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Revista mexicana de fitopatología
On-line version ISSN 2007-8080Print version ISSN 0185-3309
Rev. mex. fitopatol vol.40 n.3 Texcoco Sep. 2022 Epub Nov 14, 2022
https://doi.org/10.18781/r.mex.fit.2203-4
Artículos científicos
Coinfección e interacción in vitro de Lasiodiplodia pseudotheobromae y Pestalotiopsis mangiferae asociados a la muerte descendente en ramas de mango (Mangifera indica) variedad Manila, en Veracruz, México
1 Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada. Universidad Veracruzana. Av. de las Culturas Veracruzanas 101, Col. Emiliano Zapata. Xalapa, Veracruz, México, CP 91090.
2 Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Av. Instituto Politécnico Nacional 195, Col. Playa Palo de Santa Rita Sur. La Paz, Baja California Sur, México, CP 23096;
3 Centro de Investigaciones Tropicales. Universidad Veracruzana. Calle José María Morelos 44, Col. Centro. Xalapa, Veracruz, México, CP 91000;
4 Facultad de Economía. Universidad Veracruzana. Av. Xalapa s/n, Col. Obrero Campesina. Xalapa, Veracruz, México, CP 91020;
La enfermedad de la muerte descendente causada por complejos fúngicos es un problema severo en árboles de mango (Mangifera indica). Sus principales síntomas son pudrición de ramas, gomosis y finalmente la muerte del árbol. En este trabajo se identificaron las especies del complejo fúngico causante de la muerte descendente del mango en la variedad Manila en Veracruz, México. Se evaluó la interacción in vitro de dos especies pertenecientes al complejo, así como la severidad de la coinfección en ramas de mango. Se identificó a Lasiodiplodia pseudotheobromae y Pestalotiopsis mangiferae como agentes causales de la muerte descendente de mango en la zona productora de Veracruz. En ramas de mango coinfectadas se observó mayor severidad de necrosis que en las infecciones individuales. Los filtrados de cultivos líquidos aplicados en co-cultivos mostró resultados diferentes para cada especie de fitopatógeno. El filtrado de P. mangiferae no tuvo efectos antagónico significativos sobre el crecimiento de L. pseudotheobromae (inhibición del 2.7%), mientras que el filtrado de L. pseudotheobromae inhibió 41.4% el de P. mangiferae. Los resultados demuestran que la infección múltiple en árboles de mango incrementa el daño ocasionado por muerte descendente, lo cual podría impactar directamente en el desarrollo de las estrategias de control.
Palabras clave: gomosis; virulencia; interacción; complejo de hongos
Dieback disease caused by fungal complexes is a severe problem in mango trees (Mangifera indica). Its main symptoms are branch rot, gummosis, and finally, the tree’s death. In this work, the species of the fungal complex causing mango dieback in the Manila variety in Veracruz, Mexico were identified. The in vitro interaction of two species belonging to the complex was evaluated and the severity of the co-infection in mango branches. Lasiodiplodia pseudotheobromae and Pestalotiopsis mangiferae were identified as causal agents of mango dieback in the producing area of Veracruz. In coinfected mango branches, greater severity of necrosis was observed than in individual infections. Liquid culture filtrates applied in co-cultures showed different results for each species of phytopathogen. The P. mangiferae filtrate had no significant antagonistic effects on the growth of L. pseudotheobromae (inhibition of 2.68%), while the L. pseudotheobromae filtrate inhibited 41.38% of P. mangiferae. The results show that multiple infections in mango trees increase the damage caused by dieback, which could directly impact the development of control strategies.
