Materiales y métodos

Cepas de F. oxysporum. Para el presente estudio se utilizaron 12 cepas de F. oxysporum aisladas de vainilla: nueve patógenas de V. planifolia y tres no patógenas (Cuadro 1). Con excepción de las cepas BC1, Chic3 y JF9, la identificación (morfológica y molecular) y capacidad patogénica de las cepas restantes se encuentra publicada en los trabajos de ^{Adame-García et al. (2015}), ^{Casillas-Isiordia et al. (2017}) y ^{Flores-de la Rosa et al. (2018}). La evaluación morfológica, genética y capacidad patogénica en V. planifolia de las cepas BC1, Chic3 y JF9 fueron determinadas siguiendo los protocolos descritos en las referencias antes mencionadas (datos no mostrados). Todas las cepas están resguardadas en el Laboratorio de Genética e Interacciones Planta Microorganismos de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Veracruzana. Las plantas de vainilla de donde se obtuvieron los hongos fueron colectadas de acahuales, selva o plantaciones de vainilla, sin manejo con fungicidas químicos.

Preparación de suspensión de esporas. Las cepas se activaron y posteriormente se subcultivaron en PDA durante 10 días a 25 °C en incubadora microbiológica (Mca. Felisa). Concluido el periodo de incubación se adicionaron 5 mL de agua destilada estéril con tres gotas de Tween 20 sobre el medio de cultivo para transferir una muestra de suspensión de micelio y conidias a tubos cónicos de 15 mL, para centrifugación a 1000 rpm durante 2 min. A partir del sobrenadante se prepararon suspensiones de conidias de 1x10⁹ UFC por dilución con agua destilada esterilizada. Para el conteo de esporas se utilizó una cámara de Neubauer y observación microscópica.

Pruebas de resistencia a fungicidas. Se evaluó la susceptibilidad de las 12 cepas de F. oxysporum a cuatro fungicidas comerciales: tiofanato metílico (Cercobin M^®), benomilo (Promyl^®), carbendazim (Prozycar^®) y clorotalonil (Talonil 75^®). Las pruebas se llevaron a cabo en cajas de Petri mediante la técnica de placa-orificio, para ello, se prepararon cultivos fúngicos con 100 μL de la suspensión de esporas 1x10⁹ UFC y 25 mL de PDA. Para ello, la suspensión de esporas se colocó directamente en la base de la caja de Petri y posteriormente, se vaciaron encima ⁓ 25 mL de medio de cultivo a una temperatura de ⁓ 40 °C. Las conidias fueron distribuidas en el agar con movimientos circulares a favor y en contra de las manecillas del reloj antes de la solidificación del medio de cultivo. Después de la solidificación del agar, con una varilla metálica hueca estéril (sacabocado) se removieron cuatro cilindros de agar distribuidos equidistantemente en la superficie de cada placa, donde se probaron tres concentraciones: una de acuerdo a la recomendación de uso del producto (1% P:V), una más alta (2.5% P:V) y una más diluida (0.5%), por cada tipo de fungicida. Para ello, en cada orificio se colocaron 10 μL de la solución del fungicida a la concentración evaluada. Como testigo, en uno de los orificios se colocaron 10 μL de agua destilada estéril. Esta prueba se repitió cinco veces por cada fungicida y por cada cepa de F. oxysporum en estudio. Los cultivos se incubaron durante cinco días a 25 - 26 ºC en incubadora microbiológica (Mca. Felisa). El diámetro del halo de inhibición de cada tratamiento se midió con un vernier digital. Las cepas resistentes fueron aquellas en las que no se observó un halo de inhibición alrededor del orificio donde se depositó el fungicida.

