Caracterización bioquímica del estrés oxidativo durante la interacción compatible entre el Pepper golden mosaic virus y plantas de chile habanero

Aguilar-Sánchez, Cristina; Minero-García, Yereni; Hernández-Zepeda, Cecilia; Moreno-Valenzuela, Oscar Alberto; Aguilar-Sánchez, Cristina; Minero-García, Yereni; Hernández-Zepeda, Cecilia; Moreno-Valenzuela, Oscar Alberto

doi:10.18781/r.mex.fit.2111-1

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Revista mexicana de fitopatología

On-line version ISSN 2007-8080Print version ISSN 0185-3309

Rev. mex. fitopatol vol.40 n.2 Texcoco May. 2022 Epub Oct 03, 2022

https://doi.org/10.18781/r.mex.fit.2111-1

Artículos científicos

Caracterización bioquímica del estrés oxidativo durante la interacción compatible entre el Pepper golden mosaic virus y plantas de chile habanero

Cristina Aguilar-Sánchez¹

Yereni Minero-García²

Cecilia Hernández-Zepeda³

Oscar Alberto Moreno-Valenzuela²^*

^¹División Académica Multidisciplinaria de Jalpa de Méndez, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, Carretera estatal libre Villahermosa Comalcalco Km 27 S/N, Ranchería, Jalpa de Méndez, Tabasco, C.P. 86205;

^²Unidad de Bioquimica y Biología Molecular, Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C., Calle 43 # 130, Chuburna de Hidalgo, Mérida, Yucatán, México, C.P. 97205;

^³Unidad de Ciencias del Agua, Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C. , Calle 8, No. 39, Mz. 29, S.M. 64 Cancún, Quintana Roo, México, C.P. 77500; 1

Resumen.

En este trabajo, se realizó el análisis in vitro del papel de la infección por la cepa del Pepper golden mosaic virus-mosaico (PepGMV-Mo) en los niveles de peróxido de hidrógeno (H₂O₂), ácido salicílico (SA, por su término en inglés) y de las enzimas antioxidantes catalasa (CAT) y peroxidasa (POX), durante la interacción compatible entre el PeGMV-Mo y Capsicum chinense. Los niveles endógenos de H₂O_2, SA, CAT y POX fueron monitoreados en un experimento curso temporal y los niveles de las cuatro variables incrementaron en las plantas inoculadas con PepGMV-Mo en comparación con el control de infección simulada (vector de clonación sin virus o infección simulada, mock) y con plantas sanas. Se observaron tres picos de incremento del H₂O₂ en las plantas inoculadas durante el curso temporal. El primer incremento se observó al inicio de la línea del tiempo, a 30 minutos después de la inoculación (mdi) y el último pico se observó al final del experimento, a 24 días después de la inoculación (ddi). Las concentraciones del SA incrementaron a las 12 horas después de la inoculación (hdi) en las plantas inoculadas con el virus en comparación con las plantas control y las plantas sanas. La concentración de SA incrementó a las 12 horas después de la inoculación (dpi) en las plantas inoculadas con el PepGMV-Mo en comparación a las plantas control y plantas sanas. Debido a la infección con el PepGMV-Mo, la actividad de CAT y POX incrementó. Se observó un incremento en la actividad de CAT a las 4 hdi en las plantas infectadas con PepGMV-Mo y un decremento en la actividad CAT correlacionada con el incremento en la concentración de AS a las 12 hpi en las plantas infectadas. La actividad de POX fue mayor en las plantas infectadas que en las plantas control y las plantas sanas durante el curso temporal. En conjunto, los resultados sugieren que el estrés oxidativo está involucrado en la interacción compatible entre el PepGMV-Mo y C. chinense; sin embargo, esta explosión oxidativa no fue suficiente para conferir resistencia o tolerancia contra el virus con base en el fenotipo observado en plantas de chile habanero.

Palabras clave: plantas in vitro; peróxido de hidrógeno; ácido salicílico; peroxidasa; catalasa

Abstract.