Keywords: gummosis; virulence; interaction; fungal complex
El mango es un fruto que se consume en todo el mundo por su excepcional sabor, además, tiene propiedades antioxidantes, inmunomoduladoras, antialérgicas, antiinflamatorias, antitumorales, antidiabéticas, antiparasitarios, entre otras (Swaroop et al., 2018; Kim et al., 2021). Este frutal tropical es de importancia económica (Altendorf, 2019) y México es el principal país en exportación de mango a nivel mundial, siendo sus principales mercados: Estados Unidos, Canadá y Japón (SADER, 2020). Sin embargo, las enfermedades fúngicas son el principal problema fitosanitario en el cultivo afectando el rendimiento y calidad de la fruta (Elqassas y Abu-Naser, 2018). Una de las enfermedades importantes en los árboles de mango es la muerte descendente, la cual, es causada por diversas especies de hongos (Rodríguez-Gálvez et al., 2017). La incidencia de esta enfermedad presenta incrementos; en algunos países como Omán, se ha encontrado una incidencia de hasta el 89% (Al-Adawi et al., 2006), en Pakistán del 83.3% (Khaskheli et al., 2011) y en Perú de un 29% (Rodríguez-Gálvez et al., 2017). Sin embargo, en México no se han hecho reportes de la incidencia de la muerte descendente del mango, por lo tanto, se requieren estudios para conocer el estatus de esta enfermedad. Sandoval-Sánchez et al. (2013) señalan incidencias de la muerte descendente en mango y su asociación con algunos microorganismos fitopatógenos. El presente trabajo retoma esta premisa y abona conocimientos de esta enfermedad en mango Manila.
Los síntomas característicos de la muerte descendente en los árboles son gomosis, pudrición de ramas y tronco, decaimiento y clorosis en las hojas (Marques et al., 2013; Rodríguez-Gálvez et al., 2017). Las principales especies de hongos asociadas a la muerte descendente pertenecen a la familia Botryosphaeriaceae y recientemente Sporocadaceae (de-Oliveira et al., 2010; Li et al., 2021; Santos et al., 2021). El género dominante de la familia Botryosphaeriaceae es Lasiodiplodia, destacando a las especies: L. theobromae, L. pseudotheobromae, L. brasiliensis, L. iranensis, L. mahajangana y L. hormozganensis (Rodríguez-Gálvez et al., 2017). En la familia Sporocadaceae, destacan los géneros Pestalotiopsis y Neopestalotiopsis (Rodríguez-Gálvez et al., 2020; Santos et al., 2021). El control químico de esta enfermedad ha sido complejo, debido a que los hongos se encuentran en el xilema o parénquima de ramas y el tronco (Al-Saadoon et al., 2012; Fan et al., 2019).
Las coinfecciones son enfermedades causadas por múltiples fitopatógenos (Abdullah et al., 2017) y la muerte descendente puede ser originada por diversos hongos (Chen et al., 2012; Kwon et al., 2017; Marques et al., 2013). El efecto de las coinfecciones en plantas ha sido poco investigado debido a la complejidad de estos patosistemas, las evaluaciones realizadas se han centrado en la coinfección de virus-virus, bacterias-hongos y hongo-hongo (Tollenaere et al., 2016). Algunos estudios han demostrado que las coinfecciones fúngicas aumentan la prevalencia y severidad de las enfermedades y la producción de esporas (Fang et al., 2021; Susi et al., 2015). Sin embargo, puede haber inhibición de un fitopatógeno hacia otro (Orton y Brown 2016; Lerch-Olson y Robertson, 2020). La muerte descendente en arboles de mango ha sido ocasionada por especies de Lasiodiplodia y Pestalotiopsis, sin embargo, se desconoce el efecto de la coinfección de ambos fitopatógenos sobre la severidad de la enfermedad en ramas.
Por otra parte, diversas especies de Lasiodiplodia y Pestalotiopsis han sido estudiadas por diferentes industrias debido a que sus compuestos presentan efecto antimicrobiano, antinflamatorio, micotóxico, citotóxico, entre otros (Qian et al., 2021; Salvatore et al., 2020). Sin embargo, se desconoce el efecto que tienen estos compuestos sobre otros hongos fitopatógenos. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue aislar e identificar a los hongos fitopatógenos asociados a la muerte descendente de árboles de mango Manila, determinar su interacción in vitro y su efecto en la coinfección de ramas de Mangifera indica.
Materiales y métodos
Sitio de estudio
Se seleccionó una huerta comercial de mango var. Manila con una edad de la plantación de 40 años ubicada a una latitud 19° 30.161″ N y longitud 096° 35.460″ O en Actopan, Veracruz, México. Con un muestreo dirigido se seleccionaron 10 árboles con síntomas de muerte descendente (gomosis, pudrición de ramas y troncos). En ramas secundarias con grosor de 5 cm, se colectaron tres segmentos de 15 cm de cada árbol, para tener un total de 30 muestras. Las muestras se almacenaron en bolsas de plástico estériles para su posterior análisis.
