Materiales y métodos

Unidad experimental. En mayo 2020, ciclo primavera-verano, se seleccionó una parcela de 5 000 m² en el Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, Texcoco, Estado de México. Se sembraron en bloques aleatorios 12 genotipos de Phaseolus vulgaris: Bayo Mecentral, Flor de Mayo, Tipo Flor de Mayo, Pinto Texcoco, Canario, Negro Mixteco, Negro Querétaro, Negro Perla, Vaquita Negro, Garrapato, OTI y Segregante OTI (Figura 1A). Cada genotipo se estableció en 25 surcos de 13 m de largo con 80 cm y 2 m de separación entre surco y bloques, respectivamente. Una barrera de cinco surcos de maíz (Zea mays) delimitó el área experimental. Se aplicó un manejo agronómico semitecnificado con actividades convencionales de fertilización, aporque, control de malezas y riego rodado complementario. En el centroide de la unidad experimental se instaló un sensor climático HOBO u23 Pro v2 para medición de humedad relativa (HR) y temperatura (°C) a intervalos de 30 min entre 1-junio y 15-agosto 2020. Complementariamente se obtuvieron datos climáticos de la estación meteorológica del Colegio de Postgraduados Campus Montecillo.

Figura 1 A) Diseño experimental de 12 genotipos de Phaseolus vulgaris distribuidos al azar en condiciones de campo. Imagen aérea captada el 2 de junio 2020 a 50 m del centroide del bloque experimental mediante un dron Phantom 3 DJI®. Escala logarítmica-diagramática de seis clases para evaluar severidad viral, estimado con porcentaje de tejido foliar clorótico en una sección de 70 cm de surco (B), y para evaluar severidad de tizón estimado con porcentaje de área foliar necrótico (C). Los valores de la escala aplican para ambas enfermedades. LI, LS y PMC corresponden a los límites inferior, superior y punto medio de clase en unidades porcentuales, respectivamente. Ciclo Primavera-Verano 2020. 

Variables experimentales y severidad. Mediante App-Monitor^® v1.1 Android^®, disponible en PlayStore^® (CP-LANREF, 2021), se registró en el módulo digital de caracterización las coordenadas, ubicación espacial (estado, municipio y localidad), nombre del cultivo, superficie, fenología, tecnificación, riego, densidad de plantación y nombre de propietario. Las variables epidemiológicas se evaluaron en 13 plantas/surco en 5-6 surcos/genotipo mediante un muestreo sistemático discontinuo 1 x 2. Se realizó una evaluación en el evento fenológico de floración (6-junio) y otra en fructificación (10-agosto). Por planta, se evaluó la severidad de síntomas virales y de un tizón foliar, los dos problemas infecciosos con mayor ocurrencia entre genotipos. Adicionalmente, se reportó presencia o ausencia de Bemisia sp. y Aphis spp., como potenciales vectores de virus.

El porcentaje de severidad se evaluó mediante una escala logarítmica-diagramática de 6-clases (^{González-Cruces et al., 2020}). El punto medio de clase (PMC), límite inferior (LI) y superior (LS) se calcularon en 2-Log v2.0 empleando los parámetros de Número de clases = 6 y Y _max = 65% (CP-LANREF, 2018. No publicado). En virosis, la severidad representó el porcentaje de tejido con mosaico-clorosis-deformación en una sección de 70 cm de surco (Figura 1B); en tizón, la severidad indicó el porcentaje necrótico de área foliar del foliolo más infectado/planta (Figura 1C). Las escalas de severidad se configuraron en App-Monitor^®. Un total de 12 evaluadores realizaron las mediciones en cada fecha. Los datos se almacenaron en la App y posteriormente se exportaron en MS Excel para integración de la matriz epidemiológica y análisis bajo un enfoque de sistemas (^{Mora-Aguilera et al., 2021}).

Índice de Vigor. Se realizó un análisis de cobertura foliar en fase de floración, asistido por imágenes aéreas digitales RGB de 14 mpx capturadas mediante dron Phantom 3 DJI^® entre las 15:00 y 17:00 h. Los vuelos se realizaron en trayectoria vertical desde el centroide de la unidad experimental (50 m de altura) y de cada parcela por genotipo (3 y 5 m). Las imágenes se procesaron con Gimp^® v2.10.20. Por genotipo, se obtuvo un Índice de Vigor de Cobertura (IV) = [(CF _Gi )/(AT _Gi )]*100, dónde Gi es el genotipo-i, CF área de cobertura foliar y AT es área de cobertura total (suelo + cobertura foliar).

Índice de Daño Integrado. Con el objetivo de evaluar la sanidad integral, con datos de severidad de virus y tizón, y el Índice de Vigor como factor de corrección, se calculó un Índice de Daño Integrado por genotipo (IDI) = [(3(CV _Gi ) + 1 (AL _Gi ))/260] + (1-IV _Gi ), dónde Gi es el genotipo-i, CV porcentaje de severidad viral, AL porcentaje de severidad de tizón e IV Índice de Vigor de Cobertura.

Colecta de material vegetal. Con el fin de identificar el agente(s) asociado al tizón se colectaron cinco muestras en los tres genotipos con mayor incidencia: Tipo Flor de Mayo, Pinto Texcoco y Canario. Las muestras se colectaron de forma dirigida a foliolos con manchas necróticas concéntricas y severidad de hoja con clases 1 - 3 (0.01 - 20%) de la escala de severidad (Figura 1C). Para síntomas virales, se colectaron 20 y 18 muestras trifoliadas con síntomas de mosaico-epinastia y clorosis-arrugamiento severo, putativamente asociados a Potyvirus y Begomovirus, respectivamente. El muestreo se realizó representativamente en los 12 genotipos.

