Materiales y métodos

Material vegetal. Las hojas de A. angustifolia y A. cupreata se recolectaron en Guerrero, México, en las localidades de Coacán, municipio de Atenango del Río (Latitud: 18.139444, Longitud: -49.187778) y en Totomochapa municipio de Tlapa de Comonfort, Guerrero (Latitud: 17.541111, Longitud: -98.459167) respectivamente. La identificación de A. cupreata y A. angustifolia la realizó el Dr. Abisaí J. García Mendoza del Herbario Nacional de México (MEXU). Los números de acceso asignados fueron: MEXU-2050 para Agave cupreata y ARC para Agave angustifolia.

Obtención de extractos de Agave spp. Las hojas se sometieron a un proceso de limpieza con agua, posteriormente se cortaron en fracciones con ayuda de un cuchillo a un tamaño aproximado de 3 cm. La obtención del extracto acuoso de A. angustifolia (EAAa) se realizó mediante la incorporación del material vegetal (300 g) con agua a 60 °C y se dejó reposar durante 3 h, transcurrido este tiempo se filtró y el extracto acuoso obtenido se congeló a ˗40 °C hasta realizar el proceso de liofilización en un equipo Free Zone 4.5 L (Labconco, Kansas, EE. UU.) a vacío de 0.045 mBar y temperatura de -52 °C. El polvo obtenido se almacenó a ˗20 °C hasta su uso en la prueba de actividad antifúngica. El extracto acetónico de A. cupreata (EAAc) se obtuvo por maceración directa de las hojas (3500 g) con acetona (Golden Bell, México) durante 48 h, posteriormente se filtró y la fase orgánica se evaporó en un rota-evaporador (digital rotary 410, Puebla, México) a 80 rpm y 60 °C, una vez obtenido el extracto, se almacenó a temperatura ambiente en frascos ámbar protegidos de la luz. El porcentaje de rendimiento de los extractos se calculó con la siguiente formula:

% de rendimiento=Extracto obtenido g X 100Material vegetal macerado (g) 

Perfil fitoquímico cualitativo. Para determinar el perfil fitoquímico se utilizó la técnica de cromatografía en capa fina, propuesta por ^{Salazar-Pineda et al. (2017}). Los extractos (5 mg) se diluyeron en 1 mL de disolvente de extracción y se colocaron con un capilar sobre cromatoplacas de silica gel TLC-F₂₅₄ (5 cm de altura x 5 cm de ancho; Merck) que se eluyeron con el sistema 7:3 hexano-acetona. Finalmente, las cromatoplacas se observaron en luz UV (254 nm) y se trataron con los siguientes reveladores químicos: Dragendorff (alcaloides), Polietilenglicol (flavonoides), Liebermann-Burchard (triterpenos y saponinas) y vainillina-ácido fosfórico (terpenos, lignanos y curcubitacinas) para la identificación cualitativa de metabolitos secundarios.

Hongos fitopatógenos y preparación de colonias. Los hongos utilizados fueron proporcionados de la colección del Laboratorio de Enfermedades de Frutales del Programa de Fitopatología del Colegio de Postgraduados, con sede en Motecillo, Texcoco, México. Las especies utilizadas en los ensayos fueron: E. sorghinum, Fusarium subglutinans, Lasiodiplodia viticola, L. iraniensis y Colletotrichum sp., todas fueron patógenas en sus hospedantes primarios. Colonias de cada especie fungosa, obtenidas a partir de aislamientos monospóricos e incubadas durante 72 h en cajas Petri con medio PDA (Papa Dextrosa Agar 5%, Bioxon, México) se utilizaron para las pruebas in vitro.

Efecto de extractos de Agave spp., sobre el crecimiento micelial. Se utilizó técnica de dilución en agar (^{González-Alvarez et al., 2015}) con algunas modificaciones. Los extractos EAAc y EAAa se disolvieron en agua estéril y se adicionaron a concentraciones de 2-16 mg mL^-1 en cajas de Petri (60 x 15 mm) estériles que contenían 3 mL de agar PDA sin solidificar. Una vez que el agar se gelificó en el centro de las cajas Petri se colocó un disco de PDA con crecimiento micelial (5 mm de diámetro) por especie fungosa experimental. Las cajas se incubaron a 25 °C y se monitoreó el diámetro del crecimiento micelial a las 24, 48 y 72 h hasta que la colonia del control negativo (medio PDA más hongos sin extractos) cubrió completamente la superficie de la caja de Petri. Se utilizó como control positivo el antifúngico Mancozeb (Manzate^®) a 16 mg mL^-1. Todas las pruebas se realizaron por triplicado. El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial se determinó a las 72 h y se estimó mediante la siguiente formula:

% de inhibición =1-D2/D1*100

Donde D1 valor promedio del diámetro de la colonia del control negativo y D2 valor promedio del diámetro de la colonia inhibida por los extractos.