Aislamiento de hongos y caracterización morfológica
Las 30 muestras colectadas fueron cortadas en astillas de 2 cm de largo, las cuales se desinfectaron en una solución de hipoclorito de sodio y agua al 1% v/v por 2 min, se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y se secaron en papel estéril. En placas con agar-papa-dextrosa (PDA) más ampicilina (40 mg mL-1) se sembraron dos astillas de cada muestra a una distancia de 3 cm de la parte central y se incubaron a 28 °C por 9 días. Los cultivos fúngicos monospóricos obtenidos fueron resembrados en PDA hasta obtener 40 cultivos puros. Los hongos fueron clasificados por morfología de la forma y color de la colonia y se obtuvieron 15 grupos para su identificación. Para observar las estructuras microscópicas e identificar los géneros de cada hongo, las placas se cultivaron intercalando luz blanca y negra por 12 h por 15 días. En las placas se observó la forma y color de micelio durante los días 1, 3, 5, 7 y 9. Las estructuras de los hongos fueron teñidas con azul de algodón (Jackson y Johnson-Cicalese, 1988) y examinadas con un microscopio de contraste de fases Estativo Axio Lab.A1 HAL 35, FL-LED, 5x H. Se utilizaron las claves taxonómicas de Clendenin (1896) y Maharachchikumbura et al. (2014), observando: color de picnidios (Lasiodiplodia), color y forma de conidiomas (Pestalotiopsis), forma y color de hifas, forma, color y tamaño de los conidios.
Identificación molecular
La identificación molecular de los hongos que presentaron mayor agresividad se realizó a partir de la extracción del ADN genómico de acuerdo con el protocolo de Lee (1990). Con el ADN genómico se amplificó: 1) La región del espaciador transcrito interno (ITS) del ADNr (grupo ITS1-5.8S-ITS2) con los cebadores ITS1F (5’ TCCGTAGGTCAACCTGCGG 3’) e ITS4 (5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) acorde a la metodología y condiciones de PCR descritas por Manter y Vivanco (2007) y 2) Un gen parcial de β-tubulina (benA) con los cebadores Bt-2a (5’ GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3’) y Bt-2b (5’ ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC 3’) acorde con la metodología y condiciones de PCR descritas por Úrbez-Torres et al. (2008). Los productos obtenidos se enviaron a secuenciar al Instituto Potosino A.C. (IPICYT). Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el software Cromas Pro1.7.6 y se comprobó la identidad con el sistema BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (National Center for Biotechnology Information). Las secuencias amplificadas del ITS y β-tubulina del ADNr fueron depositadas en el Gen Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Prueba de patogenicidad
La prueba de patogenicidad se realizó en ramas de mango var. Manila, obtenidas de una huerta comercial de reciente plantación libre de la enfermedad de muerte descendente ubicada en la localidad de Los Ídolos en Actopan, Veracruz, México. Se comprobó la sanidad de las ramas de manera visual y a través de siembras en medio PDA (Ver sección aislamiento y caracterización de los aislados). Adicionalmente se utilizaron ramas control inoculadas con medio PDA para descartar desarrollo de la enfermedad. Las ramas fueron cortadas en segmentos de 15 cm de largo y desinfectadas con alcohol al 70% por 30 s; posteriormente, fueron enjuagadas tres veces con agua estéril. De acuerdo con las características morfológicas del micelio los aislados se agruparon en 15 grupos. De los 15 grupos solo 5 del género Lasiodiplodia y 2 de Pestalotiopsis presentaron patogenicidad. En medio de cada rama de mango se realizó una herida con una aguja de disección y en cada herida se colocó un taquete micelial de 8 mm de diámetro de cada hongo previamente cultivado en placas con PDA por 7 días a 28 °C. Como control se inoculo en cada herida un taquete de medio PDA sin fitopatógeno. Las ramas se incubaron por 7 días en placas de vidrio a 28 °C con una humedad relativa de 70-80%. Se observó la presencia de necrosis y de goma en las ramas y se cuantificó el área de lesión (mm2) a los días: 1, 3, 5 y 7. Se determinó el porcentaje de incidencia (%I) a través de la fórmula: %I = x/N × 100, donde, x representa el número de ramas enfermas y N es el número total de ramas evaluadas. El experimento se realizó con un diseño experimental completamente al azar con cinco repeticiones. Los hongos fueron re-aislados en placas con PDA para confirmar los postulados de Koch.