In this work, the role of Pepper golden mosaic virus-mosaic strain (PepGMV-Mo) infection on hydrogen peroxide (H₂O₂), salicylic acid (SA), and the antioxidant enzymes catalase (CAT) and peroxidase (POX) were analyzed in vitro during the compatible interaction between PepGMV-Mo and Capsicum chinense plants. Endogenous H₂O_2, SA, CAT and POX were monitored over time, and the levels of all four were increased in the PepGMV-Mo-Mo inoculated plants compared to the mock-inoculated (cloning vector) and healthy plants. Three peaks of H₂O₂ were observed in the inoculated plants during the time course experiment. The first increase was observed at the beginning of the time course experiment, at 30 minutes post inoculation (mpi), and the last at the end of the experiment, at 24 days post inoculation (dpi). The SA concentration increased 12 hours post-inoculation (hpi) in inoculated plants relative to mock-inoculated and healthy plants. Due to PepGMV-Mo infection, CAT and POX activity increased. An increase in CAT activity was observed 4 hpi in PepGMV-Mo-infected plants, and a decrease in CAT activity correlated with the increase in SA concentration at 12 hpi in the infected plants. POX activity was higher in the infected plants than in the mock-inoculated and healthy plants for the duration of the time course experiment. Taken together, the findings suggest that oxidative stress is involved in the compatible interaction between PepGMV-Mo-Mo and C. chinense; however, this burst was not sufficient to confer resistance or tolerance to habanero pepper against the virus based on symptom phenotype observed.

Key words: in vitro plants; hydrogen peroxide; salicylic acid; peroxidase; catalase

El geminivirus Pepper golden mosaic virus (PepGMV) es un virus bipartita monocatenario transmitido por la mosquita blanca y es considerado un patógeno importante que infecta a varios cultivos de solanáceas, incluyendo a diferentes especies de Capsicum en México y Centroamérica (^{Barboza et al., 2018}; ^{Hernández-Espinal et al., 2018}; ^{Méndez-Lozano et al., 2001}; ^{Nakhla et al., 2005}). Con base en sus propiedades genómicas y biológicas, se reportaron tres cepas del PepGMV: PepGMV-Serrano (PepGMV-Se), PepGMV-Mosaico (PepGMV-Mo) y PepGMV-Distortion (PepGMV-Di), que causan síntomas diferentes en las plantas infectadas. PepGMV-Se causó un mosaico dorado brillante, PepGMV-Mo produjo un mosaico amarillo verdoso y PepGMV-Di causó únicamente un leve mosaico y distorsión foliar, seguido de un fenotipo de “recuperación” (^{Brown et al., 2005}), que ha sido relacionado con el silenciamiento de genes postranscripcionales y transcripcionales (^{Rodríguez-Negrete et al., 2009}). En la accesión Capsicum chinense BG-3821 se caracterizó un rasgo de resistencia genética geminiviral y se encontró que los genes marcadores para la resistencia sistémica adquirida (RSA) se indujeron después de la inoculación de hojas de plantas resistentes con el PepGMV (^{García-Neria y Rivera-Bustamante, 2011}). Estos resultados sugieren que la resistencia en plantas depende, al menos en parte, de la respuesta temprana a infecciones por virus, tal como la inducción de genes relacionados con la producción de H₂O₂.

