Estrategia

En muchas plantas de cultivo como maíz, frijol, jitomate (^{Hirsch y Buell, 2013}), entre otros, ha sido posible la determinación de la secuencia genómica completa para realizar análisis genéticos. Sin embargo, A. tequilana tiene un contenido genómico de casi dos veces el tamaño (4000Mb) (^{Palomino et al., 2007}) que el del maíz y el desarrollo y la construcción de su secuencia genómica completa sigue siendo un desafío técnico. Por lo tanto, nuestra estrategia inicial fue desarrollar métodos para el análisis del transcriptoma (RNAseq) en especies de agave. El análisis del transcriptoma ofrece la ventaja de que la necesidad de generar y procesar menos datos, reduce los costos. Además, los datos se pueden asociar con tipos de tejidos o etapas de desarrollo, proporcionando información sobre los niveles de expresión de genes específicos bajo ciertas condiciones específicas. Nosotros hemos generado datos transcriptómicos para A. tequilana, A. deserti, A. striata y A. victoria-reginae (^{Ávila de Dios et al., 2015}). Con esta información hemos identificado, clonado y caracterizado los ADNc (secuencias codificantes) responsables de la regulación del metabolismo de los fructanos y algunos miembros de una familia de genes involucrados en la regulación del tiempo de floración en A. tequilana.

Se identificaron un total de 15 genes implicados en el metabolismo de fructanos/sacarosa y se clasificaron como enzimas codificantes para la síntesis de fructanos, enzimas de degradación de fructanos o invertasas. La transformación genética de las especies de agave es todavía muy laboriosa e ineficiente, por lo tanto, se han utilizado sistemas heterólogos como Pichia pastoris y Arabidopsis thaliana para caracterizar funcionalmente los genes/enzimas identificados. Los patrones de expresión in silico basados en datos transcriptómicos indican cuales genes se expresan en tejidos específicos o durante etapas de desarrollo específicas, indicando su importancia relativa en diferentes procesos o en el metabolismo. Basados en estos datos, hemos determinado y comparado los patrones de expresión de cada uno de los genes del metabolismo de los fructanos. La mayoría de estos patrones de expresión in silico han sido confirmados por qRT-PCR (^{Ávila de Dios et al., 2019}, ^{Pérez-López et al., 2021}).

Empleando una estrategia similar, con base en patrones de expresión in silico, se identificaron también en A. tequilana genes de varias familias que se sabe que están involucradas en la regulación del tiempo de floración en el sistema modelo A. thaliana (FT, metabolismo de giberelinas, factores MYB). Se propuso un modelo de trabajo para la regulación de la floración en A. tequilana (^{Ávila de Dios et al., 2019}). Actualmente se está caracterizando funcionalmente a detalle la familia A. tequilana FT.

Un ejemplo de análisis ómico preliminar en Colletotrichum lindemuthianum

El patosistema C. lindemuthianum - frijol común implica una interacción gen por gen entre los genes de resistencia (R) en los cultivares hospedantes de frijol común y los genes de avirulencia (avr) en el patógeno fúngico. En trabajos previos de nuestro grupo identificamos muchas razas distintas de C. lindemuthianum basados en las series diferenciales de cultivares de frijol común (^{González et al., 1998}; ^{Mendoza et al., 2001}; ^{Rodríguez-Guerra et al., 2003}; ^{González-Chavira et al., 2004}). Nosotros iniciamos una estrategia de análisis transcriptómico para comparar los patrones diferenciales de expresión génica en las primeras etapas de la infección en el cultivar de frijol común BAT93 inoculado con una raza virulenta o no virulenta (Raza 1088 y Raza 256 respectivamente) de C. lindemuthianum (Figura 1 y Cuadro 1). Los detalles de la estrategia experimental se muestran en el Cuadro 2. RNAseq se llevó a cabo en muestras de cada punto temporal (se agruparon muestras de 4 a 96 horas) (Cuadro 3) y los datos se analizaron y compararon para eventualmente identificar genes expresados diferencialmente durante interacciones compatibles e incompatibles (Medina-Chávez y Simpson sin publicar).

Figura 1 Análisis microscópico 7 días después de la inoculación de plántulas de frijol común con Colletotrichum lindemuthianum. En el cuadrante superior izquierdo se observa la formación de estructuras reproductivas (acérvulos) por parte del patógeno en las interacciones compatibles para ambos cultivares con la cepa 1088. Del lado derecho se muestra una gran cantidad de conidios y apresorios en la misma cepa. En las interacciones con la cepa 256 se observa gran cantidad de hifas del cultivar Victoria así como la presencia de conidios jóvenes sobre el tejido necrótico de la planta, mientras que, en el cultivar BAT 93 se observan reacciones de hipersensibilidad provocadas por la respuesta de defensa, incluyendo muerte localizada de células en contacto con el patógeno. 

En conclusión, los análisis genómicos y transcriptómicos son actualmente herramientas esenciales y rentables para el análisis genético y pueden ser fácilmente aplicables a las plantas y/o sus patógenos. El patosistema P. vulgaris-C. lindemuthianum es particularmente susceptible a este tipo de análisis dada la bien documentada serie de cultivares diferenciales y sus correspondientes razas de C. lindemuthianum. Los estudios recientes y el análisis en curso de varios genomas de P. vulgaris (^{Rendón-Anaya et al., 2017}) facilitarán enormemente esta investigación.