Material vegetal y fuentes de virus

Se utilizaron un total de 151 muestras de plantas de chile con síntomas, incluidas las cultivadas de tipo habanero Capsicum chinense (45) y tipo Scotch Bonet (12); las variedades locales de C. annuum var. annuum identificadas regionalmente como Dulce (18); X´kat iik (12) y Ya´ax iik (8); plantas de C. annumm. var. aviculare conocida localmente como Maax iik (43) y plantas de C. frutescens (ocho) tipo Tabasco, que crecen silvestres o en huertos familiares. Adicionalmente, se recolectó maleza representativa de diferentes familias: Callicarpa spp., (Verbenaceae) (uno), Croton malvaviscifolius (Euphorbiaceae) (uno), Dicliptera sexangularis (Acanthaceae) (uno), Herissantia crispa (Malvaceae) (uno) y Nicotiana tabacum (Solanaceae) (uno). El material vegetal recolectó en diferentes localidades de los estados de Yucatán (YS) y Campeche (CS), ambos ubicados en la YPM (Cuadro 1, Figura 1). Se recolectaron muestras de hojas de maleza en sitios no agrícolas y en áreas de cultivo de chile, durante dos temporadas de infestación severa de mosquita blanca (de febrero a mayo y de julio a principios de octubre de 2017). Las muestras se almacenaron a -20 ºC en el laboratorio de virología molecular del CICY para utilizarlas como fuente del ADN viral. El ADN genómico total de las hojas de plantas de chile y de maleza se extrajo de acuerdo con los métodos de ^{Dellaporta et al. (1983}) y ^{Echevarría-Machado et al. (2005}), respectivamente. Las muestras de hojas se limpiaron con agua destilada estéril antes de la extracción de ADN para eliminar una posible contaminación por mosquita blanca.

Figura 1 Mapa que indica las ubicaciones de la YPM en donde se recolectaron plantas sintomáticas para este estudio. Los símbolos representan los lugares donde se recolectaron las plantas sintomáticas. 

Amplificación, clonación, secuenciación y análisis de secuencias mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se utilizó el par de cebadores prAV324/AC889 para la amplificación por PCR del fragmento génico de la región central del gen de la proteína de la capside viral (core Cp) de ~576 pb para el diagnóstico de los begomovirus (^{Brown et al., 2005}), siguiendo el protocolo recomendado por los autores. Los productos de PCR específicos de begomovirus de ~576 pb se purificaron con un kit QIAEX II (QIAGEN) y se clonaron en el vector pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias de nucleótidos se determinaron con un secuenciador ABI 377 (Davis Sequencing Co., CA, EE. UU.). La mayoría de las clonas se secuenciaron en dirección directa e inversa. Para aumentar la probabilidad de detectar múltiples especies de begomovirus en muestras de campo con infecciones mixtas, se clonaron de tres a cinco productos de PCR y se analizaron sus secuencias de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos (120) de muestras clonadas seleccionadas al azar (52) se editaron manualmente para reducir la degeneración en los cebadores (EditSeq, DNASTAR versión 5.08, Madison, WI, EE. UU.), lo que resultó en una secuencia de 533 nt del core Cp. La identificación parcial de especies de los Begomovirus se realizó mediante la comparación con secuencias disponibles en la base de datos NCBI-GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) por BLASTn (^{Altschul et al., 1997}).