Las plantas responden a ataques de patógenos mediante la activación de las defensas locales y de las sistémicas, que restringen el crecimiento y la propagación del patógeno. En hojas infectadas, estas defensas suelen involucrar la respuesta hipersensible (RH) y la formación de lesiones necróticas en el sitio de infección (^{Lukan et al., 2018}; ^{Park et al., 2007}). Con el tiempo, las partes no inoculadas de la planta desarrollan una RSA duradera (^{Clark et al., 2007}). Uno de los primeros eventos en la RH es una explosión del metabolismo oxidativo que conduce a la generación de radicales de anión de superóxido (O^2-) y de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) (^{Wohlgemuth et al., 2002}). El peróxido de hidrógeno es una importante molécula señal en la defensa de la planta contra el estrés biótico y abiótico (^{Quan et al., 2008}; ^{Mejía-Teniente et al., 2019}). Las plantas han desarrollado mecanismos antioxidantes para la protección contra el daño causado por las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS por sus términos en inglés). Las principales enzimas depuradoras de ROS en plantas incluyen CAT y POX. En tubérculos de papa infectados con Erwinia chrysanthemi, por ejemplo, se observó que se duplicó la actividad de CAT en tubérculos de papa infectados, en comparación con tubérculos con inoculación simulada (^{Miguel et al., 2000}). En otro estudio, en el que cultivares de tomate susceptibles y resistentes fueron infectados con Ralstonia solanacearum, aumentaron las actividades de la glutatión peroxidasa, la superóxido dismutasa, la ascorbato peroxidasa y la catalasa. Sin embargo, el mecanismo antioxidante demostró ser mucho más fuerte en los cultivares resistentes (^{Mandal et al., 2011}). En plantas de tomate, la inoculación de filtrados de hongos saprobios aumentó la actividad enzimática de CAT, POX y otras enzimas antioxidantes. Estos aumentos fueron eficientes en el control de la severidad del tizón temprano causado por Alternaria solani en plantas de tomate (^{Rodrigues-Alencar et al., 2020}). Por lo general, las plantas responden a una infección viral con la generación de ROS y una sobrerregulación de enzimas antioxidantes. En las interacciones compatibles del Cucumber mosaic virus y del Zucchini yellow mosaic virus con plantas de Cucumis sativus y Cucurbita pepo, respectivamente, se reportaron aumentos en las actividades antioxidantes de CAT, POX y superóxido dismutasa. De esta forma, las enzimas antioxidantes contribuyen al estrés oxidativo en las interacciones sistémicas planta-virus (^{Riedle-Bauer, 2000}).

El ácido salicílico (SA por su término en inglés) es una señal clave en la defensa de la planta contra infecciones virales y es considerado fundamental para la activación de las respuestas de resistencia, tanto locales como sistémicas (^{Klessig et al., 2018}). Los hallazgos reportados en la literatura indican una interacción H₂O₂-SA en la que el H₂O₂ y SA constituyen un sistema autoamplificante: el H₂O₂ induce la acumulación de SA y el SA aumenta los niveles de H₂O₂ (^{Van Camp et al., 1998}). El SA participa en la inducción de la interacción incompatible entre plantas y virus. Después de esta inducción, la planta responde con varios mecanismos para limitar la propagación viral en el sitio de infección. Dichos mecanismos incluyen el aumento en la producción de ROS, proteínas relacionadas con la patogénesis, la inducción de RH, etc. (^{Baebler et al., 2014}). El SA también es responsable de la activación de la resistencia sistémica adquirida (RSA) en tejidos distales, que reduce los efectos de ataques secundarios. El SA puede inducir la resistencia al Tobacco mosaic virus (TMV) al afectar su habilidad de replicarse en el tejido inoculado de Nicotiana benthamiana (^{Chivasa et al., 1997}). También está involucrado en la inhibición de movimiento de larga distancia al infectarse Arabidopsis thaliana con el Cucumber mosaic virus (CMV). Sin embargo, diferentes especies hospedantes pueden resistir infecciones del mismo virus de formas muy distintas (^{Mayers et al., 2005}). El objetivo del presente estudio fue investigar el papel del peróxido de hidrógeno, el ácido salicílico y enzimas antioxidantes durante la interacción compatible entre la cepa PepGMV-Mo y el chile habanero (Capsicum chinense) cultivado in vitro.

Materiales y métodos

Materiales vegetales y tratamientos

Se germinaron semillas de chile habanero (Capsicum chinense) in vitro usando un medio basal MS. Las semillas se desinfectaron con hipoclorito de sodio (2%) y 70% etanol, se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se incubaron a 50 °C por 30 min para eliminar posibles patógenos presentes en las semillas. Las plantas in vitro se mantuvieron en un cuarto bajo condiciones ambientales controladas (25 a 26 °C, fotoperiodo 16:8 h (luz/oscuridad), intensidad de luz de 50.26 mmol m^-2 s^-1).