Aislamiento y caracterización del organismo asociado al tizón. Un total de cinco hojas sintomáticas del genotipo Tipo Flor de Mayo se cortaron en 10 cuadros de 5 mm a partir de la zona marginal de lesión y desinfestaron por 2 min con hipoclorito de sodio (NaClO) al 1%, seguido de tres lavados con agua destilada estéril. Se reaisló e incubó en cajas Petri con medio Papa-Dextrosa-Agar (PDA) (Difco^®) five crecimientos miceliales. Después de siete días se revisó el patrón de esporulación, conidióforos y conidias mediante un microscopio estereoscópico (IROSCOPE YZ-6). Con la técnica de punta de hifa se purificaron los aislados en PDA y se realizó la caracterización del crecimiento micelial. Se determinó coloración micelial, morfología y morfometría conidial en 64 conidios/cepa. Se realizaron preparaciones fijas para microscopio compuesto (Velab VE-B2 de 10x y 40x) integrado al Programa Motic Images Plus v2.0. La identificación se efectuó con claves taxonómicas (^{Simmons, 2007}; ^{Barnet y Hunter, 1998}). La caracterización de aislados se documentó fotográficamente mediante una cámara Canon EOS REBEL T6, 24.1 MP^®.

Postulados de Koch. Se seleccionaron 12 foliolos de Flor de Mayo (de 4-5 cm de ancho y 5-6 cm de largo) aparentemente sanos. Se desinfestaron con la técnica previamente descrita y se secaron en campana de flujo laminar durante 30 min. Los 12 foliolos se colocaron individualmente al centro de cajas de Petri, acondicionadas como cámaras húmedas, con una malla superior y papel absorbente estéril al fondo. Se realizaron tres tratamientos con tres repeticiones y un testigo absoluto. Los tratamientos fueron inóculo de las cepas puras FPTA2h, FPTA3h y FPTA4h aisladas del tizón foliar y seleccionadas al azar. En el haz de cada foliolo se distribuyeron cuatro discos con crecimiento micelial (0.5 cm diámetro) / cepa. El testigo absoluto consistió en foliolos sin inoculación. Las cajas Petri se incubaron en una cámara de crecimiento a 25 °C y 90% de humedad relativa (HR) con fotoperiodo12:12 h durante 7 d. Siete días después de la inoculación se evaluó la patogenicidad de cada cepa registrando presencia o ausencia de síntomas típicos de tizón. Se seleccionaron seis hojas sintomáticas y se reaisló al organismo infectivo en cajas Petri con PDA. Se tomó al azar una colonia por hoja para la caracterización morfológica.

Extracción de ácidos nucleicos totales. La extracción de ADN de cinco, y ADN y ARN total de un total de 37 muestras se realizó por el método AP (SDS1%) modificado (^{Green y Sambrook, 2012}) a partir de 0.1 g de micelio de cultivo puro y tejido foliar para identificación por secuencia genómica parcial del hongo y del putativo agente(s) viral, respectivamente. Umbrales óptimos de concentración y pureza de ácidos nucleicos se cuantificaron en espectrofotometría con NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific 2000, EUA).

Selección y validación in silico de iniciadores para identificación genómica. Con base en la sintomatología de tipo viral en campo se asumió la infección de un miembro(s) del género Potyvirus y/o Begomovirus. Para la identificación genómica, se seleccionaron tres pares de iniciadores universales con base en criterios de amplificación sobre: 1) La región codificadora de la inclusión nuclear en la proteína B (NIb) en genomas de Potyvirus; 2) el ORF BL1 del ADN-B en Begomovirus; y 3) la región ITS del rADN para eucariontes (Cuadro 1). La especificidad de iniciadores asociados a los criterios 1 y 2 se evaluó mediante alineamiento local empleando Blast^® con secuencias genómicas registradas en el National Center for Biotechnology Information (NCBI). Para patógenos putativamente asociados a los síntomas virales, se generó un grupo de 22 secuencias de nucleótidos específicas para Bean golden yellow mosaic virus y Bean dwarf mosaic (Begomovirus), y Bean common mosaic virus (Potyvirus) reportados en América para P. vulgaris. Las secuencias se alinearon con los iniciadores respectivos empleando el algoritmo Clustal W en el software MEGA 7.0.26.

Identificación molecular del hongo. La identificación genómica de cinco cepas fungosas se realizó amplificando la región ITS del ADN ribosomal en una muestra final de 25 µL integrada por: 1X de Buffer PCR, 1 mM de MgCl_2, 0.2 mM del mix dNTPs, 400 nM de los iniciadores ITS1 e ITS4 (Cuadro 1), 1 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 40 ng de ADN total y agua libre de nucleasas. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se realizó en el termociclador T-100 (BioRad). Se ejecutó un programa de procesamiento que consistió en: desnaturalización inicial a 95 °C por 5 min y 31 ciclos con desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineamiento a 55 °C por 1 min, extensión a 72 °C por 90 s, y una extensión final de 72 °C por 5 min. Los fragmentos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5% teñidos con bromuro de etidio y se visualizaron con luz UV en fotodocumentador (UVP, Biolmaging Systems, Epi Chemi II Darkroom).