Análisis de datos de las secuencias

Los análisis genéticos y filogenéticos se realizaron sobre los datos de 25 secuencias parciales del core Cp de begomovirus identificadas en el presente estudio, 23 de las cuales se aislaron de especies y variedades locales de Capsicum y de dos diferentes especies de maleza. Además, se obtuvieron 36 secuencias de referencia estándar, editando el core Cp del genoma begomoviral completo de secuencias obtenidas de la base de datos GenBank (Tabla 2). Estas secuencias se incluyeron en el análisis filogenético. La alineación de secuencias múltiples de los taxones se realizó con CLUSTALW en MegAlign (DNASTAR versión 5.08, Madison, WI). El análisis de la matriz de distancia genética, la diversidad y el patrón de sustituciones de nucleótidos (total, sinónima y no sinónima) se realizó con 23 secuencias de nucleótidos del core Cp del PepGMV (Cuadro 2). Las secuencias del PepGMV seleccionadas incluyeron tres muestras de cada especie de Capsicum y una secuencia de cada maleza. La región genómica del core Cp (CPR) corresponde a la región del gen en las posiciones 147-679, de acuerdo a la secuencia del GenBank AF077025. Las pruebas evolutivas moleculares se realizaron utilizando los métodos de 2 parámetros de Kimura y Kumar. El análisis Bootstrap con 1000 repeticiones se realizó utilizando el software MEGA versión 11 (^{Tamura et al., 2021}). Se realizó una prueba Z basada en codones, promediando secuencias generales, para probar la fuerza selectiva que opera en secuencias del core Cp, utilizando el método Kumar en MEGA 11. Se eliminaron todas las posiciones que contenían espacios y datos faltantes (opción de eliminación completa). Hubo un total de 177 posiciones en el conjunto de datos final. Para reconstruir el árbol filogenético, se analizaron múltiples secuencias alineadas por parsimonia múltiple usando MEGA 11, con 1000 iteraciones por réplica. El árbol de consenso estricto se construyó usando la configuración estándar de MEGA 11. El soporte estadístico para cada clado principal se calculó usando Bootstrap con 1000 iteraciones por réplica. El árbol se enraizó usando la secuencia del core Cp editada del virus del rayado del maíz (MSV-CP) del género Mastrevirus, familia Geminiviridae (Tabla 2).

Búsqueda de síntomas virales en plantas cultivadas y de campo.

En un estudio de la enfermedad durante temporadas de alta infestación de mosquita blanca, en localidades de YS y CS (Figura 1), se encontraron plantas de chile de diferentes especies y maleza con síntomas similares a los causados por virus. Todas las plantas de chile cultivadas colectadas, como C. chinense, C. a. var annuum, variedad local Dulce, X´kat iik y Ya´ax iik, C. frutescens y la especie silvestre C. annuum var. aviculare Maax iik, mostraron síntomas como mosaicos dorados, deformación en las hojas y retraso en el crecimiento. En C. frutescens los síntomas se observaban claramente, mientras que en el chile Maax iik, a menudo aparecían moderadamente presentes en una o dos ramas y rara vez afectaban a toda la planta (Figura 2A). Las variedades locales X´kat iik (Figura 2B), Chile Dulce (Figura 2C y D) y Chile Habanero (Figura 2E y F) mostraron síntomas foliares notables de diversa gravedad, que incluyen amarillamiento, hojas rizadas hacia abajo, mosaicos dorados y retraso en el crecimiento. Se observaron síntomas comparables en especies de maleza (imágenes no mostradas). En la mayoría de los casos, las plantas de chile mostraron hojas pequeñas y rizadas y tenían un aspecto atrofiado y tupido, debido a la longitud reducida de los entrenudos (Figura 2D).

Figura 2 Síntomas observados en plantas silvestres (A) y cultivadas (B, C, D, E y F) muestreadas en Catmis (A), Muna (B), Mérida (C), Cuzama (D) y Tekax (E y F) infectadas con Begomovirus (PCR+). (A) Capsicum annuum var. aviculare (Maax iik) que muestra ramas con mosaicos dorados, hojas distorsionadas y crecimiento atrofiado; (B) C. annuum var. annuum (X´kat iik) con mosaico dorado severo y hojas distorsionadas; (C y D) C. annuum var. annuum (Chile Dulce) con mosaicos dorados severos, hojas distorsionadas y crecimiento atrofiado; (E y F) C. chinense (tipo Habanero) con mosaicos dorados, hojas rizadas hacia abajo y crecimiento gravemente atrofiado. 