Inoculación de plantas con el PepGMV-Mo

Clonas infecciosas del PepGMV-Mo (ADN A y ADN B), donados por el Dr. Rafael Rivera-Bustamante, fueron usados para inocular plántulas de chile habanero con un procedimiento de inoculación por biolística descrito anteriormente (^{Idris et al., 2001}). Las terceras o cuartas hojas de plantas in vitro en la etapa de cuatro hojas fueron bombardeadas de manera directa a 900 psi He con partículas de oro (1 μg, BioRad, Hercules, CA) cubiertas con ADN viral como ya se describió (^{Hernández-Zepeda et al., 2007}a). Para la inoculación simulada, las plantas fueron bombardeadas con el vector de clonación (Bluescript) sin el genoma del virus. Como control se usaron plantas sanas sin inocular. Se realizaron cuatro experimentos separados, cada uno de los cuales consistieron en seis plantas inoculadas para cada punto del curso temporal del experimento, para plantas infectadas con el virus, simuladas y sanas.

Análisis de material vegetal y de ADN

Se recolectó material vegetal de tejido infectado sistémico tras cumplirse los siguientes tiempos: 0 y 30 min; 1, 2, 4, 8, 12 y 24 h; y 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 días). Las muestras se congelaron de inmediato en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. El ADN total fue extraído para cada tratamiento como ya se describió (^{Echevarría-Machado et al., 2005}).

Se amplificó un fragmento de 576 bp usando los iniciadores prAV324 y prAC889 (^{Hernández-Zepeda et al., 2007}a). Se realizó la PCR usando Polimerasa RedTaq (Bioline) según lo descrito por ^{Hernández-Zepeda et al. (2007b)}. Los productos de la PCR fueron clonados en el Vector pGEMT-Easy (Promega, Madison, WI, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante y los insertos clonados fueron secuenciados por Macrogen Inc. Las secuencias fueron editadas y alineadas usando EditSeq y MegAlign (DNAStar versión 5.08, Madison, EE. UU.) y se les realizó una búsqueda de BLASTx usando la base de datos del NCBI GenBank.

Southern blot

Cinco microgramos de ADN total de cada tratamiento se digirieron con HindIII y se cargaron a un gel de agarosa a 1%. Después de la electroforesis, el ADN se transfirió a una membrana Hybond N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por acción capilar usando una solución de 20X de 0.15 M de cloruro de sodio y 0.015 M de citrato de sodio (SSC). Posteriormente, la membrana fue hibridada por UV. La hibridación se llevó a cabo con 500 ng del genoma A de PepGMV-Mo como sonda. La sonda se etiquetó usando AlkPhos Direct™ (Alkphos Direct Hybridization kit, Amersham, Arlington Heights, Illinois, EE. UU).

Cuantificación de peróxido de hidrógeno

Una versión modificada del método de sulfato de amonio ferroso /naranja de xilenol (FOX) fue usada para determinar los contenidos de H₂O₂ de los extractos de las hojas, como se reportó anteriormente (^{Cheeseman, 2006}). La mezcla de ensayo después de la adición de la muestra contenía 250 mM de sulfato de amonio ferroso, 100 mM sorbitol, 90% etanol y 100 mM naranja xilenol en 25 mM ácido sulfúrico en un volumen total de 3 mL. El ensayo midió la diferencia de absorbancia entre 550 y 800 nm por al menos 15 min y el color se mantuvo estable por al menos 1 h. El estándar fue preparado por dilución en 30% H₂O₂ (grado reactivo, SIGMA). La concentración de H₂O₂ en el reactivo fue calibrado con la absorbancia a 240 nm y un coeficiente de extinción de 43.6 M^-1 cm^-1.

Cuantificación de ácido salicílico

El ácido salicílico se extrajo del tejido foliar (0.3 g) y se analizó según lo descrito por ^{Gaffney et al. (1993}), con varias modificaciones. Los extractos de metanol (2.5 mL) se dividieron en dos partes iguales, con una parte analizada para SA libre y la otra, para SA conjugado. Las muestras finales fueron resuspendidas en 500 µL metanol, de los cuales se inyectaron 50 µL en una columna cromatográfica líquida de alto rendimiento (Agilent Technology serie 1200, columna Alltima C18 de fase reversa). La elución en gradiente escalonado se llevó a cabo con 20 mM de acetato de sodio (pH 5.0) más 20% metanol (solvente A) y 20 mM de acetato de sodio (pH 5.0) más 70% metanol (solvente B). Las condiciones de separación fueron iguales a las descritas por ^{Uknes et al. (1993}): gradiente de 10 min de 5 a 30% solvente B, 100% B y re-equilibrado a 5% B.