Evaluación del crecimiento in vitro por técnica de cultivo dual
Las pruebas in vitro fueron realizadas con la cepa S10 de L. pseudotheobromae y MN2 de P. mangiferae, que fueron las de mayor virulencia en la prueba de patogenicidad. La evaluación in vitro se realizó de acuerdo con el protocolo modificado de Lawrence et al., (2018). Los hongos fueron sembrados en placas con PDA por siete días a 28 °C. En observaciones previas se encontró diferencias en la velocidad de crecimiento de ambos fitopatógenos, por lo tanto, se plantearon dos experimentos. El primero, consistió en sembrar dos taquetes de 8 mm de P. mangiferae MN2 en la parte lateral de cada placa con PDA y se incubaron por dos días a 28 °C; posteriormente, se inocularon dos taquetes de 8 mm de L. pseudotheobromae S10 a 2 cm de la colonia de P. mangiferae MN2 y se incubaron por nueve días a 28 °C. El segundo experimento consistió en realizar la inoculación de manera simultánea de dos taquetes de 8 mm de ambos fitopatógenos en la misma placa con PDA. Como control los hongos fueron sembrados individualmente y un grupo de placas fueron inoculadas con un taquete de medio PDA sin fitopatógeno. Las placas se incubaron por 9 días a 28 °C. En los días 1, 3, 5 ,7 y 9 se observó la coloración del micelio en ambos hongos y en P. mangiferae MN2 la presencia de conidiomas. En el microscopio estereoscópico se observó si existía cruzamiento entre hifas o un halo de inhibición entre ellas. Se realizaron cuatro repeticiones de cada tratamiento con un diseño experimental completamente al azar.
Evaluación de filtrados fúngicos de L. pseudotheobromae y P. mangiferae
Para conocer el efecto de los filtrados fúngicos sobre el crecimiento de P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10 se realizó el protocolo de Naglot et al. (2015) y Hajieghrari et al. (2008). Los hongos por separado fueron cultivados en caldo papa dextrosa en un agitador a 150 rpm por 14 días a 28 °C. El medio de cultivo fue centrifugado a 6,000 rpm por 30 min y posteriormente fue filtrado a través de una membrana (Whatman) estéril de 0,20 μm. Se prepararon placas con medio PDA más los filtrados de cada fitopatógeno a una concentración del 50% vol/vol. Los hongos fueron previamente sembrados en placas con PDA por siete días a 28 °C. Las placas que contenían el filtrado de L. pseudotheobromae S10 fueron inoculadas con un taquete de 8 mm en la parte central con P. mangiferae MN2. Las placas con el filtrado de P. mangiferae MN2 fueron inoculadas con un taquete de 8 mm en la parte central con L. pseudotheobromae S10. Como control se inocularon los hongos en forma individual en medio PDA y como control absoluto se inoculo un taquete de PDA en las placas con PDA que contenían el filtrado de cada hongo. Las placas se incubaron por 9 días a 28 °C. Se realizaron cuatro repeticiones por tratamiento y se utilizó un diseño experimental completamente al azar. Se observó la coloración del micelio y en el caso de P. mangiferae MN2 la presencia de conidiomas. El porcentaje de inhibición (I) se midió de acuerdo a la fórmula de Singh (2006): I = (C-t)/C × 100, donde C representa el diámetro de la colonia control y t el diámetro de la colonia con filtrado.