Identificación molecular del complejo viral. En 20 muestras presuntivamente asociadas a síntomas de Potyvirus, se realizó en dos pasos la síntesis de ADN complementario (cADN) a partir del ARN total. En el primer paso, la mezcla de reacción con: 9.75 µL de agua libre de nucleasas, 500 nM por primer (NIb2F - NIb3R) y 2.5 µL de ARN total, incubado a 85 °C durante 3 min en un termociclador T100 (Bio-Rad). En el segundo paso, se añadió a la reacción una mezcla con: 2 mM de mix dNTP´s, 1X buffer-RT, 100 U de la enzima transcriptasa inversa (M-MLV-RT) y 10 U del inhibidor de la ribonucleasa (RNAsin), todos de Promega Corp. EUA. El volumen total de reacción fue de 20 µL incubada a 44 °C durante 60 min, seguido de inactivación de la enzima a 92 °C durante 10 min. La PCR se realizó en un volumen final de 25 µL integrado por: 12.5 µL de mix Gotaq^® G2 Hot star, 500 nM de los iniciadores NIb2F - NIb3R (Cuadro 1) y 2.5 µL de cADN. El volumen final se completó con agua libre de nucleasas. Con el termociclador T-100 (BioRad) se ejecutó un programa que consistió en: desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min, 35 ciclos con desnaturalización a 95 °C por 45 s, alineamiento a 45 °C por 45 s, extensión a 72 °C por 45 s y una extensión final de 72 °C por 5 min.

Para 18 muestras putativas a Begomovirus, la mezcla de la reacción de PCR tuvo un volumen final de 25 µL que contenía: 1X de buffer GoTaq^®, 0.2 mM de mix dNTP´s, 300 nM de los iniciadores PBL1v2040 - PCR1c (Cuadro 1), 0.5 U de GoTaq^® G2 y 2 µL de ADN. El volumen final se aforó con agua libre de nucleasas. El programa de termociclaje ejecutado fue: desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, 30 ciclos con desnaturalización a 94 °C por 30 s, alineamiento a 50 °C por 30 s, extensión a 72 °C por 45 s, y una extensión final de 72 °C por 5 min. Los fragmentos amplificados de muestras presuntivas a Potyvirus y Begomovirus se analizaron por electroforesis con metodología análoga a la identificación del hongo.

Secuenciación y análisis bioinformáticos. Un total de 23 muestras que amplificaron por PCR fueron enviadas a secuenciación de nucleótidos (Macrogen^® Seúl, Corea). Con las secuencias obtenidas y secuencias de referencia para cada grupo de organismo, se realizaron análisis bioinformáticos que incluyeron: 1) Generación de la secuencia consenso con el programa SeqAssem v07; 2) Alineamiento local con Blast-n^® en el NCBI; 3) Evaluación del porcentaje de homología y cobertura con la región genómica amplificada; y 4) Reconstrucción filogenética en MEGA v7.0.26 usando máxima probabilidad y/o máxima parsimonia como métodos de agrupamiento.

Análisis espacial. El análisis geoespacial intra- e inter-parcelario se realizó con Golden Surfer^® v10. La matriz por evento fenológico y genotipo se estructuró con x = surco, y = distanciamiento de planta (hongo) o sección de 70 cm de surco (virus), y z = porcentaje de severidad de síntomas virales o de tizón. El análisis geoestadístico se realizó con el método kriging representado en mapas bidimensionales y contornos. La dependencia y autocorrelación espacial se calculó con variogramas omnidireccionales ajustados a un modelo esférico. Por genotipo, se obtuvieron los indicadores variográficos nugget (n), σ²-parcial (σ² -p), y sill o meseta de σ² (σ² -s) para determinar el nivel de dependencia espacial continua.

Daño abiótico asociados a la infección del hongo. Debido a la distribución del tizón en campo, predominantemente basal en planta y registro de un evento de granizo en fases tempranas del cultivo, se realizó un ensayo de daños simulados por Granizo (G), Viento (V) y fricción por Suelo (S) en tejido foliar de P. vulgaris para evaluar su implicación en el proceso de infección y desarrollo del tizón en condiciones de invernadero. Se utilizó un total de nueve foliolos asintomáticos del genotipo Flor de Mayo distribuidos en tres repeticiones por tratamiento. El efecto Granizo se simuló impactando a 10 cm de cada foliolo cinco esferas de hidrogel congelado de 0.5 cm de diámetro. La simulación de Viento se realizó mediante fricción entre foliolos por medio del aire generado con un ventilador (Taurus rush^® 20 pulgadas) a 1300 rpm, durante 5 min. Para el efecto Suelo se utilizó un total de 2 kg de suelo gradualmente dispersado sobre el tejido foliar. Los Testigos absolutos fueron foliolos asintomáticos, sin exposición a daños y asperjado con agua destilada estéril.

Inmediatamente después de la simulación, el haz de cada foliolo se inoculó por aspersión las concentraciones 20000 (C1), 39000 (C2) y 49000 (C3) conidios por mL^-1 cepa FPTA2h. Cada foliolo se colocó en tubos de 2 mL sumergiendo el pedúnculo en agua destilada estéril para mantener la turgencia durante el desarrollo del experimento. Este material se colocó dentro de bolsas de polipapel para evitar contaminación. A partir de hojas sintomáticas se reaisló el organismo en cajas Petri con PDA ocho días después de la inoculación. Se realizaron seis preparaciones de estructuras directas de la lesión para identificación en microscopio compuesto (Velab VE-B2 de 10x y 40x) mediante las claves taxonómicas referidas. Adicionalmente, se generó un acervo digital con 12 imágenes de tejido foliar dañado para cuantificar el porcentaje de severidad mediante procesamiento con GIMP 2.10^®. Los resultados se analizaron en software SAS v9.4 mediante ANOVA en un diseño BCA y el procedimiento PROC GLM con la combinación tipo de daño simulado (G, V, S, T) y concentración (C _i ) como tratamientos.