Actividad enzimática

La extracción de proteínas se realizó mediante el uso de un amortiguador de fosfato (pH 7.0) y la cuantificación de proteínas totales se llevó a cabo según lo descrito por ^{Peterson (1977}). La actividad de la catalasa se determinó siguiendo la generación de O₂ según lo descrito por ^{Inamine y Baker (1989}). La mezcla reactiva contenía 100 mM de amortiguador de fosfato de potasio (pH 7.0) y 20 g mL^-1 de extracto de proteína en 3 mL de solución. La reacción se inició al agregar 10 µL de 30% [2.2 mM] (w/v) H₂O₂ (grado reactivo, SIGMA). La actividad de POX se midió con guayacol (4 mM, e= 26.6 mM^-1 cm^-1) como sustrato en 0.05 mM C₂H₃NaO₂ (pH 5.0) a 25 °C. La reacción inició usando 2.2 mM H₂O₂. La oxidación subsecuente de guayacol se midió como un cambio de absorbancia a 470 nm en un espectrofotómetro (DU 800; Beckman, Munich, República Federal de Alemania) por 3 min (^{Berg y Huystee, 1984}).

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por sextuplicado y los datos generados fueron los resultados de cuatro experimentos separados. Las actividades enzimáticas, proteínas, H₂O₂ y concentraciones de SA son valores medios de 24 muestras.

Resultados

Infección por PepGMV-Mo y desarrollo de síntomas

Para controlar las variables ambientales, se desarrolló un protocolo de infección in vitro para el PepGMV-Mo en su hospedante compatible, el chile habanero (Capsicum chinense). Las plantas inoculadas presentaron síntomas típicos asociados a la infección por PepGMV-Mo (Figura 1G-I), aunque los síntomas estaban ligeramente atenuados. Los síntomas asociados con la infección por PepGMV-Mo fueron visibles a los nueve dpi en las plantas inoculadas. Los síntomas observados son el enrrollamiento de las hojas y leves mosaicos color verde amarillento en las hojas nuevas (Figura 1G). No se observaron síntomas en plantas sanas o con inoculación simulada (Figuras 1A-C y 1D-F). Los síntomas de mosaico amarillo y de distorsión foliar continuaron desarrollándose hasta 24 dpi (Figura 1I). Se detectó PepGMV-Mo en las nuevas hojas sistémicas de las plantas inoculadas. Se analizaron las muestras para la detección de PepGMV-Mo en las plantas infectadas. En las plantas infectadas se detectó un fragmento de 576 bp de la región central del gen Cp con el uso de PCR (ver métodos). No existió amplificación en las muestras de plantas sanas o con inoculación simulada. Se seleccionó un total de 15 secuencias, que se compararon mediante identidad de nucleótidos por pares con el clon original del PepGMV-Mo. Todos los clones secuenciados presentaron una identidad de 98-100% con el clon original de ADN-A PepGMV-Mo y 95-98% de identidad nucleótida con otros aislamientos de PepGMV-Mo reportados anteriormente en el GenBank. La hibridación del Southern blot se usó para evaluar la acumulación de ADN viral. Se observaron las tres formas replicativas esperadas del ADN en las plantas infectadas e inoculadas con PepGMV-Mo: el círculo abierto, la doble cadena y una sola cadena. Mientras que la forma de una sola cadena no se observó a 9 dpi, las formas de una y dos cadenas sí fueron observadas a 24 dpi (Figura 1J). Estos resultados confirman la validez del sistema infeccioso in vitro para evaluar la interacción entre el chile habanero y PepGMV-Mo. En particular, todas las formas replicativas de PepGMV-Mo fueron detectadas en las hojas recién desarrolladas de todas las plantas infectadas.