Efecto de los extractos de Agave spp., sobre la producción de esporas. Para determinar el efecto de los extractos EAAc y EAAa sobre la esporulación a las 72 h de crecimiento, se usaron las mismas cajas donde se determinó la actividad antifúngica a la concentración de 16 mg mL^-1. El micelio de las cajas se asperjó con agua destilada estéril (5 mL) y se raspó con un asa bacteriológica, la suspensión obtenida se filtró en una pipeta Pasteur que contenía algodón como filtro (estéril) para eliminar fragmentos de medio de cultivo y micelio. Posteriormente, de la suspensión filtrada se colocaron 20 µL en una cámara de Neubauer y con la ayuda de un microscopio óptico (10x; Olympus) se contaron las esporas y la concentración de esporas se expresó en esporas mL^-1. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Análisis estadístico. Los resultados se expresaron como el promedio de tres repeticiones ± desviación estándar. Para la actividad de inhibición del crecimiento micelial se realizó un análisis de varianza (ANOVA) seguido de una prueba de Tukey y para la actividad de inhibición en la producción de esporas se realizó una prueba de Dunette con respecto al control negativo. Se utilizó el paquete estadístico Sigma Plot version 11.0. Se consideró diferencia estadística significativa con un valor de p ˂0.05.

Resultados y discusión

Perfil fitoquímico. La cantidad de extracto obtenido para el EAAc fue de 20 g (0.57 %) y 2.8 g (0.93%) para el EAAa. Se determinó que los extractos EAAc y EAAa presentaron diferentes compuestos fitoquímicos (Cuadro 1). La variabilidad se debe principalmente a la polaridad del disolvente utilizado en la extracción, ya que la extractabilidad de estos depende de su naturaleza y solubilidad (^{Bui et al., 2021}). En este sentido, los flavonoides que se presentaron en el EAAa generalmente son extraídos con disolventes altamente polares como el agua, mientras que los alcaloides detectados en el EAAc son insolubles o poco solubles en agua, por lo que se extraen con otros disolventes orgánicos como etanol, metanol, acetona y cloroformo. Aunque también la presencia o ausencia de compuestos se debe a los factores bióticos o abióticos a los que se han sometido las plantas (^{Pavarini et al., 2012}). Aunado a lo anterior, las saponinas detectadas en A. cupreata ya han sido reportadas por ^{Salazar-Pineda et al. (2017}) y ^{Urbina et al. (2018}); mientras que, para A. angustifolia se han identificado saponinas esteroidales en extractos metanólicos de hojas (^{Pereira et al., 2017}). Algunos autores señalaron que estos compuestos son muy comunes en el género y se han identificado yucagenina, hecogenina, tigogenina, diosgenina, ruizgenina y clorogenina en Agaves como: A. lechuguilla, A. americana, A. inaquides, A. hookeri, A. fourcroydes, A. brittoniana y A. macroacantha (^{López-Salazar et al., 2019}; ^{González-Madariaga et al., 2020}). En cuanto a los triterpenos, ^{Ahumada-Santos et al. (2013}) reportaron la presencia de p-cymeno, limoneno, β-trans ocimeno, linalool, α-terpineol, nerol, geraniol y trans-nerolidol en extractos de A. angustifolia, mientras, ^{Salazar-Pineda et al. (2017)} señalan la presencia cualitativa de triterpenos en los extractos de las hojas de A. cupreata. También se ha detectado la presencia de α-linalol, α-terpineno, limoneno, geraniol, nerol, α-cubebeno, cadineno y trans-nerolidol entre otros, en extractos de Agave salmiana, Agave tequilana y Agave potatorum (^{Soto-Castro et al., 2021}). Para los flavonoides, ^{Ahumada-Santos et al. (2013)} mencionaron que la cantidad de flavonoides en A. angustifolia fue baja. El kaemferol, ramnosido de myrcetina y arabinosido de quercetina se han identificado en los extractos metanólicos de las hojas de Agave attenuata y de manera cualitativa en A. potatorum (^{Soto-Castro et al., 2021}).

Efecto de extractos de Agave spp., sobre el crecimiento micelial. Los extractos presentaron efectos diferentes sobre el crecimiento micelial de los hongos (Figura 1). En general, se observó disminución del crecimiento de la colonia (Figura 1 A2-E2), presencia de micelio aéreo (Figura 1 B 2 y 3; D 2 y 3), algodonoso (Figura 1 A5, C5, D5, E5) y deforme (Figura 1 A2, A5, C5, E5) y la producción de pigmentos (Figura 1 A2, A3, A4, C5 y D3). Así mismo, se determinó que las colonias correspondientes al control negativo se desarrollaron con forma, tamaño y textura normales (Figura 1 A1-E1).