Coinfección de los hongos en ramas de mango
El efecto de las coinfecciones en ramas se realizó con el protocolo de Lawrence et al. (2018) con modificaciones. P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10 fueron previamente sembrados en placas con PDA por 7 días a 28 °C. Las ramas fueron cortadas en segmentos de 15 cm de largo, la superficie fue desinfectada con alcohol al 70% por 30 s y enjuagadas tres veces con agua estéril. En la parte central de cada rama con una aguja estéril se realizaron dos heridas separadas por 2 cm. En la primera herida se colocó un taquete micelial de 8 mm de diámetro de P. mangiferae MN2, y en la segunda un taquete micelial de 8 mm de diámetro de L. pseudotheobromae S10. Para efectos de controles se incluyeron tratamientos de ramas inoculadas solo con cada hongo y otro inoculado solo con taquetes de medio PDA sin fitopatógeno. Las ramas se incubaron por siete días a 28 °C y una humedad relativa de 70-80%. Se realizaron cinco repeticiones por cada tratamiento con un diseño experimental completamente al azar. Se observó la presencia de necrosis y de goma en la rama y se cuantificó el área de lesión (mm2) a través del programa ImageJ. Los hongos fueron re-aislados en placas con PDA para confirmar los postulados de Koch.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se estimaron a través de las medias y desviaciones estándar mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando software estadístico SPSS Los datos analizados fueron área de lesión y porcentaje de inhibición. Las diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre las medias se determinaron mediante la prueba post hoc Tukey’s.
Resultados
Aislamiento e identificación morfológica de hongos
Se obtuvieron 40 aislamientos y se formaron 15 grupos de hongos de los árboles muestreados con síntomas de muerte descendente (Figura 1A-C). Se caracterizó un representante de cada grupo dando como resultado 13 de género Lasiodiplodia y dos de Pestalotiopsis. De acuerdo con el nivel de agresividad, fueron seleccionados siete aislamientos para la identificación morfológica: cinco pertenecientes a la especie L. pseudotheobromae y dos a la especie P. mangiferae. Las características morfológicas observadas de cada hongo fueron las siguientes:
Los cinco aislamientos de L. pseudotheobromae en los primeros tres días presentaron micelio algodonoso de color blanco (Figura 2D), en el cuarto día el micelio se pigmentó color grisáceo y a partir del día siete la coloración cambio a grisáceo negro (Figura 2E). Al exponer las placas en luz blanca y negra se formaron picnidios color marrón obscuro. Las hifas fueron filamentosas, septadas, constrictivas en el tabique y color marrón obscuro. Los conidios fueron elipsoidales, ápice y base redondeada, con dos septos color marrón obscuro, con un tamaño promedio (N=100) de 23.4 μm de largo × 14.25 μm de ancho (Figura 2F). De acuerdo con las claves taxonómicas de Clendenin (1896) los cinco aislamientos fueron identificados como L. pseudotheobromae.
Figura 1 Síntomas de la muerte descendente en árboles de mango var. Manila y caracterización morfológica de Lasiodiplodia pseudotheobromae y Pestalotiopsis mangiferae A) Pudrición en ramas (pr), B) Pudrición de tronco (pt), C) Gomosis (g), D) Crecimiento micelial de L. pseudotheobromae blanco algodonosos, E) Crecimiento micelar de L. pseudotheobromae grisáceo negro, F) Conidios marrón obscuro de L. pseudotheobromae (100x), G) Crecimiento micelial blanco algodonoso de P. mangiferae, H) Presencia de conidiomas de P. mangiferae e I) Conidios color marrón obscuro-negro P. mangiferae (100x).
Figura 2 Crecimiento micelial durante la técnica de inoculación dual de Lasiodiplodia pseudotheobromae y Pestalotiopsis mangiferae e interacción de hifas. A) Pestalotiopsis mangiferae MN2, B) Lasiodiplodia pseudotheobromae S10, C) P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10, D) Cruzamiento de hifas de P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10 inoculada dos días después, E) Cruzamiento de hifas de P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10 e F) Interacción P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10 inoculada dos días después.
Por otra parte, al intercalar luz blanca y negra el crecimiento micelial de P. mangiferae desde el día uno al siete fue irregular algodonoso y difuso con una coloración blanca (Figura 2G). Antes de mostrar los conidiomas se desarrolló en el micelio una coloración crema. En el día nueve se presentaron conidiomas negros picnidiales y globosas (Figura 2H) e hifas hialinas y septadas. Los conidios color marrón indistintos de forma elipsoide ligeramente curvada con 4 septos y entre 2-3 flagelos. El promedio del tamaño de conidios fue de 26.5 μm de largo × 7.2 μm de ancho (Figura 2I). De acuerdo con las claves taxonómicas de Maharachchikumbura et al. (2014) los dos aislamientos se identificaron como P. mangiferae.