Figura 1 Las plantas de chile fueron inoculadas de manera biolística o no inoculadas para formar tres grupos diferentes de tratamiento. A. Planta testigo sana en tiempo cero; B. Planta testigo sana a 9 dpi; C. Planta sana a 21 dpi; D. Planta con inoculación simulada a 0 dpi; E. Planta con inoculación simulada a 9 dpi; F. Planta con inoculación simulada a 21 dpi; G. Planta inoculada con PepGMV-Mo en tiempo cero; H. Planta inoculada con PepGMV-Mo a 9 dpi; I. Planta inoculada con PepGMV-Mo a 21 dpi. Todas las plantas fueron cultivadas en medio MS basal. J. Acumulación de ADN viral. Columna 1, ADN de plantas inoculadas con PepGMV-Mo a 9 dpi; Columna 2, ADN de plantas inoculadas con PepGMV-Mo a 21 dpi; columna 3, ADN de plantas con inoculación simulada a 9 dpi; columna 4, ADN de plantas con inoculación simulada a 21 dpi. Las siguientes formas replicativas de ADN viral se muestran a continuación: ADNmc (ADN monocatenario), ADNse (ADN superenrollado) y ADNca (ADN de círculo abierto).

Generación de peróxido de hidrógeno en plantas de chile habanero infectadas con PepGMV-Mo.

Después del bombardeo, los niveles de H₂O₂ aumentaron de manera significativa en plantas con inoculación simulada y en las inoculadas con el PepGMV-Mo a los 30 mpi. En contraste, no se observó aumento en H₂O₂ en las plantas sanas, lo cual indica que el daño mecánico debido al procedimiento de inoculación fue el responsable de la explosión oxidativa inicial. El contenido de H₂O₂ en las plantas con inoculación simulada y en las inoculadas con el PepGMV-Mo fue de 4.6 y 4.8 veces mayor, respectivamente, que el contenido en plantas sanas. Después de este aumento inicial en los niveles de H₂O₂, se observó una reducción gradual en plantas con inoculación simulada y en las inoculadas con el PepGMV-Mo hasta 8 hpi. A las 12 hpi, se observó un segundo pico de aumento en las plantas infectadas, con un contenido de H₂O₂ 2.4 y 1.8 veces mayor que el contenido en plantas sanas y con inoculación simulada, respectivamente (Figura 2A). Así, la diferencia significativa en la producción de H₂O₂ podría relacionarse con la presencia del virus en plantas de chile. Se observó un tercer pico de H₂O₂ en las plantas inoculadas con el virus a 21 dpi que fue dos veces mayor que en los niveles en plantas sanas y con inoculación simulada (Figura 2B).

Figura 2 Análisis de curso-temporal de los niveles de H2O2 en plantas de chile habanero inoculadas con PepGMV-Mo. A. Contenido de H2O2 durante el periodo de respuesta temprana postinoculación (0-24 hpi); B. Experimento de curso-temporal de 0 a 24 dpi. Plantas inoculadas con PepGMV-Mo (p); plantas con inoculación simulada (l); plantas sanas (n). Los datos son los valores medios ± SE de 24 repeticiones de cuatro experimentos independientes.

Generación de ácido salicílico en chiles habaneros infectados con PepGMV-Mo

Los niveles de SA aumentaron de forma significativa después de la inoculación por biolística del PepGMV-Mo en plantas inoculadas y con inoculación simulada. A los 30 mpi, el contenido de SA en plantas con inoculación simulada y en las infectadas con el PepGMV-Mo fue 4.0 y 6.2 veces mayor, respectivamente, que el contenido de SA en plantas testigo sanas y no inoculadas. Estos resultados indican con claridad que el aumento inicial en los niveles de SA y H₂O₂ se podían atribuir al daño mecánico causado por la inoculación por biolística. Después de este aumento inicial, se observó una reducción de ocho veces en los niveles de SA a las 8 hpi, tanto en plantas con inoculación simulada como en aquellas inoculadas con el PepGMV-Mo (Figura 3A). A 12 hpi, aumentos de 4.5 y 7.8 veces se observaron en plantas con inoculación simulada y con inoculación con el PepGMV-Mo, respectivamente, en relación con los niveles observados en plantas sanas (Figura 3A). Si bien se observaron aumentos en plantas con inoculación simulada y en las inoculadas con el PepGMV-Mo, la diferencia en contenidos de SA entre ellas fue de 58%. Esta diferencia sugiere que el contenido de SA en ese momento refleja la respuesta de la planta a la infección viral. Tal como se observó con H₂O₂, un tercer pico de aumento del contenido de SA se presentó a los 21 dpi en plantas inoculadas con PepGMV-Mo. En este momento, el contenido de SA en plantas infectadas fue tres veces mayor al contenido de SA en plantas con inoculación simulada e inoculación con PepGMV-Mo (Figura 3B). Los aumentos en los niveles de SA y H₂O₂ en plantas infectadas con PepGMV-Mo indican el inicio de una respuesta tardía (21 dpi) correspondiente a la RSA.