Análisis estadístico. Una matriz epidemiológica con 859 observaciones, 22 variables y 18898 metadatos totales se integró en MS Excel para análisis estadístico en Statystical Analysis Software (SAS^®) v9.4. La severidad de síntomas virales, tizón, Índice de Daño Integrado e Índice de Vigor se emplearon como variables respuesta, mientras que genotipo y evento fenológico fueron factores experimentales. Se realizaron análisis descriptivos por variable y evento fenológico mediante PROC UNIVARIATE para pruebas de normalidad mediante Shapiro-Wilk (p < 0.05). El análisis de varianza (ANOVA) para un diseño completamente al azar (DCA) con repeticiones anidadas se realizó con PROC GLM y comparación de medias con Tukey (α = 0.05). La comparación entre eventos fenológicos se realizó con t-Student (α = 0.05).

Resultados y discusión

Identificación morfológica y molecular del hongo. Las cepas fungosas FTFMA1h, FPTA2h, FPTA3h, FPTA4h y FPTA5h se caracterizaron por exhibir crecimiento micelial negro con presencia de 5 a 8 conidios en cadena (Figura 2A). La determinación morfométrica de 64 conidios maduros de la cepa FPTA2h mostró longitud y ancho promedio de 7.53 µm (rango 3.8 - 12.3 µm) y 3.23 µm (rango 2 - 4.6 µm), respectivamente. Se identificaron conidios con 3-5 septos y 1-2 longiseptos (Figura 2A). Con base en estas características se identificó al hongo como Alternaria alternata (Berrouet et al., 2014; ^{Simmons, 2007}; ^{Barnet y Hunter, 1998}).

Figura 2 A. Identificación de Alternaria alternata por Asociación del síntoma - Aislamiento - Identificación por morfometría de dyctiosporas en cadena, pedicelos cortos, conidióforos (ver descripción en texto). B. Simulación del efecto de daños por viento (V), granizo (G) y fricción de suelo (S) en la infección de Alternaria alternata en condiciones controladas. c1 = 20000, c2 = 39000, c3 = 49000 conidios mL-1 cepa FPTA2h; T = Testigo. Con excepción de S, el cual exhibió un biofilm de tipo bacteriano, el daño mecánico favoreció la infección del hongo. 

La confirmación molecular de A. alternata se realizó mediante amplificación de fragmentos óptimos de 500-600 pb ITS. Se obtuvieron umbrales concentración de 127.7 - 482.3 ng μL^-1 y pureza 1.88 - 2.18 nm. El alineamiento de las cinco secuencias en NCBI confirmó la identificación taxonómica de Alternaria alternata con rango 99 - 100% homología con la accesión AF347031.1 de A. alternata. Las secuencias se registraron en GenBank con los números de accesión OL229866, OL229867, OL229868, OL229869 y OL229870. El análisis filogenético con el método de máxima verosimilitud (i=1000) para la región ITS y 100% de soporte de nodo, confirmó la agrupación de las cinco secuencias con la accesión AF347031.1. Las secuencias de referencia para Alternaria alternantherae (KC584179.1) y Stemphylium amaranthi (KU850503.1) estuvieron distantes del nodo principal de A. alternata (Figura 3A). Sin embargo, es necesario remarcar que A. alternata conforma un grupo evolutivo diverso (Alternaria sect. alternaria) con atributos morfológicos y moleculares con ITS que pueden traslaparse entre especies, por lo que podrían requerirse estudios complementarios (^{Armitage et al., 2020}).

Figura 3 Análisis bioinformático mediante secuencias amplificadas de regiones genómicas universales, máxima verosimilitud y 1000 repeticiones Bootstrap. A) Identificación de A. alternata mediante ITS1 y ITS4, modelo HKY+G con 99% de homología respecto del aislado AF347031.1 del GenBank. B) Identificación de Bean common mosaic virus con NIb2F y NIb3R, modelo Tamura-Nei con 99% de homología a dos accesiones de este virus del GenBank. Secuencias en negritas corresponden a muestras obtenidas en este trabajo. 

Pruebas de patogenicidad de Alternaria alternata . La patogenicidad de A. alternata se comprobó en tejido foliar de P. vulgaris genotipo Tipo Flor de Mayo con las cepas FPTA2h, FPTA3h y FPTA4h. Los foliolos testigo no reprodujeron síntomas. En promedio, siete días después de la inoculación, el 100% de foliolos mostraron síntomas de lesiones necróticas café-obscuro o negras con halos amarillos. La validación por criterios de morfometría colonial, conidial y corroboración con claves taxonómicas (^{Simmons, 2007}; ^{Barnet y Hunter, 1998}), fueron coincidentes con Alternaria alternata en el total de foliolos analizados confirmando los postulados de Koch.

Diagnóstico molecular y prevalencia de Potyvirus y Begomovirus. Se detectó por RT-PCR una prevalencia del 100% de un miembro del género Potyvirus en las muestras analizadas (20/20). El amplicon de 350 pb para los iniciadores universales NIb2F y NIb3R amplificó en las muestras de los 12 genotipos de P. vulgaris. Los umbrales concentración y pureza estuvieron en rango de 127.7 - 482.3 ng μL^-1 y 1.88 - 2.18 nm, respectivamente. La secuenciación de cinco muestras representativas determinó la identificación de la especie Bean common mosaic virus (BCMV) con 99 - 100% de homología con las accesiones MH024841.1 BCMV-3PF y MK069985.1 BCMV-CJ16 de NCBI para este virus. La reconstrucción filogenética por Maximum Likelihood, tuvo 100% soporte de nodo (Figura 3B). Secuencias de referencia asociadas a Papaya ringspot virus (PRSV) especie del género Potyvirus y principalmente el Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) perteneciente a los Begomovirus se ubicaron distantes del clado principal. Las secuencias confirmatorias de BCMV en este trabajo se registraron en GenBank con los números de accesión OL229871.1, OL229872.1, OL229873.1, OL229874.1 y OL229875.1.