Aunque no se han realizado estudios relacionados con el efecto de negativo de A. angustifolia y A. cupreata sobre la morfología de los hongos que se evaluaron, ^{Siddhapura et al. (2011}) mencionaron que los extractos metanólicos de Agave ferox, A. marginata, A. americana, A. montana y A. scabra tuvieron un efecto sobre el desarrollo de Postia placenta. Los efectos observados en el cambio de morfología, textura, expansión vertical del micelio, deshidratación y producción de pigmentos ya han sido reportados (^{De la Cruz- Ricardez et al., 2020}). Sin embargo, es importante indicar que el mecanismo por el cual se producen está relacionado con la acción de los metabolitos con la pared celular. Por ejemplo, los aceites esenciales de Lavandula angustifolia y Eucalyptus globulus indujeron la formación de pliegues rugosos, torsión, descamación, fracturas y deshidratación de las hifas de Monilinia fructicola y Rhizopus stolonifer (^{da Silva et al., 2020}; ^{De la Cruz- Ricardez et al., 2020}).

Figura 1 Efecto del extracto acuosos de hoja de A. angustifolia (EAAa) y del extracto de acetona de A. cupreata (EAAc) sobre el crecimiento de cinco hongos fitopatógenos incubados en PDA 5% durante 24 y 72 h de exposición. A) E. sorghinum; B) F. subglutinans; C) L. viticola; D) L. iraniensis; E) Colletotrichum sp. C (+): antifúngico Mancozeb (Manzate®) a 16 mg mL-1; C(-): agar PDA 5%. 

El efecto antifúngico de los EAAa y EAAc a diferentes concentraciones contra los hongos fitopatógenos se muestra en el Cuadro 2. La inhibición del crecimiento micelial del EAAc (39-76%) presentó diferencia significativa (p≤0.05) en comparación con el EAAa (20-40%). Del cuadro se desprende que las especies L. viticola, E. sorghinum y Colletotrichum sp. fueron sensibles al EAAc, determinándose porcentajes de inhibición del crecimiento micelial entre 38-76% a concentraciones de 16 y 8 mg mL^-1 (p≤0.001).

Para el EAAa los porcentajes de inhibición del crecimiento micelial en las concentraciones de 4-16 mg mL^-1 sobre E. sorghinum y Colletotrichum sp., no presentaron diferencias estadísticas significativas (p≥0.064) para estas especies. Mientras que este extracto fue el único que presentó actividad contra F. subglutinans a 16 mg mL^-1. Adicionalmente, la exposición a EAAa no tuvo efecto en L. viticola y L. iraniensis.

Los resultados obtenidos documentan por primera vez la actividad antifúngica de los extractos polares EAAa y EAAc sobre hongos fitopatógenos de interés económico. Sin embargo, otros autores sustentan el potencial antifúngico de extractos polares obtenidos de diferentes especies de Agaves (A. montana, A. americana, A. marginetta, A. lechuguilla, A. scabra y A. ferox) contra Fusarium oxysporum, F. solani, F. udum y Colletotrichum gloeosporioides determinando porcentajes de inhibición del crecimiento micelial en rangos de 15-100% (^{De Rodríguez et al., 2011}; ^{Maharshi y Thaker, 2014}; ^{González-Alvarez et al., 2015}).

Los resultados de este estudio demuestran que los extractos de Agave presentan una variabilidad tanto en su perfil fitoquímico ( Cuadro 1) como en su actividad de inhibición del crecimiento micelial sobre hongos fitopatógenos (Cuadro 2). El efecto biológico que ejerce cada compuesto sobre distintos microorganismos ha sido reportado. ^{Lagrouh et al. (2017}) mencionaron el efecto antifúngico de los alcaloides y les atribuyeron la capacidad de intercalarse con el ADN, detener la síntesis de proteínas, inducir la apoptosis e inhibir las enzimas del metabolismo de carbohidratos. Mientras que ^{Zhao et al. (2021}), mencionaron que el alcaloide licorina daña la integridad de la membrana celular, disminuye la viabilidad y tiene un efecto sobre la expresión de GTPasa BcMPS1, Bccdc, BcRac y BcRas1 en B. cinerea. Asimismo, los mecanismos de acción antifúngicos para los flavonoides se han reportado en Aspergillus fumigatus y Candida albicans y se han relacionado con la precipitación de proteínas y la formación de complejos con los aminoácidos nucleofílicos de las proteínas inactivándolas y provocando la detención del desarrollo. En contraste, en B. cinerea su efecto se atribuye a la inhibición de la endo-1,3-β-glucanasa fúngica (^{Jin, 2019}; ^{Tapia-Quirós et al., 2020}). Por su parte, en R. solani, los compuestos terpénicos afectan la permeabilidad de la membrana del patógeno, provocando trastornos metabólicos e inhibiendo el crecimiento micelial, también disrumpen el potencial de la membrana mitocondrial (provocando perdida de estructura y función), inhiben el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, reducen el contenido de ATP e inhiben las ATPas (^{Yan et al., 2020}). En cuanto a las saponinas, se ha determinado que estos compuestos forman complejos con los esteroles en las membranas causando su desintegración debido a la formación de poros y finalmente lisis celular (^{Zaynab et al., 2021}). Por otro lado, ^{Ito et al. (2007}) mencionaron que la α tomatina induce apoptosis mediada por acumulación de especies reactivas de oxígeno en F. oxysporum.

