Bipolaris sorokiniana es un patógeno de cereales tales como el trigo (Triticum turgidum) y la cebada (Hordeum vulgare) y causante de pudrición de raíz, tizón foliar, tizón de la plántula y mancha borrosa. Esta enfermedad afecta la germinación de la semilla y la emergencia de la plántula, generando una reducción considerable en el rendimiento, de hasta 85% (^{Mehta, 2014}). En la actualidad, el manejo de las enfermedades causadas por B. sorokiniana es llevado a cabo a través de la aplicación foliar de disruptores de la biosíntesis de ergosterol del grupo triazol, a pesar de reportes de efectos dañinos tales como la contaminación del suelo, la inhibición de organismos que no son objetivos y citotoxicidad humana (^{Villa-Rodríguez et al., 2019}). Además, esta estrategia no es solo tóxica para humanos, sino también para el ambiente y resulta en un desbalance de la comunidad microbiana del suelo y un rápido aumento en la propagación de genes de resistencia (^{Ahmad et al., 2018}). Así, las alternativas sustentables a la aplicación de fungicidas sintéticos son decisivas para el control de fitopatógenos, tales como la aplicación de agentes de control biológicos.

Hoy en día, los agentes de control biológicos más estudiados, producidos y comercializados son las especies de Bacillus, debido a su alta eficacia, seguridad y habilidad de formar esporas, lo cual le permite prevalecer en la mayoría de los agroecosistemas (^{Villareal-Delgado et al., 2018}; ^{Córdova-Albores et al., 2020}). Así, el objetivo del presente estudio fue identificar los potenciales mecanismos de biocontrol de la cepa bacteriana TSO2 al secuenciar, anotar y minar su genoma para explorar el uso de esta cepa para la formulación de biopesticidas.

Así, se aisló la cepa TSO2 del suelo en el que se encontraba plantado trigo duro comercial en el Valle del Yaqui, México (27.3692°, 110.3886°), con un método de dilución serial en el medio de cultivo Agar Nutritivo (AN) a 28 °C por 2 días (^{Valenzuela-Aragon et al., 2018}). Después de la purificación bacteriana, la cepa fue criopreservada a -80 °C con Caldo Nutritivo (CN) como medio de cultivo suplementado con 30% de glicerol, en la Colección de Microorganismos Edáficos y Endófitos Nativos (COLMENA) (^{de los Santos-Villalobos et al., 2018}; ^{de los Santos-Villalobos et al., 2021}). Después de la purificación, se colocó una pieza de agar de 0.5 cm de diámetro con micelio de Bipolaris sorokiniana TPQ3 en el centro de una caja de Agar Papa Dextrosa (PDA, por sus siglas en inglés), y la cepa TSO2 se sembró en cuatro puntos equidistantes por triplicado alrededor del fitopatógeno y se incubó por cinco días a 28 °C. Así, la cepa TSO2 mostró una gran actividad de biocontrol contra B. sorokiniana TPQ3, una zona de inhibición de 8.0 ± 0.2 mm, a través de la producción de compuestos difusibles extracelulares con una fuerte actividad antifúngica, así como actividad citotóxica (^{Villa-Rodríguez et al., 2019}).

Con base en estos hallazgos, la cepa TSO2 fue secuenciada para explorar más a fondo potenciales mecanismos de biocontrol. Se extrajo ADN genómico de alta calidad de un cultivo fresco de esta cepa sembrado en CN [24 h a 32 °C, usando un agitador orbital a 121 rpm, con lo que se obtuvo 1×10⁶ Unidades Formadoras de Colonias (CFU, por sus siglas en inglés) mL^-1], y siguiendo el protocolo descrito por ^{Valenzuela-Aragon et al. (2018}). Luego, el ADN bacteriano fue secuenciado en la plataforma Illumina MiSeq, con lo que se obtuvo un total de 3,584,209 de lecturas pareadas [2 x 300 pares de bases (bp, por sus siglas en inglés)]. La calidad de las lecturas obtenidas fue analizada en FastQC versión 0.11.5 (^{Andrews, 2010}). Se usó Trimmomatic versión 0.32 (^{Bolger et al., 2014}) para remover secuencias del adaptador y bases de baja calidad; solamente 7.39% de éstas no cumplieron los criterios de calidad. Después, se generó un ensamble de novo con SPAdes versión 3.14.1 (^{Bankevich et al., 2012}), usando el parámetro “--careful” para la corrección de errores en las lecturas. Los contigs ensamblados fueron ordenados con Mauve contig Mover, versión 2.4.0 (^{Darling et al., 2004}), utilizando el genoma de referencia de Bacillus cabrialesii TE3^T (número de acceso de Genebank GCA_004124315.1) (^{de los Santos Villalobos et al., 2019}), con base en la mayor similitud del gen 16S rRNA (100% de similitud y una completud de 100%) (Figura 1). Además, se llevó a cabo una deteción de plásmidos con PlasmidFinder 2.0 (^{Carattoli et al., 2014}), los cuales no se detectaron. Así, el borrador del genoma de la cepa TSO2 presentó 4,242,212 bp; contenido de G+C de 43.9%; 300,069 bp N50; 5 L50 y 47 contings (> 200bp).