Las secuencias de las regiones ITS y β-tubulina de tres aislamientos de Lasiodiplodia, así como una secuencia ITS de Pestalotiopsis fueron depositadas en el GenBank. L. pseudotheobromae S10 (MH181156, OL988629), L. pseudotheobromae SN (MH179101, OL988630) y Lasiodiplodia II3 (OK648476, OL988631) y Pestalotiopsis mangiferae MN2 (MH179308). Las amplificaciones resultantes fueron de 550 pb para el ITS y 430 pb para la β-tubulina y el análisis de las secuencias en la base de datos del GenBank identificaron a las especies Lasiodiplodia pseudotheobromae y Pestalotiopsis mangiferae en las regiones ITS en un 100% y β-tubulina en un 99%. De acuerdo con las características morfológicas y moleculares se identificó a Lasiodiplodia pseudotheobromae y Pestalotiopsis mangiferae.
Pruebas de patogenicidad
Se observó después de siete días necrosis y gomosis en las ramas de mango inoculadas con L. pseudotheobromae y P. mangiferae. Se observaron diferencias significativas (P< 0.05) en el área de lesión de las ramas inoculadas con cada fitopatógeno (Cuadro 1). El aislamiento S10 de L. pseudotheobromae en el día siete presentó la mayor agresividad en comparación con el resto de los aislamientos, generando un área de lesión de 28.22 mm2. El aislamiento MN2 de P. mangiferae presentó un área mayor de lesión de 8.44 mm2 en comparación al aislado SN1. Los aislados SN, LB2, S10 y II3 del género Lasiodiplodia causaron mayor área de lesión en comparación con los dos de Pestalotiopsis. El porcentaje de incidencia de la enfermedad fue del 100% en todas las ramas inoculadas con ambos fitopatógenos. De las ramas fueron re-aislados a L. pseudotheobromae y P. mangiferae, confirmando los postulados de Koch.
Cuadro 1 Área de lesión de ramas de mango var. Manila inoculadas con aislamientos de L. pseudotheobromae y P. mangiferae.
| Aislamiento | Incidencia (%) | Día 1 | Día 3 | Día 5 | Día 7 |
|---|---|---|---|---|---|
| Área de lesión (mm2)y | |||||
| L. pseudotheobromae SN | 100 | 3.77±0.5 dz | 7±0.88cdz | 12.77±0.83cz | 21.55±0.5dz |
| L. pseudotheobromae LB2 | 100 | 2.44±0.38c | 6.33±0.88c | 10.11±0.50b | 17.33±0.57c |
| L. pseudotheobromae S10 | 100 | 5.66±0.66 e | 8.27±0.58d | 15.44±0.83d | 28.22±1.7e |
| L. pseudotheobromae AA | 100 | 0.88±0.38a | 1.56±0.32a | 2.27±0.9a | 3.33±0.4a |
| L. pseudotheobromae II3 | 100 | 2.44±0.38c | 3.46±0.17b | 8.22±0.5b | 19.22±0.5cd |
| P. mangiferae MN2 | 100 | 2.33±0.33 c | 2.78±0.1ab | 4.22±1.5a | 8.44±1b |
| P. mangiferae SN1 | 100 | 1.5 ±0.29 b | 2.1±0.2 ab | 2.56±0.6a | 3.86±0.4a |
y Cada valor representa la media ± desviación estándar. z Medias con letras distintas en cada columna son estadísticamente diferentes (Tukey, p≤0.05).
Evaluación del crecimiento in vitro por técnica de cultivo dual
Los resultados del tratamiento de inoculación dual no presentaron diferencias en la coloración del micelio de P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10. Se observó en el séptimo día la presencia de conidiomas en P. mangiferae MN2 cuando se inoculo dos días antes que L. pseudotheobromae, las inoculaciones individuales no presentaron las estructuras. En las placas inoculadas dos días después se observó un auto emparejamiento en el crecimiento de ambos hongos. En las microfotografías se observó un cruzamiento entre las hifas de ambas especies (Figura 2E-F). No se observaron halos de inhibición en la zona de contacto entre P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10 (Figura 2A-D).