Determinación de la relación entre el carácter patogénico/no patogénico de la cepa de F. oxysporum, con la respuesta a los fungicidas. Para determinar la posible relación entre el carácter patogénico y no patogénico con la susceptibilidad o resistencia a los fungicidas, se aplicó un Modelo Lineal Generalizado (Dist. Binomial, Función de liga Logit) con base en una matriz de datos binarios (0 resistente, 1 susceptible). Asimismo, se realizó un análisis de conglomerados jerárquico y de ligamiento completo, empleando la distancia euclidiana. Los análisis se desarrollaron en el software para análisis estadísticos R 2.12.2.

Extracción de ADN. Para la extracción de ADN se empleó un protocolo basado en el uso de CTAB propuesto por ^{Adame-García et al. (2016}a) a partir de ⁓ 50 mg de micelio de cada aislado de Fusarium oxysporum de 10 a 14 días de crecimiento en medio PDA. El ADN se cuantificó con un espectrofotómetro UV-Visible compacto (Thermo Scientific™ NanoDrop™ One).

Diseño de iniciadores para el gen GPDH. Para la amplificación del gen GPDH fue necesario diseñar iniciadores por no encontrar reportes en la literatura. El diseño de los iniciadores consistió en buscar en NCBI, la secuencia de aminoácidos de la proteína GPDH entre las reportadas para F. oxysporum f. sp. lycopersici, posteriormente, convertir la secuencia en nucleótidos utilizando tBLASTn y posteriormente, se buscó la secuencia resultante en los genomas reportados de F. oxysporum. Las secuencias encontradas se alinearon en el software Mega (^{Kumar et al., 2018}) y mediante los softwares Primer3 Plus (^{Untergasser et al., 2007}) y Primer-BLAST que arrojaron un total 15 parejas de posibles iniciadores (datos no mostrados). Cada par de iniciadores arrojados se probaron mediante la realización de PCR in silico en la plataforma del NCBI. Se eligieron los pares de iniciadores P4f (5’-AAAGTCCACGCACTCCTCTG-3’) y P4r (5´- AGAATGGCGACGGAAACCTT-3’) generados con el software Primer3 Plus, cuya secuencia resultante abarcó desde la base 506 hasta la 1146 del tamaño total del gen, y los iniciadores P13f (5’-CCTGCACAAGTCAACAAGCC-3’) y P13r (5’-GCGCAACTGTTGTCAACCAT-3’) generados con el software Primers BLAST, que abarcaron desde la base 766 hasta la 1710.

Amplificación y secuenciación de los genes de β-tubulina y GPDH. La amplificación del gen β-tubulina se realizó con el juego de iniciadores Tub1 (5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3’) y Tub22 (5’-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3’) (^{Nosratabadi et al., 2018}), con las siguientes condiciones térmicas: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de desnaturalización por 30 s a 94 °C, alineamiento de 45 s a 60 °C, extensión a 80 s a 72 °C; y extensión final a 72 °C por 7 min. Para la amplificación del gen GPDH se utilizaron los pares de iniciaadores P13f - P13r y P4f - P4r diseñados en este estudio, bajo las siguientes condiciones térmicas: desnaturalización inicial a 94 °C por 2 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 2 min, alineamiento por 60 °C, extensión a 72 °C por 60 s; extensión final de 72 °C por 7 min. Los productos de amplificación fueron analizados por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1.8 % y tinción con bromuro de etidio, donde se corroboró que los productos de amplificación de los genes β-tubulina y GPDH correspondieran a 950 pb y 450 pb, respectivamente. Después de la electroforesis, los productos de amplificación se purificaron siguiendo el protocolo del kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System y se enviaron a secuenciar al Instituto de Biotecnología (UNAM).

