales en lactofenol observados a 40 y 100X en microscopio compuesto, de acuerdo con las características del género Fusarium (^{Leslie y Summerell, 2006}).

La patogenicidad de los aislados se determinó mediante la inoculación de una suspensión de conidios 1×10⁶ mL^-1 en tallos de plantas de caña de azúcar de las variedades My 55-14 y Mex 79-431 en etapa de cosecha, del tejido necrosado de los tallos inoculados se re-aisló el fitopatógeno en medio de cultivo PDA. Para la identificación molecular de ambos aislados se extrajo ADN de acuerdo con el protocolo de ^{Cenis (1992}) y se amplificaron y secuenciaron las regiones ITS (internal transcriber spacer) (^{White et al., 1990}) y TEF (translation elongation factor) (^{O’Donnell et al., 1998}; ^{Carbone y Kohn, 1999}) para su comparación con secuencias del GenBank y posterior depósito en el mismo.

El aislado monospórico de HP1 se utilizó para determinar la sensibilidad de F. sacchari a cinco fungicidas de diferentes grupos químicos. Concentraciones de 1, 10, 100 y 1000 µg mL^-1 de i.a. fueron evaluadas empleando la técnica de placa envenenada (^{Dahal y Shrestha, 2018}) bajo un diseño experimental completamente al azar con cinco repeticiones. Como testigo se utilizaron cinco cajas Petri con medio de cultivo PDA sin fungicida (0 µg mL^-1). Los fungicidas evaluados y grupo químico al que pertenecen fueron: azoxystrobin (estrobilurina, Bankit^®, Syngenta), difenoconazol (tiazoles, Score^®, Syngenta), hymexazol (isoxazoles, Tachigaren^®, Summit Agro), cyprodinil (anilino-pirimidinas, Switch^®, Syngenta) y tiabendazol (benzimidazoles, Tecto 60^®).

Discos de micelio de 7 mm de diámetro del aislado HP1 se sembraron en las cajas Petri con los medios de cultivo modificados y el testigo para su incubación en oscuridad por siete días a 25 ± 1 °C, en este tiempo el tratamiento testigo llenó la placa. El crecimiento micelial fue medido en dos direcciones perpendiculares a partir del centro de la colonia empleando un calibrador digital de precisión 0.01 mm (Truper^®). Se determinó el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (^{Dahal y Shrestha, 2018}) y se realizó el análisis de varianza de dos vías de los resultados utilizando el modelo lineal aplicando como variable dependiente los valores linealizados del porcentaje de inhibición, la comparación de medias se realizó por el método Tukey (α=0.05). Para cada fungicida se determinó la EC₅₀ por regresión lineal del logaritmo de la concentración de fungicida y el valor Probit de inhibición de crecimiento (^{Finney, 1952}). Los análisis se realizaron con el programa estadístico R versión 4.0.1 (^{R Core Team, 2020}).

Las características morfológicas de las colonias, conidios y conidióforos de los aislados MHP1 y MHP2 correspondieron a F. sacchari de acuerdo con ^{Leslie y Summerell (2006}); la colonia presentó micelio abundante, elevado, blanco pálido, que tornó a violeta a los 14 días de la siembra. Se observaron macroconidios alargados con célula apical curvada y célula basal poco desarrollada con tres septos, así como microconidios abundantes en falsas cabezas en monofiálides o polifiálides, ovoides de una célula. Las secuencias obtenidas en GenBank ON924470 y ON924471 (ITS) presentaron una similitud del 100% con el número de acceso MT882327.1 de F. sacchari mientras que la secuencia ON932086 (TEF) mostró similitud del 99% con el número de acceso MT010988.1 de F. sacchari.

F. sacchari exhibió diferencias significativas a todos los fungicidas y concentraciones evaluados (Figura 1). El análisis de varianza mostró diferencias altamente significativas (p≤0.01) entre los fungicidas y concentraciones. La comparación múltiple de medias del porcentaje de inhibición de crecimiento formó 12 grupos (Cuadro 1). El mayor porcentaje de inhibición se obtuvo con difenoconazol 1000 µg mL^-1 (93.5%) y tiabendazol 100 µg mL^-1 (92.1%), 1000 µg mL^-1 (91.4%) y 10 µg mL^-1 (89.8%). El resto de los tratamientos presentaron porcentajes de inhibición de 75.8 a 0%. Diversos estudios de control in vitro de especies de Fusarium reportan efectos significativos de inhibición de crecimiento con estos fungicidas. ^{Alburqueque y Gusqui (2018}) obtuvieron un 100% de inhibición en F. oxysporum aislado de jitomate (Solanum lycopersicum) tratado con azoxystrobin, carbendazim, fosfito de cobre y tiabendazol, de manera similar ^{Dahal y Shrestha (2018}) reportan un 100% de inhibición en F. oxysporum tratado con carbendazim a 150 y 200 ppm; mientras que ^{Madhavi y Bhattiprolu (2011}) obtuvieron con los fungicidas carbendazim y benomil un 92 y 91% de inhibición en F. solani aislado de chile (Capsicum annuum), respectivamente.

De acuerdo con los resultados de la presente investigación, se observó que los fungicidas con código G1 (difenoconazol) cuyo modo de acción es de inhibición en la biosíntesis de esteroles con punto de acción en la inhibición de la desmetilación (FRAC, 2020), y código B1 (tiabendazol) cuyo modo de acción es de inhibición de proteínas motoras y del citoesqueleto con punto de acción en el ensamblaje de las β-tubulinas en la mitosis (FRAC, 2020), fueron los que inhibieron en mayor porcentaje el crecimiento micelial de F. sacchari.