La anotación del genoma de la cepa estudiada se creó a través del servidor Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST) versión 2.0 (http://rast.nmpdr.org) (^{Overbeek et al., 2013}), usando RASTtk por defecto (Figura 2). Así, la cepa TSO2 presentó un total de 96 RNAs y 4,432 secuencias de ADN codificantes (CDS) predichos, distribuidos en 328 subsistemas. Los subsistemas más abundantes fueron los aminoácidos y derivados (307 CDS), seguidos de hidratos de carbono (252 CDS). Este genoma demostró la presencia de genes de importancia agrícola involucrados en i) virulencia, enfermedad y defensa (34 CDS), que incluye la respuesta al estrés por bacitracina (7 CDS), resistencia a antibióticos y compuestos tóxicos (15 CDS), así como a invasión y resistencia intracelular (12 CDS); y ii) adquisición y metabolización del hierro (30 CDS), incluyendo a los sideróforos Bacilibactina (10 CDS) y Antraquelina (5 CDS).

Figura 1 Árbol filogenético. Relación filogenética entre la cepa TSO2 y especies con una relación cercana: Bacillus inaquosorum KCTC 13429T (AMXN01000021); B. cabrialesii TE3T (MK462260); B. spizizenii NRRL B-23049T (CP002905); B. tequilensis KCTC13622T (AYTO0100004); B. stercoris JCM 30051T (MN536904); B. subtilis NCIB 3610T (ABQL01000001); B. halotolerans ATCC 25096T (LPVF01000003); B. mojavensis RO-H-1T (JH600280); B. vallismortis DV1-F-3T (JH600273); B. nakamurai NRRL B-41091T (JH600273); B. velezensis CR-502T (AY603658); B. amyloliquefaciens DSM 7T (FN597644); B. siamensis KCTC13613T (AJVF01000043); B. atrophaeus JCM 9070T (AB021181); B. glycinifermentans GO-13T (LECW01000063); B.paralicheniformis KJ-16 T (KY694465), construido con CLC Sequence Viewer v8.0.0 (CLC bio A/S, Qiagen, Dinamarca) por medio del algoritmo de unión de vecinos (con base en 1000 replicaciones). La barra de escala (0.006) representa el número de sustituciones de nucleótidos por sitio. 

Figura 2 Distibución de los subsistemas de secuencias de ADN codificantes de la cepa TSO2 generada a través deRASTtk. CDS: 4432, CDS en subsistemas: 1204, y subsistemas: 328. 

Además, el mapa circular de cromosomas fue generado con el CGView Server (^{Grant y Stothard 2008}) (Figura 3). Asimismo, con el uso de antiSMASH 5.2.0 bajo parámetros por defecto (^{Blin et al., 2021}), siete grupos de genes biosintéticos (BGC, por sus siglas en inglés) putativos fueron identificados en el genoma de la cepa TSO2 (Figura 3). Por ejemplo i) la fengicina (100%), que es un lipopéptido con una fuerte actividad fungitóxica contra los hongos filamentosos (^{Koumoutsi et al., 2004}); ii) la bacilisina (100%), un dipéptido con un rango amplio de actividad antagonista contra hongos y bacterias (^{Nannan et al., 2021}); iii) la subtilosina A (100%), una bacteriocina producida de forma ribosomal con una potente propiedad antimicrobiana (^{Ezrari et al., 2021}); iv) la bacilibactina (100%), un sideróforo triscatetolato arquetípico conocido por su gran afinidad por el hierro (Fe³⁺) de sideróforos naturales (^{Nithyapriya et al., 2021}); v) el bacilaeno (100%), un policétido que juega un papel biológico importante relacionado como arma antibiótica para que Bacillus pueda resistir otros microbios ambientales (^{Li et al., 2021}); vi) Killing factor (100%), un péptido que induce la lisis de células hermanas no esporuladas y no exógenas resistentes a toxinas como fuente de nutrientes, con lo cual brinda a la especie con un rasgo favorable en cuanto a la esporulación, y por ello, a la competencia en el nicho (^{González-Pastor, 2010}); y vii) la surfactina (86%), que es un poderoso biosurfactante y una molécula bioactiva versátil que ha demostrado ser un agente antifúngico, antiviral, antitumoral, insectiida, antimicoplasma y biorremediación en el suelo y en el agua (^{Mulligan, 2005}).

Figura 3 Mapa circular del cromosoma de Bacillus sp. cepa TSO2, distribución de secuencias de ADN codificantes (CDS), tRNAs, rRNAs, y contenido de GC (50% de las pares de base), así como los grupos de genes biosintéticos (BGC, por sus siglas en inglés) identificados a través de antiSMASH 

Bacillus sp. cepa TSO2 contiene un gran número de grupos de genes biosintéticos (BGC) que apoyan su actividad de biocontrol contra hongos fitopatogénicos. Así, esta cepa debe ser estudiada a mayor profundidad como un potencial ingrediente bioactivo para la formulación de biopesticidas, debido a su gran potenial como agente de control biológico por la secreción de antibióticos y de péptidos antimicrobiales, así como la producción de sideróforos.

Disponibilidad de datos. Este borrador de secuencia del genoma ha sido depositada en DDBJ/ENA/ GenBank bajo el número de acceso JAHBMK000000000. La versión descrita en el presente trabajo es la primera versión, JAHBMK000000000, bajo el número de BioProject PRJNA728132 y número de BioSample SAMN19070894. Datos sin procesar están disponibles bajo el número de acceso SRR16775344.