La alta incidencia de este virus fue coincidente con reportes de 90.2 - 100% para África (^{Mwaipopo et al., 2018}), pero superó los reportados previamente por ^{Lepe-Soltero y colaboradores (2012}) para Sonora y Nayarit con un rango de 6 - 78%. En este estudio, la prevalencia de síntomas asociados a BCMV fueron mosaico (100%), epinastia (60%) y distorsión foliar (39%), posiblemente dependiente del genotipo (Figura 3B). No se detectó la presencia del BCMNV, un Potyvirus muy relacionado con BCMV, previamente reportado en cinco estados mexicanos, Estado de México no incluido, con mayor prevalencia en infecciones simples, o mezclado con BCMV (^{Lepe-Soltero et al., 2012}). Aunque en campo no se detectó síntomas de necrosis en nervaduras secundarias, típico del BCMNV, futuros trabajos podrían requerir iniciadores específicos, en adición al universal, para asegurar el diagnóstico.

Las 18 muestras con fuerte amarillamiento foliar presuntivas a algún miembro del género Begomovirus no amplificaron con los iniciadores universales PBL1v2040 y PCR1c, a pesar de presencia, aunque con muy baja densidad, de B. tabaci en más de 80% de los 12 genotipos. Este insecto es un potencial vector de este grupo de virus. Este resultado fue inesperado ya que el Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) y Bean golden mosaic virus (BGMV) se han reportado ampliamente para Centroamérica y el Caribe (^{Rojas et al., 2018}; 1993), aunque fuertemente asociado con los brotes regionales de Bemisia tabaci en los 90´s (^{Gilbertson et al., 2005}). En Brasil, el BGMV fue infectivo en siete cultivares de frijol, aunque con diferentes concentraciones virales (^{De Freitas-Vanzo et al., 2021}).

Severidad de Bean common mosaic virus en 12 genotipos de frijol. La matriz epidemiológica para el análisis comparativo entre genotipos respecto a la severidad de Alternaria alternata y BCMV, y la dispersión espacial, incluyó 22 variables, 859 observaciones y 18898 metadatos. En fase de floración de P. vulgaris, la severidad de BCMV en planta osciló entre 9 y 50% (clases 3 - 5), con alta variabilidad en función del genotipo. Vaquita Negro (50.06 ± 13.6), Canario (48.7 ± 15.4) y Segregante Oti (40.14 ± 21.9) mostraron mayor expresión de síntomas con clases de severidad 4 - 5 estadísticamente diferentes (Tukey, p = 0.05) al resto de genotipos (Cuadro 2). Por el contrario, Bayo Mecentral (21.2 ± 8.1), Tipo Flor de Mayo (18.2 ± 14.8) y Negro Perla (9.6 ± 6.9) tuvieron severidad relativamente más baja (clases 3 - 4), entre las cuales Negro Perla fue estadísticamente menor (Tukey, p = 0.05) (Cuadro 2). En fase de fructificación, se amplió el rango de severidad a 6.7 - 58.1% (clases 3 - 6). Vaquita Negro (58.1 ± 4.8) y Canario (37.3 ± 20.3) se mantuvieron estadísticamente como genotipos más susceptibles con clases de severidad 4 - 5 (Tukey, p = 0.05), mientras que Garrapato (38.5 ± 18.5) tuvo un incremento de severidad en 14%, estadísticamente diferente (t-test, p < 0.0001) respecto a la expresión sintomática en floración.

Negro Perla (6.7 ± 8.8) fue el genotipo menos susceptible en floración y fructificación sin diferencias estadísticas entre estos eventos fenológicos (t-test, p = 0.121) (Cuadro 2). Sin embargo, la tendencia fue una reducción entre 2.9 - 19.9% de severidad, atribuida al desarrollo vegetativo, ya documentado en otro trabajo en Kenia en experimentos pre- y post-lluvias, con decrementos hasta de 12.6% en 10 cultivares de P. vulgaris (^{Mangeni et al., 2020}). En esta investigación, un total de ocho genotipos presentaron esta condición decreciente, de los cuales seis fueron estadísticamente diferentes (t-test, p = 0.0001). Flor de Mayo (-6.4%) y Negro Perla (-2.9%) no presentaron diferencias de severidad entre floración y fructificación (t-test, p = 0.12) (Cuadro 2). Entre los genotipos más susceptibles, los que tuvieron incrementos (6.4 - 8.8%) estadísticamente significativos (t-test, p = 0.021 - 0.042) fueron Vaquita negro (58.1 ± 4.8) y Tipo Flor de Mayo (27 ± 22) (Cuadro 2).

En general, los estudios varietales de frijol respecto a la severidad de virus (Potyvirus, Begomovirus u otros géneros) emplean escalas cualitativas a nivel foliar (p.e., 0 = sin síntomas, 1 = síntomas leves, 2 = síntomas moderados y 3 = distorsión severa, malformación de las hojas o del tallo y retraso en el crecimiento). Con esta escala, ^{Mangeni y colaboradores (2020}), reportaron 2.3 severidad promedio de BCMV, el cual puede considerarse equivalente a las clases 4 - 5 de la escala de severidad desarrollada en este estudio y encontradas en Vaquita Negro, Canario, Garrapato o Segregate Oti (Cuadro 2). ^{Murere y colaboradores (2018}) en un estudio de 16 genotipos de frijol reportaron prevalencia de BCMV en 29.4 - 42.78% de las muestras analizadas con rango de severidad promedio regional de 1.1 - 1.67 (escala 0 - 3). Los genotipos susceptibles exhibieron síntomas moderados y severos (clases 2 - 3).