Figura 1 Crecimiento de Fusarium sacchari a los siete días de exposición a concentraciones de 0, 1, 10, 100 y 1000 µg mL-1 de azoxystrobin A), difenoconazol B), hymexazol C), cyprodinil D) y tiabendazol E). 

Respecto a la EC₅₀ los valores bajos correspondieron a difenoconazol con 1.5 µg mL^-1 (error estándar 2.1) y tiabendazol con 7.2 µg mL^-1 (error estándar 1.3). Cyprodinil presentó un valor de 36.7 µg mL^-1 (error estándar 2.2) e hymexazol un valor de 371.0 µg mL^-1 (error estándar 1.3), mientras que el valor más alto fue para azoxystrobin 18420 µg mL^-1 (error estándar 5.2). F. sacchari presentó crecimiento en todas las concentraciones evaluadas con azoxystrobin; resultados similares han sido obtenidos por ^{Gutierrez et al. (2006}) en donde no presentaron diferencias significativas en el porcentaje de inhibición, así como baja sensibilidad de aislados de Fusarium spp. obtenidos de frutos de jitomate hacia dosis de azoxystrobin (3.3, 9.9 y 27.7 µL L^-1 de Quadris, Syngenta).

El tipo de cultivo y enfermedad ocasionada por el fitopatógeno contra el cual se aplica un fungicida tiene efecto sobre su capacidad para realizar la inhibición en el crecimiento. ^{Avonazi et al. (2014}) obtuvieron un EC₅₀ promedio de 0.2 mg L^-1 en su ensayo con F. graminearum aislado de trigo (Triticum aestivum) expuesto a azoxystrobin, siendo este el fungicida con mayor eficacia en la inhibición de la germinación de esporas. En esta investigación el hymexazol cuyo modo de acción (A3) tiene implicación en el metabolismo de ácidos nucleicos afectando la síntesis de ADN/ARN y el cyprodinil cuyo modo de acción (D1) afecta la síntesis de aminoácidos y proteínas al inhibir la biosíntesis de metionina (FRAC, 2020), presentaron bajos porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de F. sacchari en todas las concentraciones evaluadas, teniendo valores de eficacia menores a 76%.

El tiabendazol presentó un rango de inhibición de 7.9 a 91.4% y una EC₅₀ de 7.2 µg mL^-1, estos resultados demuestran el efecto antifúngico del tiabendazol derivado de su efecto directo sobre la mitosis, lo que impide el desarrollo del micelio (^{Melgarejo y Abella, 2011}). Tiabendazol inhibió el crecimiento micelial de F. sacchari a partir de la concentración 10 µg mL^-1, este resultado coincide con lo reportado por ^{Kawchuk et al. (1994}) en donde en su estudio in vitro de aislados de Fusarium spp. obtenidos de tubérculos de papa con síntomas de pudrición seca, el crecimiento micelial fue inhibido con una EC₅₀ de 10 mg L^-1; por su parte ^{Gachango et al. (2012}) obtuvieron una EC₅₀ de 3.7 mg L^-1 con aislados de Fusarium spp. obtenidos también de tubérculos de papa con pudrición seca. Con difenoconazol se obtuvo un rango de inhibición de 49.3 a 93.5% con una EC₅₀ de 1.5 µg mL^-1, estos resultados coinciden con los reportados por Gachango et al. (2012) quienes obtuvieron una inhibición micelial del 50% con una EC₅₀ de 1.8 mg L^-1. ^{Anderson et al. (2020}) en el estudio de sensibilidad de F. graminearum aislado de trigo (Triticum aestivum) a fungicidas del grupo de triazoles, obtuvieron una EC₅₀ inferior a 2 µg mL^-1 tanto para tebuconazol como metoconazol, lo cual confirma que los fungicidas del grupo químico de triazoles son eficaces en la disminución del crecimiento del micelio en especies de Fusarium.

Los resultados obtenidos en esta investigación coinciden con trabajos previos en donde se demuestra que fungicidas de diversos grupos químicos como carbendazim (benzimidazoles, B1), metil tiofanato (tiofanatos, B1), oxicloruro de cobre (inorgánicos, M01) y mancozeb (ditio carbamatos, M03) ejercen control para combatir la enfermedad de PB (^{Vishwakarma et al., 2013}; ^{Jeyakumar y Zhang, 2020}; ^{TNAU, 2020}), teniendo los dos primeros fungicidas modo de acción similar a tiabendazol en la inhibición de proteínas motoras y del citoesqueleto y los dos restantes productos químicos con actividad multisitio (FRAC, 2020).

F. sacchari ha sido reportada como agente causal de la enfermedad PB en diferentes partes de mundo (^{Lin et al., 2014};^{Viswanathan et al., 2017}; ^{Bao et al. 2020}; ^{Paul et al. 2022}), en esta investigación se aisló de plantas de caña de azúcar de campos cañeros de la Huasteca Potosina; a pesar de que la enfermedad de PB todavía no presenta impactos económicos en esta región, resulta ser una amenaza fitosanitaria, es por ello recomendable para futuros ensayos incluir aislados del patógeno de diferentes campos de producción.