Análisis bioinformático. Se editaron las secuencias mediante el software MEGA X y se obtuvieron las secuencias consenso de cada gen a partir de las secuencias generadas con los iniciadores “sentido” y “antisentido”, para cada cepa en estudio. Cada secuencia resultante se analizó mediante el algoritmo BLAST. Con el fin de hacer los diseños en 3D de la molécula de la proteína β-tubulina e identificar los motivos, las secuencias se alinearon y compararon en el software BioEdit. Para la búsqueda de dominios conservados en el gen β-tubulina en cepas susceptibles y resistentes a tiofanato metílico, las secuencias se tradujeron a proteínas y se alinearon con el software MEGA X (^{Kumar et al., 2018}), para tal propósito se incluyeron las secuencias de F. oxysporum f. sp. niveum Fon12105 (acceso KX369333) y Fon53 (acceso KX369332) usadas en el estudio de ^{Petkar et al. (2017}). En el alineamiento se identificaron de forma manual las mutaciones y se compararon las secuencias de tres cepas de F. oxysporum resistentes versus la cepa susceptible Fon12105. Para la identificación de motivos proteícos se utilizó el software EzMol, en tanto que, para la modelación 3D de las moléculas se empleó el software Phyre2.

Resultados

Ensayos de resistencia a fungicidas. De acuerdo con la respuesta ante los fungicidas probados en cepas de F. oxysporum aisladas de vainilla, el análisis de conglomerados estableció tres grupos: A) cepas susceptibles a benomilo y carbendazim, pero resistentes a tiofanato metílico y clorotalonil; B) cepas susceptibles a benomilo, carbendazim y clorotalonil, y resistentes a tiofanato metílico; y C) cepas susceptibles a los cuatro fungicidas (Figura 1). En el grupo A se encontraron nueve cepas provenientes de Veracruz, Nayarit y Oaxaca; en el grupo B, dos cepas de Oaxaca; y en el grupo C, una cepa de Veracruz (Cuadro 1). No se encontraron diferencias entre el carácter patogénico o la procedencia de las cepas en relación con la susceptibilidad a los fungicidas (P > 0.05), según las pruebas del modelo lineal generalizado susceptibilidad ~ patogenicidad + procedencia. Es importante destacar que no se observó diferencia en la respuesta de los hongos por las diferentes concentraciones utilizadas del fungicida.

Figura 1 Agrupamiento de las cepas de F. oxysporum según su susceptibilidad a bencimidazoles y clorotalonil. A) susceptibilidad a benomilo y carbendazim, resistentes a tiofanato metílico y clorotalonil; B) susceptibilidad a benomilo, carbendazim y clorotalonil, resistentes a tiofanato metílico; C) susceptible a todos los fungicidas. 

Amplificación de los genes β-tubulina y GPDH. En las 12 cepas evaluadas, la amplificación produjo un fragmento de 950 pb para el gen β-tubulina utilizando los iniciadores previamente reportados en la literatura para este gen y de 450 pb para el gen GPDH usando los iniciadores P4F (Figura 3). No se obtuvo amplificación con los iniciadores P13 para el gen GPDH.

Análisis bioinformático. El análisis BLAST confirmó que todas las secuencias obtenidas correspondieron a los genes β-tubulina y GPDH, respectivamente (Cuadro 2). Con el fin de encontrar diferencias en el gen β-tubulina entre las cepas susceptibles y resistentes a los fungicidas tiofanato metílico y clorotalonil se emplearon las secuencias de las cepas patógenas V6M2 y N3 y las cepas no patógenas Chic6 y BC1. El análisis de alineamiento evidenció que la cepa susceptible al tiofanato metílico Fon12105 (^{Petkar et al., 2017}) y la cepa resistente Chic6, compartieron la base timina en la posición 200, mientras que en el resto de las secuencias se encontró adenina (Figura 2). Para el análisis del gen GPDH se consideraron seis secuencias de cepas resistentes a clorotalonil (N3, JF5, A3, V6M2, Chic2 y N12) y una cepa susceptible (JF9), en éstas no se encontraron mutaciones del gen GPDH, lo que lleva a proponer que la respuesta de susceptibilidad o resistencia no está relacionada con variaciones en la secuencia de la región analizada de este gen.