Respecto a la intensidad de enfermedad causada por Begomovirus (i.e., CuLCrV y SiGMFV) en Phaseolus sp., la severidad se ha reportado entre 5 - 50% en 20 genotipos considerados con moderada resistencia, y más de 60% en 21 variedades tipificadas como susceptibles (^{Agarwal et al., 2021}). Estos resultados muestran la alta prevalencia e intensidad de daño de BCMV y otras especies de virus en frijol y sugieren la importancia de actualizar su estatus en los acervos genéticos mexicanos y su implicación productiva (^{Flores-Estévez et al., 2003}; ^{Pedroza-Sandoval et al., 2013}; ^{Lepe-Soltero et al., 2012}). El empleo de la escala de cobertura vegetal propuesta en este trabajo permitió discriminar el efecto infeccioso viral por lo que constituye una alternativa metodológica para estudios intensivos de campo respecto a escalas a nivel planta bajo la racionalidad de dosel confundido entre plantas de siembras compacta.

Severidad de Alternaria alternata en 12 genotipos de frijol. La severidad de A. alternata fue contrastante entre los 12 genotipos de frijol estudiados. En fase de floración, la severidad foliar osciló entre 7 - 33.6% (clases 3 - 4). Pinto Texcoco fue el genotipo más susceptible (33.6 ± 8.1), seguido contrastantemente de Negro Mixteco (16.7 ± 10.3) y Negro Querétaro (15.3 ± 11.9). Sin embargo, estos genotipos fueron estadísticamente iguales (Tukey, p = 0.05) debido a la variabilidad intra- e inter-genotipos (Cuadro 2). Garrapato (5.3 ± 4.3), Oti (5.6 ± 7.4) y Segregante Oti (6.8 ± 9.4), pertenecientes al mismo linaje (^{Estrada-Gómez et al., 2004}), fueron relativamente más tolerantes al hongo. Estadísticamente (Tukey, p = 0.05), estos materiales no fueron diferentes del resto de genotipos con excepción de Pinto Texcoco (Cuadro 2). Este linaje se ha reportado con alta o moderada resistencia a infecciones de hongos foliares y de raíz como Colleotrichum lindemuthianum, Sclerotinia sp., Uromyces appendiculathus var. appendiculatus y Rhizoctonia solani (^{Estrada-Gómez et al., 2004}).

En fructificación, la severidad se mantuvo con alta variabilidad. No obstante, Canario (42.7 ± 18.2) y Tipo Flor de Mayo (41.4 ± 13) fueron genotipos altamente susceptibles con incrementos significativos respecto a la fase de floración (t-test, p < 0.0001) con 35.7% y 31.5%, respectivamente (Cuadro 2). Este incremento se puede explicar por mayor longevidad del genotipo propiciando renovación foliar y extensión del proceso infeccioso. Los genotipos Negro Perla (6.2 ± 5.8), Negro Mixteco (7.5 ± 4.2), Segregante Oti (8.6 ± 6.6), Pinto Texcoco (9.5 ± 4.8) y Negro Querétaro (10 ± 10.8) tuvieron severidad menor al 10% (Clases 1 - 3), con una reducción significativa (t-test, p < 0.01) de 3.8 - 24.1% respecto al daño expresado en floración (Cuadro 2). Pinto Texcoco exhibió la mayor reducción de severidad pasando de 33.6% a 9.5%, seguido de Negro Mixteco con un decremento de 16.7%. Análogo a BCMV, en estos genotipos la disminución de severidad se asoció a senescencia de tejidos y consecuentemente pérdida de inóculo. Los genotipos más estables fueron Bayo Mecentral, Flor de Mayo, Vaquita Negro y Segregante Oti, los cuales tuvieron severidad moderada 6.8 - 11.8% en floración, con incrementos no significativos entre 0.4 - 1.8% en fructificación (t-test, p = 0.42 - 0.87) (Cuadro 2).

Diversas especies de Alternaria spp. se han reportado asociados al frijol y otros cultivos. En algunos casos, como A. solani en solanáceas puede ser altamente restrictivo para la producción (^{Thomma, 2003}). Alternaria alternata (= A. tenuis) se ha reportado como agente patogénico en Phaseolus spp. al menos desde principios del siglo XIX (Thomma, 2003; ^{O’Donnell y Dickinson, 1980}). Sin embargo, no se encontraron estudios epidemiológicos aplicados a la evaluación de germoplasma respecto a A. alternata en P. vulgaris. Este es el primer reporte con ese enfoque en México.

Índice de Daño Integrado (IDI) e Índice de Vigor (IV). La sanidad integral de Phaseolus vulgaris respecto a BCMV y A. alternata, estimada con IDI, estuvo en el rango de 0 - 1.54. IDI fue mayor en floración con valores entre 0.37 - 1.51, siendo Oti (0.37) y Negro Perla (0.43) los genotipos significativamente más tolerantes, mientras que Vaquita Negro (1.51) y Segregante Oti (1.05) los más susceptibles considerando al efecto combinado de BCMV y A. alternata (Tukey, p = 0.05) (Cuadro 3). En fructificación, el IDI disminuyó considerablemente a rangos de 0.03 - 0.63. Nuevamente, Negro Perla (0.03) y Oti (0.03) fueron estadísticamente los más tolerantes, y Vaquita Negro (0.63) se mantuvo como el más susceptible (Tukey, p = 0.05) (Cuadro 3).

El Índice de Vigor de planta (IV) por genotipo osciló entre 0.1 - 0.91. Este índice fue inversamente proporcional a IDI, evidenciando fuerte efecto fisiológico detrimental de la combinación de BCMV y A. alternata. En general, el IV mostró diferencias estadísticas al menos en 8/12 genotipos (Tukey, p = 0.05). Oti (0.91) tuvo el vigor de planta significativamente más alto (Tukey, p = 0.05). Interesantemente, Garrapato, del cual se derivó Oti, y que fue seleccionado para el Valle de México por su alta productividad y resistencia a hongos fitopatógenos (^{Estrada-Gómez et al., 2004}), tuvo moderado IV = 0.64 (Cuadro 3), y moderada susceptibilidad con daños máximos de 38% por BCMV y 20.2% por A. alternata (Cuadro 2). En contraste, Vaquita Negro (0.1) obtuvo el menor vigor, evidenciando su alta susceptibilidad principalmente a BCMV. Negro Querétaro, Bayo Mecentral, Negro Mixteco y Segregante Oti fueron genotipos similares en IV con rangos entre 0.43 - 0.48 (Tukey, p = 0.05) (Cuadro 3).