Identificación preliminar de Begomovirus

Del total de muestras de plantas colectadas (151), incluyendo 146 chiles y cinco plantas de maleza, el 90.1% fueron PCR positivas con los cebadores que amplifican el core Cp (Cuadro 3). Es decir, el 89.7% de los chiles (131), incluyendo las muestras de plantas de todas las especies de chile y todas las muestras de maleza (5), fueron positivas para begomovirus. La secuenciación de los amplicones, en promedio de dos a tres por muestra de planta (52), reveló la probable incidencia de infecciones simples y mixtas de begomovirus. Las especies de virus detectadas en 120 clonas secuenciadas se identificaron provisionalmente en base a comparaciones de identidad de nucleótidos (> 89% nt) con secuencias del core Cp viral de begomovirus reportados previamente (Cuadro 3). Las infecciones simples con el virus del mosaico dorado del chile (PepGMV) fueron las más frecuentes, representando el 82.5% de las cloneas secuenciadas (99), detectados en hojas de las diferentes especies de Capsicum y en las especies de maleza Callicarpa spp., C. malvaviscifolius, D. sexangularis, H. crispa y N. tabacum (Cuadro 3). Le siguió el virus de la vena amarilla del pimiento huasteco (PHYVV) (5%), que se encontró en dos plantas de C. chinense, una clona aislada de Habanero y el otro de tipo Scotch Bonnet. Además, se encontró el virus del enrollamiento severo de la hoja del tomate (ToSLCV) (4.2%) en plantas de Habanero y Dulce. Curiosamente, cuatro clonas secuenciadas (3.3%) de una sola planta de chile habanero (muestra H6 EuMV-YP[C. chinense H]) mostraron una alta identidad (98-99%) con el virus del mosaico de Euphorbia-[Península de Yucatán] EuMV-YP aislado en Euphorbia heterophylla (^{Hernandez-Zepeda et al., 2007b}). Las posibles infecciones mixtas se confirmaron realizando una búsqueda bidireccional de la secuencia parcial de tres a cinco clonas de cada especie begomoviral aislada en cada planta. Estas incluyeron una mezcla del PepGMV-PHYVV en chile Habanero (muestra 120, C. chinense H), PepGMV-TYLCV en chile Dulce (muestra 138, C. annuum D) y PepGMV-ToSLCV en una planta X´kat iik (muestra 144, C. annuum, Cuadro 3).

Variación genética de aislados del PepGMV basada en análisis de distancia de nucleótidos a partir de secuencias parciales del ADN-A de begomovirus

El análisis de distancia genética basado en el análisis por parejas de 23 secuencias de nucleótidos del core Cp seleccionadas (Cuadro 4), indicó que los aislados del PepGMV son cepas estrechamente relacionadas, que compartían entre 95 y 99% de identidad de secuencia de nucleótidos. El porcentaje de identidad de nt se calculó como [1-distancia genética] x100 (^{Brown et al., 2005}). La distancia promedio de nt del CPR estimada para el número de sustituciones de bases por sitio en los 23 pares de secuencias fue igual a 0.027 (± 0.004 SE), con una distancia de transición a transversión calculada por proporción de sitio (R) igual a 0.641 (± 0.21 SE). En general, la divergencia promedio estimada basada en codones de todos los pares de secuencias mostró un valor bajo de sustituciones no sinónimas (dN) a sustituciones sinónimas (dS) (dN = 0.003 < dS = 0.130) y una proporción dN/dS baja de 0.023 (Cuadro 4).