Identificación de motivos. Se encontró que las secuencias de la proteína β-tubulina de las cepas N3, BC1 y Fon53 resistentes a tiofanato metílico y la cepa susceptible Fon 12105, comparten los motivos 237537 y 335235. La cepa N3 se diferencia por presentar los motivos 236152 y 279881, en tanto que la cepa Fon 12105 fue la única en presentar el motivo 237844 (Figura 3).

Estructuras 3D de las proteínas blanco. La estructura tridimensional de la proteína β-tubulina mostró diferencias entre la cepa susceptible y las resistentes al tiofanato metílico, específicamente se encontró que las cepas resistentes V6M2, BC1 y Fon53 tienen el arreglo de aminoácidos histidina-glicina-serina, en tanto que, en la misma posición, la cepa Fon12105 tiene cisteína-cisteína-prolina (Figura 4a). Las proteínas GPDH de las cepas JF5 (resistente a clorotalonil) y JF9 (susceptible a clorotalonil) mostraron una estructura diferente a las proteínas de las cepas resistentes A3, V6M2, Chic2 y N12 (Figura 4b).

Figura 2 A) Fragmento del alineamiento de las secuencias del gen β-tubulina donde se observa en la posición 200 (enmarcada en el rectángulo) que las cepas Ch6 (Chic6, este estudio) y Fon12105b (F. oxysporum f. sp. niveum, ^{Petkar et al., 2017}) comparten el nucleótido timina, siendo Chic6 resistente al tiofanato metílico, mientras que Fon12105b es susceptible. B) Amplificación de productos de PCR en gel de agarosa del gen β-tubulina (A) y gen GPDH (B) de algunas cepas de Fusarium en estudio. C) Electroferograma de la secuencia del gen β-tubulina de la cepa Chic6, resistente al tiofanato metílico, donde se muestra la timina en la posición 200. 

Figura 3 Búsqueda de dominios conservados en el gen β-tubulina en cepas de F. oxysporum, susceptibles y resistentes a tiofanato metílico, aisladas de V. planifolia. Se encontró que el motivo 237844 en la cepa Fon12105 susceptible (^{Petkar et al., 2017}) no está presente en las cepas resistentes Fon53 (^{Petkar et al., 2017}), N3 y BC1. 

Discusión

La limitada variabilidad genética que tiene la vainilla (V. planifolia) la hace altamente vulnerable ante diversos patógenos (^{Koyyappurath et al., 2015}). El hongo F. oxysporum f. sp. vanillae, agente causal de la enfermedad de pudrición de raíz y tallo, representa un importante problema fitosanitario para los productores de vainilla a nivel mundial (^{Pinaria et al., 2010}; ^{Adame-García et al., 2016}b; ^{Casillas-Isiordia et al., 2017}).

Figura 4 Modelos 3D de las proteínas blanco de: A) tiofanato metílico (1, cepa V6M2; 2, cepa Fon 53; 3, cepa BC1; 4, cepa Fon12105); B) clorotalonil (1, cepa JF5; 2, cepa JF9; 3, cepa A3; 4, cepa V6M2; 5, cepa Chic2; 6, cepa N12). Se observan diferencias estructurales en ambos casos asociadas a la resistencia a los fungicidas. 

Para combatir esta enfermedad se tienen avances en la investigación o la aplicación de varios tipos de control: genético, cultural, biológico y químico. Este último es el más utilizado por los productores, ya que su costo es bajo, efectivo y de fácil acceso; no obstante, el uso excesivo de los fungicidas puede provocar que los hongos generen resistencia a los principios activos de estos, como ha sucedido en patógenos de otros cultivos (^{Hobbelen et al., 2011}; ^{Steinberg y Gurr, 2020}). Algunas especies del género Fusarium, como F. fujikuroi (^{Chen et al., 2014}), F. graminearum (^{Duan et al., 2014}; ^{Zhou et al., 2016}; ^{Zhu et al., 2018}), F. asiaticum (^{Suga et al., 2011}), entre otras, han sido reportadas como resistentes a algunos fungicidas como el benomilo, el tiofanato metílico y el carbendazim. En el caso de F. oxysporum f. sp. vanillae no existen reportes previos acerca de su resistencia o suceptibilidad a fungicidas.