Figura 4 Análisis geoestadístico kriging del promedio de severidad de: A) Bean common mosaic virus y C) Alternaria alternata evaluada en floración (6 junio, 2020) y fructificación (10 agosto, 2020) para 12 genotipos de Phaseolus vulgaris. El porcentaje de severidad se representa en colorimetría verde-rojo en concordancia con clases de escala de evaluación (Figura 1). Semivariogramas omnidireccionales por método esférico para bloque de genotipos contrastantes, remarcados con recuadros azules, para B) BCMV (B1, B7, B11 y B12) y D) A. alternata (B2, B3, B11 y B12) en fase de fructificación. Eje-X se representa lag -distancia de 70 cm sección de surco (BCMV), -planta (A. alternata), y Y la varianza (σ2) de severidad. 

Esta investigación sustenta a Oti y Negro Perla como los genotipos de frijol de mayor tolerancia a BCMV y A. alternata, atribuida a características intrínsecas al genotipo-ambiente. Sin embargo, es necesario analizar los linajes y líneas parentales para optimizar este tipo de estudios en programas de mejoramiento integrales que incorporen factores fitosanitarios en adición al enfoque fenotípico asociado a componentes de rendimiento.

Análisis espacial-parcelario de severidad a nivel genotipo. El análisis geoestadístico kriging y variogramas omnidirecionales del Bean common mosaic virus y A. alternata exhibieron patrones de dispersión intra-genotipo aleatorios de focos, agregados y uniformes en función de la susceptibilidad/tolerancia y evento fenológico. La intensidad de agregación fue concordante con los resultados de severidad/genotipo, IDI e IV analizados en secciones previas (Cuadro 2, 3; Figura 1, 4).

El bloque de Vaquita Negro, el genotipo más susceptible a BCMV, se caracterizó por dispersión de alta intensidad (clase 5, 58.2%) en fase de fructificación (Figura 4A), sin dependencia espacial de severidad indicando distribución uniforme de la infección del virus con parámetros variográficos nugget[n]= 209, σ²-parcial[σ ² -p] ≈ 0, σ²-sill[σ ² -s] = 233.7 (Figura 4B- B11 ). Contrariamente, Bayo Mecentral, aunque tuvo una distribución uniforme (n= 40.9, σ ² -p ≈ 0, σ ² -s = 70.5) pero asociado a baja intensidad de daño (clase 3, 9.6%) (Figura 4A, 4B- B1 ).

Segregante Oti fue representativo de genotipos con dependencia espacial en focos agregados discontinuos de 4-8 segmentos de 70 cm surco (n= 207.4, σ ² -p = 338.6, σ ² -s = 546) (Figura 4A, 4B -B12 ), análogo a Tipo Flor de Mayo y Negro Mixteco, o con efecto de bordo, como en Canario, Flor de Mayo, Garrapato u Oti (Figura 4A, 4B). Por su parte, Negro Querétaro evidenció focos aleatorios (n= 136, σ ² -p > 207.8, σ ² -s = 343.8) (Figura 4A, 4B -B7 ), cuyo patrón fue similar en Bayo Mecentral, Pinto Texcoco y Negro Perla, este último significativamente más tolerante en ambos eventos fenológicos (Figura 4A, 4B). El patrón de dispersión uniforme asociado a BCMV, sin diferencias estadísticas entre eventos fenológicos (datos no mostrados), sugiere efecto de trasmisión por semilla, lo cual se tiene consignando para este virus (^{Worral et al., 2015}; ^{Subramanya, 2013}). Sin embargo, un vector(es) también puede estar implicado por la presencia de focos aleatorios y de orilla-bloque. Myzus persicae y Aphis gossypii, entre otros áfidos, se han reportado como vectores (^{Worral et al., 2015}). Aunque colonización o exuvias de áfidos no fue detectada en las fases de floración y fructificación, no se descarta su ocurrencia transitoria en etapas tempranas del cultivo. El inóculo primario puede provenir de plantas enfermas a partir de semilla infectada, con posterior dispersión por el vector generando focos y agregados con mayor dependencia espacial. Los niveles de severidad e incidencia, contrastante en los eventos fenológicos estudiados, sugiere que la carga viral y proporción de infección en semilla es variable entre genotipos. La transmisión viral puede tener implicaciones en programas de mejoramiento genético y estudios de resistencia al BCMV por lo que debe ser investigado.

El comportamiento espacial de A. alternata también mostró una progresión de contagio aunque con claramente con menor intensidad entre genotipos, con excepción de Tipo Flor de Mayo y Canario, los cuales debido a su mayor susceptibilidad, evidenciaron dependencia espacial en agregados discontinuos de 3-8 plantas (n= 354.3, σ ² -p =159.8, σ ² -s = 514.1). Estos materiales tuvieron alta intensidad de daño (clase 4, 41.5%) en fructificación, correspondiendo con un incremento y coalescencia significativa de focos (Figura 4C-B2, B4, 4D -B2 ). Negro Mixteco, Negro Querétaro y Segregante Oti presentaron dependencia espacial en pequeños focos aleatorios 2-3 plantas (n= 103, σ ² -p = 28.8, σ ² -s = 87.1), con reducción de severidad en fructificación asociada a senescencia y pérdida de tejido foliar (Figura 4C, 4D -B12 ). Pinto Texcoco, Flor de Mayo o Garrapato representaron materiales con patrón de dispersión en agregados discontinuos de 4-5 plantas (n= 58.3, σ ² -p > 72.9, σ ² -s = 131.2) y severidad moderada (Figura 4C, 4D -B3 ). Vaquita Negro reportó dependencia uniforme de baja intensidad (n= 102, σ ² -p ≈ 0, σ ² -s = 172.8), aunque asociada a vigor de planta muy bajo (0.1) y alta susceptibilidad a BCMV (58.1%), por lo que podría ser efecto de competencia más que tolerancia (Figura 4C, 4D -B11 ).