Evaluación in vitro de filtrados fúngicos
El porcentaje de inhibición de P. mangiferae MN2 y L. pseudotheobromae S10 presentó diferencias significativas (P< 0.05) entre los tratamientos. Durante el crecimiento de ambos hongos no se observaron cambios en la coloración del micelio. P. mangiferae MN2 no presentó conidiomas. El filtrado de L. pseudotheobromae S10 inhibió el crecimiento de P. mangiferae MN2 en 41.38%. El porcentaje de inhibición del filtrado de P. mangiferae MN2 sobre el crecimiento de L. pseudotheobromae S10 fue de 2.68%.
Coinfección de Lasiodiplodia pseudotheobromae y Pestalotiopsis mangiferae en ramas de mango
Se observó gomosis y necrosis en las ramas de mango inoculadas con L. pseudotheobromae S10 y P. mangiferae MN2 (Figura 3). Entre los tratamientos de coinfección e infección individual se presentaron diferencias significativas en área de lesión. En la coinfección el área de lesión fue mayor en comparación cuando fueron inoculaciones individuales (Cuadro 2). En la coinfección se ve de manera clara el aumento en el área de lesión aumenta significativamente. Las ramas control no presentaron área de lesión, no se observó la presencia de gomosis síntoma característico de la muerte descendente. A partir de cada rama se obtuvo tejido necrosado y fueron re-aisladas las especies de L. pseudotheobromae S10 y P. mangiferae MN2, confirmando los postulados de Koch.
Discusión
El hongo Lasiodiplodia pseudotheobromae ha sido reportado como el agente causal de la muerte descendente en mango de manera individual y en forma de complejos en diversas partes del mundo como: Brasil, Egipto, Perú, Corea, Australia, entre otros (Sakalidis et al., 2011; Ismail et al., 2012; Kwon et al., 2017; Rodríguez-Gálvez et al., 2017). En México, la presencia de L. pseudotheobromae, se ha asociado a la muerte de árboles de mango en las variedades Tommy Atkins y Ataulfo en Colima, Guerrero, Jalisco y Michoacán (Sandoval-Sánchez et al., 2013). Este estudio reporta por primera vez a L. pseudotheobromae en árboles de mango var. Manila con síntomas de muerte descendente en Veracruz. Por otra parte, en los últimos años la importancia del género Pestalotiopsis se ha incrementado debido a los daños que ocasiona en plantas como melocotón y arándanos (Chen et al., 2012; Borrero et al., 2018; Rodríguez-Gálvez et al., 2020). En mango, P. mangiferae se ha asociado con la mancha foliar (Rakesh et al., 2020), sin embargo, hasta el momento no ha sido reportado como parte del complejo causante de la muerte descendente, a diferencia de otras especies del género como P. theae (de-Oliveira et al., 2010; Sandoval-Sánchez et al., 2013). Nuestro estudio aporta el primer reporte de P. mangiferae como parte del complejo causante de la muerte descendente en el cultivo de mango var. Manila.
Cuadro 2 Coinfección de Pestalotiopsis mangiferae MN2 y Lasiodiplodia pseudotheobromae S10 en ramas después de 5 días.
| Tratamiento | Área de lesión (mm2)y |
|---|---|
| Control (PDA) | 0.0±0.1a |
| L. pseudotheobromae S10 individual | 24.7±3.7b |
| P. mangiferae MN2 individual | 2.7±1.2a |
| L. pseudotheobromae S10+ | |
| P. mangiferae MN2 coinfección | 39.3±2.5c |
y Cada valor representa la media ± deviación estándar. z Medias con letras distintas son estadísticamente diferentes (Tukey, p≤0.05).
En los diferentes ecosistemas las plantas interactúan con múltiples grupos de microorganismos incluyendo a los hongos fitopatógenos, los cuales, interactúan entre sí formando diferentes relaciones ecológicas (Liu et al., 2019). Aunque existen diversos reportes sobre hongos fitopatógenos que se asocian para formar complejos y causar enfermedades en diversos cultivos, poco se conoce acerca de su interacción y el efecto entre ellos sobre su crecimiento (Abdullah et al., 2017; 2018). Los resultados de este estudio del cultivo dual sugieren una interacción neutral L. pseudotheobromae y P. mangiferae, al observarse cruzamiento de hifas y no un área de antagonismo, coincidiendo los resultados con lo reportado durante la interacción entre Seimatosporium vitifusiforme y Diplodia seriata en la vid (Lawrence et al., 2018). La interacción entre hongos en un espacio y tiempo definido podría dar origen a la formación de complejos que causan enfermedades en diversas plantas incluyendo la muerte descendente en mango (Junaid et al., 2020).
