Bioensayos

Preparación de las plantas de tabaco y fuente de inóculo. Cuando las plantas de nicotiana presentaron cinco hojas completamente desarrolladas se seleccionaron 2 o 3 hojas del estrato medio y en cada una de ellas se marcó un rectángulo con un marcador de tinta indeleble y se midió la base y altura con ayuda de una regla para obtener así el área. La unidad experimental fue el área delimitada por el rectángulo marcado y por cada tratamiento evaluado (Cuadro 1), se utilizaron cinco rectángulos. Cada hoja fue etiquetada con números progresivos. Inmediatamente después se preparó un macerado de tejido infectado de ToBRFV en buffer de fosfatos pH 7.0, y el macerado se dividió en partes iguales para inocular N. rustica y N. benthamiana, respectivamente.

Desinfección de navajas e inoculación mecánica. Las áreas marcadas de las hojas a inocular se espolvorearon con carborundum 400 mallas y la navaja estéril se sumergió durante cinco segundos en el macerado de la fuente de inóculo o en macerado vegetal sano. Posteriormente, se sumergió la navaja de bisturí en un vaso de precipitado estéril con el tratamiento correspondiente (Cuadro 1) durante 30 segundos (inmersión) o se asperjó con ayuda de un atomizador por ambas caras de la navaja (aspersión), e inmediatamente después se frotó la superficie del rectángulo marcado en la hoja con la navaja. En el caso de las hojas tratadas simultáneamente con hipoclorito de sodio y leche, primero se sumergió o asperjó con hipoclorito de sodio e inmediatamente después con la leche. Como testigo positivo, se utilizó una navaja que se sumergió o asperjó solo con agua destilada estéril después de ser sumergida en el macerado infectivo. Como testigo negativo, la navaja fue sumergida en el macerado de una planta sana y posteriormente sumergida o asperjada con agua destilada estéril. Las hojas inoculadas se enjuagaron con agua estéril para eliminar el carborundum. Para cada tratamiento evaluado, se utilizaron diferentes navajas estériles.

Evaluación y análisis de datos. Las lesiones locales cloróticas en el rectángulo delimitado en cada hoja (lesiones locales/cm² =LC/cm²) se contabilizaron desde los cinco días después de la inoculación (ddi) y hasta los 8 ddi. Las plantas utilizadas para los tratamientos se mantuvieron en el invernadero hasta su floración para registrar la aparición de síntomas sistémicos. Con las LC/cm² se realizó un análisis no paramétrico de comparación de medias mediante una prueba de Kruskal Wallis, se consideró un α≤0.05 para la significancia estadística. Los datos fueron analizados en el programa de JMP de SAS^®.

Las plantas de jitomate utilizadas como fuente de inóculo amplificaron el fragmento esperado de 450 pb y su secuencia tuvo una similitud del 95% con Tomato brown rugose fruit virus isolate CA18-01 (Sequence ID: MT002973.1).

Bioensayos. Para N. rustica, la prueba de Kruskal Wallis mostró diferencia significativa entre los tratamientos (Ji< 0.0001). Los mejores fueron el hipoclorito de sodio al 3% seguido de la leche en polvo tanto en inmersión como asperjado. Estos dos tratamientos se comportaron igual al testigo negativo (Cuadro 2). El tratamiento con el mayor número de LC/cm² fue el alcohol etílico al 70% en inmersión, con valores superiores a los del testigo positivo (Cuadro 2). El hipoclorito de sodio y la leche en polvo, aplicados de manera individual, tuvieron una reducción del 99 al 96% del número de lesiones locales, respectivamente, con relación al testigo positivo; mientras que el jabón líquido en inmersión y el alcohol etílico al 70% en aspersión, redujeron la aparición de lesiones locales en 85 y 83%, respectivamente. En el caso de las sales cuaternarias de amonio se tuvo una reducción en el número de lesiones locales del 30%.

Para N. benthamiana, la prueba de Kruskal Wallis mostró diferencias significativas entre los tratamientos (Ji< .0001). El hipoclorito de sodio al 3% seguido de la leche en polvo, la leche en polvo y las sales cuaternarias de amonio, aplicados por aspersión, fueron los tratamientos con menos lesiones locales que se comportaron igual que el testigo negativo. Caso contrario, el alcohol etílico al 96% tuvo el mayor número de lesiones locales, pero por debajo del testigo positivo (Cuadro 2).

El hipoclorito de sodio al 3% aplicado por aspersión redujo en un 99% las LC/cm², mientras que su aplicación en inmersión redujo el 94%, comparado con el promedio del testigo positivo. El jabón líquido comercial aplicado por aspersión e inmersión redujo en 91 y 97%, respectivamente, el número de LC/cm². La leche en polvo aplicada por inmersión redujo en 87% la aparición de LC/cm². De manera general, se observó que la aplicación por aspersión fue más efectiva que por inmersión. Probablemente el efecto que tiene la presión con la que sale disparado el tratamiento del propio aspersor, favorezca la “limpieza” de la navaja y se eliminen más partículas virales.

En N. benthamiana y N. rustica las lesiones locales cloróticas aparecieron entre los cuatro y seis días después de la inoculación. Posteriormente, las lesiones cloróticas se necrosaron y coalescieron (Figura 1 y 2). La aparición de síntomas sistémicos (clorosis severa y mosaico) se registró a los 15 ddi en los tratamientos cuyo número de LC/cm² fue mayor y en las plantas tratadas que tuvieron menos LC/cm² se registró la aparición de síntomas entre los 20 y 23 ddi. Solamente en los tratamientos que tuvieron 0 LC/cm², incluyendo los testigos negativos, no se observaron síntomas sistémicos.