Los datos microclimáticos registrados durante el experimento mostraron humedad relativa (HR) mínimas entre 22 - 51% y HR-máximas >77%; temperatura (T) mínimas de 11.6 - 15.8 °C y T-máxima de 21.6 - 28.9 °C, y frecuencia discontinua de precipitaciones post-floración y fructificación. Considerando que estas condiciones son óptimas para crecimiento micelial y esporulación de A. alternata (^{Prasad y Ahir, 2013}), los patrones de dispersión exhibidos podrían representar la aptitud parasítica real del hongo condicionada por el genotipo. En consecuencia, el potencial epidémico del hongo dependerá de fuertemente del factor genético y de otros componentes abióticos que contribuyan a la infección (Cuadro 4).

Efectos abióticos asociados a la infección de A. alternata en frijol. La simulación de daño por Viento ( V ) y Granizo ( G ) propició síntomas en 100% de los foliolos experimentales, no así para Suelo ( S ) y Testigo absoluto (Cuadro 4). Se reprodujeron lesiones necróticas causadas por la inoculación de la cepa FPTA2h de A. alternata (Figura 2B). La severidad foliar de A. alternata fue directamente proporcional a la concentración de conidios de A. alternata aplicada por cada factor de simulación. En general, el efecto de G indujo mayor rango de severidad con 75.3 - 94.7% con respecto a V que osciló entre 66 - 95.7% (Tukey, p = 0.05). Los tratamientos V y G con una concentración de 49000 conidios mL^-1 (C3) tuvieron 95.3% y 94.7% de severidad, respectivamente (Cuadro 4; Figura 2B). Las concentraciones 39000 (C2) y 20000 mL^-1 (C1) en G , indujeron severidad de 80.3% y 75.3%, respectivamente, los cuales fueron iguales estadísticamente entre sí (Tukey, p = 0.05). En los tratamientos V -C1 y V -C2 se tuvo severidad similar de 66% y 64.3% (Cuadro 4; Figura 2B).

En foliolos de los tratamientos S-C _i se encontró un biofilm de colonias putativamente asociadas a bacterias fitopatógenas presentes en suelo (Figura 2S). Aunque no se identificó a la bacteria(s), se reporta sobrevivencia de Xanthomonas axonopodis pv. allii y X. axonopodis pv. phaseoli en superficie del suelo cultivado con frijol, con capacidad de dispersión por impacto o salpique de partículas (Torres et al., 2019; ^{Gent et al., 2005}). Estos resultados ratifican el efecto de factores abióticos en procesos de infección, contagio y dispersión de Alternaria y otros organismos (^{Kumar et al., 2021}; ^{Lione et al., 2020}). Asimismo, sugiere que la efectividad de la carga de inóculo de A. alternata en frijol puede depender de factores secundarios para el éxito infectivo, por lo que podría considerarse hongo oportunista (^{Armitage et al., 2020}). El frijol pudo haber desarrollado eficientes mecanismos de defensa estructurales durante el largo proceso coevolutivo planta-patógenos en América, su centro de origen (^{Rendón-Anaya et al., 2017}; ^{Bitocchi et al., 2017}). Si bien un evento de granizo es errático, el daño de tejido por viento en cultivos de alta densidad de siembra, como en P. vulgaris, puede ser continuado y determinante para la enfermedad (^{de Langre, 2008}).

Conclusiones

Aplicando criterios morfológicos, genómicos y patogénicos se identificó Alternaria alternata como el agente causal de un tizón foliar en 12 genotipos de frijol (P. vulgaris). Las accesiones OL229866, OL229867, OL229868, OL229869 y OL229870 se registraron en GenBank. Análogamente, mediante iniciadores universales para Potyvirus y Begomovirus, se demostró únicamente la asociación del potyvirus Bean common mosaic virus con todos los genotipos. Se registraron las accesiones OL229871, OL229872, OL229873, OL229874 y OL229875. En etapas fenológicas de floración y fructificación, se determinó que el genotipo Negro Perla fue el más tolerante con 6.7 - 9.6% y 6.2 - 10% de severidad asociada a BCMV y A. alternata, respectivamente. Canario fue el genotipo más susceptible con valores máximos de 48.7% y 42.7%. La integración del vigor con la severidad causada por ambos organismos (IDI) confirmó a Negro Perla como la variedad más tolerante. Estudios geoespaciales demostraron intensidad de daño diferencial entre genotipos y la mayor aptitud epidémica del BCMV. A. alternata podría ser un patógeno oportunista. Se propone el Índice de Vigor de cobertura de dosel (IV) asistido con imágenes áreas-drone de exposición simple; Índice de Daño Integrado (IDI) con valores de vigor y niveles de severidad multipatógeno; escalas logarítmicas diagramáticas a nivel de hoja y cobertura foliar; y la App-Monitor^® v1.1 Android^®, disponible en PlayStore^®, como noveles propuestas para optimizar programas de mejoramiento integrales que incorporen factores fitosanitarios que complementen el enfoque fenotípico de componentes de rendimiento.