En el cultivo de la vainilla, los fungicidas más utilizados son de la familia de los bencimidazoles (^{Hernández-Hernández, 2019}), como el benomilo, carbendazim y el tiofanato metílico, que tienen actividad sistémica; así mismo, fungicidas de contacto multisitio de amplio espectro, como el clorotalonil, son ampliamente recomendados. Los bencimidazoles en contacto con el hongo inhiben el ensamblaje de los microtúbulos mediante la degradación de la β-tubulina, impidiendo la generación del huso mitótico, interrumpiéndose así la división celular (^{Chung et al., 2009}). En tanto que, el clorotalonil inhibe la función de la enzima glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (GPDH) que forma parte de la ruta de la glucólisis del hongo (^{Long y Siegel, 1975}).

El uso de los bencimidazoles está ampliamente extendido en la producción agrícola, aunque, en la lista 2019 del FRAC se describe la resistencia a los bencimidazoles como una característica común entre las especies fúngicas, entre ellas algunas formas especiales de F. oxysporum, por ejemplo, lilii, gladioli (^{Chung et al., 2009}), lycopersici (^{Amini y Sidovich, 2010}) y niveum (^{Petkar et al., 2017}). En este estudio, todas las cepas de F. oxysporum, patógenas y no patógenas de vainilla, presentaron susceptibilidad a benomilo y a carbendazim, en tanto que, nueve cepas fueron resistentes a tiofanato metílico, sin distinción de su carácter patogénico.

^{Petkar et al. (2017}) plantearon que el cambio de timina (T) por adenina (A) en la posición 200 del gen β-tubulina codifica dos aminoácidos distintos, fenilalanina (TTC) y tirosina (TAC), lo que daría la cualidad de susceptibilidad o resistencia al tiofanato metílico, respectivamente. Partiendo del hecho de que la comparación de las secuencias de las cepas de F. oxysporum, patógenas y no patógenas de vainilla, resistentes al tiofanato metílico, contra la secuencia de la cepa susceptible (Fon12105) y la resistente (Fon53) de F. oxysporum f. sp. niveum empleadas en el estudio de Petkar et al. (2017) mostró que las cepas Fon12105 (cepa susceptible) y Chic6 (cepa resistente de F. oxysporum f. sp. vanillae) tienen en la posición 200 una timina (T), y que el resto de las cepas resistentes poseen una adenina (A), se descarta la hipótesis de que la resistencia a este fungicida está explicada por un cambio en esta posición específica de la secuencia codificante de este gen. Con anterioridad se ha propuesto que en Fusarium fujikuroi (^{Chen et al., 2014}), así como en otras formae speciales de F. oxysporum (^{Chung et al., 2009}; ^{Amini y Sidovich, 2010}), se encuentra la fenilalanina en la posición 200 del gen, independiente a la resistencia o susceptibilidad hacia el tiofanato metílico. Otros estudios confieren la resistencia a los bencimidazoles en Sclerotinia homoeocarpa a la mutación de fenilalanina a tirosina (^{Dowling et al., 2017}), así como, que la mutación inversa (tirosina-fenilalanina) es la responsable de la resistencia en Colletotrichum musae (^{dos Santos-Vieira et al., 2017}).