Diversos hongos fitopatógenos producen compuestos antifúngicos como fenoles, terpenos y flavonoides capaces de inhibir el crecimiento de diversos microorganismos incluidos los hongos lo que se ha utilizado como estrategia biotecnológica de control (Nalin et al., 2019; Reveglia et al., 2020). En nuestro estudio, el filtrado de L. pseudotheobromae S1O inhibió significativamente a P. mangiferae MN2. Existen diversos reportes donde especies del género Lasiodiplodia producen melleína, compuesto fenólico antifúngico que provoca lisis celular, inhibiendo la germinación de conidios y el crecimiento micelial de diversos hongos (Qian et al., 2014; Cimmino et al., 2017; Morales-Sánchez et al., 2021), como Botrytis cinerea, Fulvia fulva y Lasiodiplodia theobromae (Wang et al., 2014; Abro et al., 2019). Los estudios de los filtrados de hongos enfocados al control de fitopatógenos pueden ser una alterativa si se caracterizan sus compuestos activos, producción metabólica, su capacidad fungicida y/o fungistático, entre otros (Pradeep et al., 2013). Esto resulta de especial atención, pues en los cultivos duales no se observó ningún aspecto de antagonismo, esto podría atribuirse un aumento en la producción de metabolitos antifúngicos en medio de cultivo líquido en comparación de solido como se ha observado en otras especies (Pradeep et al., 2013). Otra probable explicación podría añadirse a la disminución o supresión de metabolitos de L. pseudotheobromae cuando reconoce a P. mangiferae. Así mismo el desarrollo en medio sólido y en ramas fue el mismo corroborando la interacción entre ambas especies. Esta investigación abre una oportunidad para abordar los metabolitos secundarios producidos durante la interacción con diversas especies causantes de la enfermedad de la muerte descendente.
En los últimos años, diversos estudios se han enfocado a investigar las enfermedades vegetales provocadas por co-infecciones de hongos fitopatógenos y sus interacciones con el hospedero (Susi et al., 2015; Lerch-Olson y Robertson, 2020; Hoffmann et al., 2021). Las ramas de mango co-inoculadas con L. pseudotheobromae y P. mangiferae presentaron una mayor severidad de la muerte descendente en conjunto en comparación con las infecciones individuales. Las interacciones fúngicas son complejas e involucran procesos de mutualismo, antagonismo, coexistencia, entre otros (Fang et al., 2021). Además, la severidad de las enfermedades provocadas por co-infecciones de fitopatógenos depende de diversos factores, destacando la tasa de crecimiento, virulencia, producción de metabolitos, interacción, hospedero, entre otros (Müller et al., 2012; Boddy, 2016; Luo et al., 2017). A futuro se propone investigar el patosistema hongos-hospedero y desarrollar estrategias de manejo integrado de la muerte descendente.
Conclusiones
Este estudio aporta el primer reporte de los agentes causales asociados a la muerte descendente en mango var. Manila en el estado de Veracruz. A partir de los resultados obtenidos en campo y en laboratorio, se identificó de manera morfológica y molecular a Lasiodiplodia pseudotheobromae y Pestalotiopsis mangiferae. En la co-infección el área de lesión de la enfermedad fue mayor en las ramas co-inoculadas con L. pseudotheobromae y P. mangiferae, en comparación con las infecciones individuales. Los filtrados de P. mangiferae no tuvieron efecto sobre el crecimiento de L. pseudotheobromae, mientras que los filtrados de L. pseudotheobromae tuvieron un efecto inhibitorio en el crecimiento de P. mangiferae.
Agradecimientos
Se agradece al Sistema Producto Mango del estado de Veracruz en particular al Ing. Guillermo Palmeros Marín. A la Universidad Veracruzana por el financiamiento de este proyecto a través de la Agenda 2030 para el Desarrollo Sostenible de la ONU con el proyecto “Alternativas para el manejo de la producción a través del control biológico de hongos fitopatógenos causantes del declive de árboles de mango en Actopan, Veracruz”. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca otorgada número 764501.
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Recibido: 17 de Marzo de 2022; Aprobado: 02 de Junio de 2022
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