Efecto de los extractos de Agave spp., sobre la producción de esporas. El efecto de los extractos sobre la producción de esporas en cada una de las cepas de hongos ensayados se muestra en la Figura 2. Los resultados más sorprendentes se obtuvieron con el extracto de EAAa que presentó 40% inhibición del crecimiento micelial para F. subglutinans y Colletotrichum sp., sin embargo, se observaron porcentajes de disminución en la producción de esporas de 92 y 86.6% respectivamente con respecto al control negativo (Figura 2 B y E). Este resultado es relevante para el control de estos fitopatógenos porque impediría su reproducción y diseminación. Por el contrario, el EAAa estimuló la producción de esporas de E. sorghinum y L. viticola (Figura 2 A y C), determinándose un aumento del 407.5 y 73.2% respectivamente en comparación con el control negativo (p≤0.001). Mientras que para L. iraniensis no se observó efecto sobre la disminución de las esporas (Figura 2D). Para el extracto EAAc, que presentó mayor inhibición del crecimiento micelial sobre L. viticola, E. sorghinum y Colletotrichum sp. (Cuadro 2), sólo se observó una disminución del 35.6 % en la producción de esporas de L. viticola (Figura 2C), respecto al control negativo (p≤ 0.001) y para E. sorghinum, F. subglutinans, L. iraniensis y Colletotrichum sp. (Figura 2 A, B, D y E) no se encontraron diferencias en la producción de esporas con respecto al control negativo (p≥0.05).

Figura 2 Efecto del extracto acuoso de hojas de A. angustifolia (EAAa) y del extracto de acetona de A. cupreata (EAAc) sobre la producción de esporas de cinco hongos fitopatógenos incubados en PDA 5% durante 72 h de exposición. C(-): control negativo, agar PDA 5%. Los resultados expresan en promedio de tres repeticiones ± desviación estándar. Prueba estadística Dunnet con respecto al C(-). * = significativo (p˂0.05); altamente significativo (** p˂0.001). 

Aunque se ha evaluado el efecto de extractos de diferentes agaves sobre la inhibición del crecimiento micelial en diversas especies de hongos, los estudios sobre la inhibición de la esporulación son escasos. En este sentido, ^{Lozano-Muñiz et al. (2011}), encontraron que los extractos acuosos y metanólicos obtenidos de las hojas y flores de A. americana, A. asperrima, A, lechuguilla, A. tequilana afectaron negativamente la conidiogénesis de Aspergillus parasiticus y Aspergillus flavus reportando que los extractos metanólicos de A. asperrima y A. americana causaron cambios notables en la morfología de los conidióforos que pueden afectar la conidiogénesis. Otros autores señalaron que la inhibición o estimulación en la producción de esporas son respuestas posibles de los hongos al ser expuestos a diferentes extractos. Por ejemplo, ^{Achimón et al. (2020}), reportaron que los aceites esenciales de Pimenta dioica y Curcuma longa (1000 mg L^-1) inhibieron el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides M3125 en 87.2 y 55.5% respectivamente, pero al mismo tiempo, los porcentajes de producción de conidios fueron de 3046.4 y 341% respectivamente; también determinaron que los aceites de Rosmarinus officinalis presentaron poca actividad de inhibición del crecimiento (24%), pero inhibieron en 27% la producción de conidios con respecto al control, lo anterior es similar a lo observado en este estudio.

Conclusiones

El perfil fitoquímico de los extractos de A. angustifolia y A. cupreata confirmó la presencia de alcaloides, flavonoides, saponinas y triterpenos.

El extracto acuoso de A. cupreata presentó efecto antifúngico contra L. viticola, Colletotrichum sp. y E. sorghinum inhibiendo el 76, 60 y 59 % del crecimiento micelial respectivamente en concentraciones de 8 y 16 mg mL^-1 (p≤0.05), mientras que, disminuyó la producción de esporas en un 86% en Colletotrichum sp. Por lo que puede ser utilizado como una alternativa para la búsqueda de nuevos antifúngicos naturales.

El extracto acetónico de A. angustifolia inhibió el 40% del crecimiento micelial de E. sorghinum a 16 mg mL^-1 (p≤0.05) sin limitar su esporulación (p≥0.05).