Análisis filogenético basado en secuencias parciales del ADN-A de begomovirus

El análisis filogenético analizó la relación probable entre los begomovirus encontrados que infectan chiles y aquellos que infectan especies de maleza colectadas en YS y CS, según sus secuencias correspondientes en el GenBank. El análisis incorporó las secuencias de nt de la región central del gen de la proteína de la capside (core Cp) de 61 taxones. La matriz se construyó con secuencias de 23 nt aisladas de Capsicum spp., dos de maleza (Cuadro 3) y 36 de secuencias publicadas en el GenBank (Cuadro 2). La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Máxima Parsimonia. La Figura 3 muestra el árbol más parsimonioso, con una longitud =3191. El índice de consistencia es 0.376378 (0.309704), el índice de retención es 0.634911 (0.634911) y el índice compuesto es 0.238966 (0.196634) para todos los sitios y sitios informativos de parsimonia (entre paréntesis). El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon por Bootstarp (1000 repeticiones) se muestra junto a las ramas. El árbol MP se generó utilizando el algoritmo Subtree-Pruning-Regrafting (SPR) (nivel de búsqueda 1). Los árboles iniciales se obtuvieron mediante la adición aleatoria de secuencias (10 repeticiones). Hubo un total de 566 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA11. El grupo de begomovirus del hemisferio oriental con un valor de Bootstrap del 99% incluye el virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (Tomato yellow leaf curl virus), del cual la clona 138-TYLCV-[C. annuum D], aislado de una planta con una probable infección mixta (Cuadro 3, Figura 3), mostró una alta identidad (99%), con el aislado de TYLCV de la República Dominicana. Curiosamente, se observó un clado divergente que contenía tres clones de aislados del PepGMV de diferentes cultivares de C. annuum cerca del MSV-CP, el Mastrevirus, que se seleccionó como la raíz del árbol filogenético, con un 89 % del valor de Bootstrap. El grupo del Hemisferio Occidental se divide en dos subclados (63% soporte del nodo). Un grupo incluye el virus del enrollamiento severo de la hoja del tomate (Tomato severe leaf curl virus) clon 144-ToSLCV-[C. annuum X]), aislado de una planta X´kaat ik con una probable infección mixta (Cuadro 3, Figura 3). Este grupo está asociado con el aislado de referencia ToSLCV-[GT] (82% de Bootstrap), comparte nodos comunes con otros begomovirus y se agrupa con especies del virus del mosaico dorado de Sida (Sida golden mosaic virus -SiGMV), el virus del moteado del tomate (Tomato mottle virus -ToMoV), el virus del Chino del tomate (Chino del tomate virus - CdTV) y el virus del mosaico de Abutilon (Abutilon mosaic virus - AbMV). El segundo grupo, con dos ramas, incluye una clona del virus del mosaico de Euphorbia (Euphorbia mosaic virus), H6 EuMV-YP (C. chinense H), aislado de chile, con su especie hermana, el aislado de referencia EuMV-YP (99% de Bootstrap) y el virus del encrespado amarillo de la hoja del tomate (Tomato mild yellow leaf curl Aragua virus - TMYLCAV), relación sustentada con un valor de Bootstrap del 77% (Figura 3). Los primeros grupos se ensamblan con una especie de begomovirus que no recibió soporte de Bootstrap, incluido el clado SLCV. Las otras relaciones inferidas para las colecciones no tienen soporte de Bootstrap y se subdividen en dos subclados. Un subclado que comprende el cluster del virus huasteco de la vena amarilla del chile (Pepper huasteco yellow vein virus - PHYVV) se agrupa con tres aislados de C. chinense, las clonas 120 y 183 de PHYVV- de Habanero y el aislado 40-PHYVV de la planta Maax iik, con 88 a 99 % de valores Bootstrap. El segundo subclado está formado por secuencias del virus del mosaico dorado del chile (Pepper golden mosaic virus - PepGMV) de la mayoría de los aislamientos de chile y maleza con aislamientos de referencia de begomovirus bien conocidos, formando un clado principal del PepGMV respaldado por Bootstrap (83%). Este clado del PepGMV se dividió visiblemente en tres subclados (Bootstrap 89%) (Figura 3). Dos clonas del PepGMV, R3 y 164, se agruparon en un clado separado con el TYLCV-DR, con un 89% de soporte de Bootstrap. Es necesario un análisis posterior con la secuencia completa del Componente A de ambos clonas para corroborar esta relación filogenética.

Figura 3 Relaciones filogenéticas inferidas por la secuencia parcial del core Cp de begomovirus identificados en plantas de chile cultivadas y silvestres provenientes de Yucatán y Campeche, México. El análisis también incluye la secuencia del core Cp de begomovirus seleccionados y bien estudiados que están disponibles en el GenBank. La figura muestra el árbol más parsimonioso. Los números colocados en los nodos representan valores de Bootstrap superiores al 50%. Los valores más bajos no se muestran (1000 iteraciones).