Debido a la contraposición encontrada, respecto a la mutación en el codón 200 como la responsable de la resistencia o susceptibilidad del hongo al fungicida, el estudio se condujo hacía la búsqueda de motivos conservados en las secuencias del gen, encontrándose que el motivo 237844 (Pfam) únicamente se presentó en la cepa susceptible, lo que sugiere que en la resistencia al tiofanato metílico, el sitio de unión y acción del fungicida podría no incluir al residuo del codón, como lo propuso Vela-Corsía et al. (2018) al estudiar el acoplamiento entre el sitio de acción de los bencimidazoles con la proteína β-tubulina. No se encontró mayor información biológica para el motivo 237844 (Pfam).

Los bencimidazoles interfieren en ciertos sitios de la polimerización de los monómeros de α1-tubulina, α2-tubulina y β2-tubulina, sin embargo, una vez realizada la polimerización de los microtúbulos, ésta ya no se revierte (^{Zhou et al., 2016}). La inhibición de la polimerización depende del principio activo, así, el benomilo y carbendazim actúa en las subunidades α1/β2 y α2/β2, mientras que en el caso del tiabendazol se ha observado una menor capacidad de inhibir α2/β2 (Zhou et al., 2016), lo que estaría relacionado con una mayor probabilidad de resistencia. Para el tiofanato metílico no se tienen datos sobre cómo afecta estos procesos de polimerización, siendo posible que se comporte de manera similar al tiabendazol. Son necesarios más estudios acerca del modo de acción del tiofanato metílico para determinar si es éste el mecanismo de resistencia en F. oxysporum f. sp. vanillae.

El clorotalonil inhibe la actividad enzimática fúngica de deshidrogenasas, catalasas y fosfatasas ácidas (^{Baćmaga et al., 2018}); de manera específica, inhibe la actividad de la enzima GPDH (^{Long y Siegel, 1975}). Los altos niveles de resistencia al clorotalonil encontrados en cepas patógenas y no patógenas de F. oxysporum asociadas a la raíz de V. planifolia contradice a las anotaciones del FRAC (2019), que considera al clorotalonil como parte de un grupo con bajo nivel de riesgo en la generación de resistencia por su naturaleza multisitio de acción. No obstante, este fungicida ha mostrado alta efectividad contra otras formae speciales de F. oxysporum como F. oxysporum f. sp. lentis (^{Dahal y Shrestha, 2018}).

Si bien, las cepas de F. oxysporum asociado a vainilla no presentaron variaciones en el gen GPDH que expliquen la diferencia en la respuesta al clorotalonil, hay indicios dentro de los motivos conservados de la enzima que podrían estar asociados a la susceptibilidad. Para determinar el mecanismo de resistencia es necesario enfocar investigaciones que involucren de manera integral otros sistemas enzimáticos blanco reportados para este y otros fungicidas, toda vez que las cepas de Fusarium asociadas a vainilla han revelado alta variación en la actividad enzimática (^{Adame-García et al., 2011}) y alta variabilidad genética (^{Flores-de la Rosa et al., 2018}), que explica su respuesta variable ante los fungicidas probados. Para otros fungicidas multisitio, como el mancozeb, se ha documentado una reducción sustancial de la sensibilidad en muchas especies de patógenos, la cual ha sido asociada con los genes que involucran la formación de la maquinaria transcripcional, la regulación del pH celular y los transportadores de múltiples fármacos (^{Yang et al. 2019}).

Conclusiones

Las cepas de F. oxysporum, patógenas y no patógenas de V. planifolia, fueron altamente susceptibles a los fungicidas benomilo y carbendazim, y altamente resistentes a tiofanato metílico y clorotalonil. La mutación puntual de adenina a timina en el codón 200 del gen β-tubulina, que codifican fenilalanina/tirosina, respectivamente, no es la responsable de la resistencia al tiofanato metílico, como ha sido propuesto por otros autores, no obstante, se encontraron indicios de que la presencia de motivos conservados pueda estar relacionada con la susceptibilidad del hongo a este fungicida. No se encontró evidencia de que la variabilidad en la secuencia analizada del gen GPDH esté relacionada con la respuesta de susceptibilidad o resistencia al clorotalonil.