Figura 1 Lesiones locales cloróticas y necróticas en hojas de Nicotiana rustica (flechas) ocasionadas por ToBRFV después de 13 días de la inoculación con navajas tratadas con diferentes desinfectantes. 

Las dosis de las sales cuaternarias de amonio aplicadas en los tratamientos de la presente investigación exceden la recomendada por el fabricante como “viricida” (0.5 L/400 L de agua =0.125%); sin embargo, no logró evitar la aparición de lesiones locales ni de síntomas sistémicos. Si bien el espectro de acción de los compuestos de amonio cuaternario es muy amplio presentando actividad desinfectante sobre bacterias y hongos, se sabe que funciona mejor en virus envueltos en una capa lipídica (^{Diomedi et al., 2017}). Tanto las sales cuaternarias de amonio como el alcohol etílico son ampliamente recomendados para eliminar virus; sin embargo, en este estudio y en el realizado por ^{Chanda y colaboradores (2021}), los tratamientos con sales cuaternarias y alcohol no fueron efectivos para evitar la transmisión del ToBRFV, probablemente debido a la naturaleza de la cubierta proteica de los tobamovirus que carece de capa lipídica (^{Luria et al., 2017}).

Figura 2 Lesiones locales cloróticas y necróticas en hojas de Nicotiana benthamiana (flechas) ocasionadas por ToBRFV después de 12 días de la inoculación con navajas tratadas con diferentes desinfectantes. 

Respecto al jabón, se ha documentado el efecto de detergentes en la estabilidad de los virus, y se sabe que depende ampliamente de su pH (^{Ward y Ashley, 1979}) y de la conformación de la cubierta de la cápside. En virus con cubierta lipídica, como el SARS-CoV-2, el uso de jabones ha sido ampliamente recomendado (^{Welch et al., 2020}). El ToBRFV carece de membrana lipídica, y aunque el jabón redujo el número de lesiones no evitó la aparición de síntomas sistémicos.

En el caso del hipoclorito de sodio al 3% es efectivo para evitar la transmisión de virus y no genera fitotoxicidad (^{Chanda et al., 2021}). El cloro es uno de los desinfectantes de eficiencia intermedia ya que se inactiva drásticamente ante la presencia de materia orgánica (^{Vignoli, 2006}). Por esta razón como tratamiento independiente, no es tan efectivo aplicado por inmersión de la herramienta debido a la acumulación de materia orgánica que se va generando en el recipiente y, si bien, aplicado por aspersión mostró buenos resultados, no impidió la aparición de síntomas sistémicos.

Recientemente se demostró que la lactoferrina fue efectiva para evitar la infección de ToBRFV y del Cucumber green mottle mosaic virus, ya que probablemente esta glicoproteína se una al receptor celular que utiliza el virus (^{Chanda et al., 2021}). Es posible que las proteínas de la leche utilizadas en este trabajo tengan una función similar a la lactoferrina, la lisozima y la lactoperoxidasa, entre otras (^{Rodríguez et al., 2005}) y, por tanto, se unan a los receptores celulares de la partícula viral, impidiendo que se adhiera a la célula hospedante y se desencadene el proceso de infección celular. Por otro lado, se ha demostrado que la aplicación de la leche sin grasa reconstituida puede ser muy efectiva para reducir la actividad del Tobacco mosaic virus sobre superficies vegetales, herramientas y ropa (^{Chase, 2014}). Se ha visto que sumergir las herramientas en la leche no es efectivo, por lo cual debe asperjarse y que, en algunas ocasiones, el tratamiento puede funcionar hasta 10 días después de su aplicación, siempre y cuando no haya lavado (^{Chase, 2014}). Sin embargo, el inconveniente de aplicarla directamente sobre las plantas es que puede favorecer el desarrollo de fumagina; además no existe algún lineamiento que permita o no el uso de leche para controlar virus (^{Chase, 2014}).

Bajo las condiciones realizadas en esta investigación, el tratamiento que evitó la aparición de síntomas sistémicos en ambas especies de Nicotiana fue la combinación del hipoclorito de sodio al 3% y la posterior aplicación de leche (Svelty^®) al 6%, cada uno contenido en recipientes individuales y asperjados por ambos lados de la navaja en el orden en que son mencionados. Es importante mantener en recipientes separados el hipoclorito de sodio y la leche, y aplicar primero el hipoclorito de sodio y después la leche, ya que la leche podría inactivar el efecto del hipoclorito de sodio. Es necesario estudiar si el hipoclorito al 3% actúa primero sobre los viriones y posteriormente, las proteínas de la leche inactivan las partículas virales infectivas que hayan quedado. También es importante corroborar si el hipoclorito de sodio al 3% y la leche al 6% tiene la misma efectividad sobre las herramientas de corte que se utilizan en los cultivos de chile o jitomate.

En conclusión, aunque la mayoría de los desinfectantes redujeron significativamente las lesiones locales, solo la aspersión de hipoclorito de sodio al 3% seguida de la aspersión de leche en polvo al 6% a la navaja, evitó la transmisión mecánica del Tomato brown rugose fruit virus en N. benthamiana y N. rustica.