Figura 3 Análisis de curso-temporal del contenido de ácido salicílico de plantas de chile habanero inouladas con PepGMV-Mo. A. Contenido de AS durante la respuesta temprana postinoculación (0-24 hpi); B. Experimento de curso-temporal de 0 a 24 dpi. Plantas inoculadas con PepGMV-Mo (p); plantas con inoculación simulada (l); plantas sanas (n). Los datos son los valores medios ± SE de 24 repeticiones de cuatro experimentos independientes.

Actividad enzimática antioxidante en chile habanero infectada con PepGMV-Mo. Actividad de Catalasa (CAT).

Se observó un aumento en la actividad de catalasa en plantas de chile habanero infectadas con el PepGMV-Mo. La actividad de esta enzima aumentó de forma gradual en plantas infectadas con PepGMV-Mo, con un pico de aumento a las 4 hpi. En este punto, la actividad de CAT en las plantas con inoculación simulada y con inoculación con el PepGMV-Mo fueron 2.1 y 4.7 veces mayor, respectivamente, que la actividad en plantas sanas (Figura 4A). La actividad de CAT después se redujo en las plantas inoculadas con el PepGMV-Mo y aumentó en las plantas testigo. A los 12 dpi, la actividad de CAT en plantas con inoculación simulada, plantas inoculadas con el PepGMV-Mo y las plantas sanas fueron similares (Figuras 4B), lo que sugiere que la actividad de CAT podría estar regulada por el aumento en la concentración de SA a las 8 hpi (Figura 3A).

Figura 4 Análisis de curso-temporal de la actividad específica de catalasa en plantas de chile habanero inoculadas con PepGMV-Mo. A. Actividad de CAT durante la respuesta temprana postinoculación (0-24 hpi); B. Experimento de curso-temporal de 0 a 24 dpi. Plantas inoculadas con PepGMV-Mo (p); plantas con inoculación simulada (l); plantas sanas (n). Los datos son los valores medios ± SE de 24 repeticiones de cuatro experimentos independientes.

Actividad de guayacol peroxidasa (POX)

Se observaron dos picos de aumento de la actividad de POX durante las primeras 12 hpi. En el primer pico de aumento a las 4 hpi, la actividad de POX fue 3.3 veces mayor en plantas inoculadas que en aquellas con inoculación simulada o sanas. En el segundo pico de aumento a las 12 hpi, la actividad de POX fue 3.5 y 5.8 veces mayor en plantas con inoculación simulada y con las inoculadas con el PepGMV, respectivamente, en comparación con plantas sanas (Figura 5A). La actividad de esta enzima antioxidante aumentó de forma gradual en plantas inoculadas con el PepGMV-Mo en el transcurso del experimento. A los 9 dpi, la actividad de POX fue 1.3 y 4.6 veces mayor en plantas inoculadas con PepGMV-Mo que en plantas con inoculación simuladas y sanas, respectivamente (Figura 5B). A los 18 dpi, la actividad de POX fue 4.7 veces mayor en plantas inoculadas que en aquellas con inoculación simulada o plantas testigo (Figura 5B).

Figura 5 Análisis de curso-temporal de la actividad específica de peroxidasa en plantas de chile habanero inoculadas con PepGMV-Mo. A. Actividad de POX durante la respuesta temprana postinoculación (0-24 hpi); B. . Experimento de curso-temporal de 0 a 24 dpi. Plantas inoculadas con PepGMV-Mo (p); plantas con inoculación simulada (l);plantas sanas (n). Los datos son los valores medios ± SE de 24 repeticiones de cuatro experimentos independientes.

Discusión

En el presente estudio, identificamos respuestas que ocurren de forma temprana o de forma tardía después de la inoculación del chile habanero con el PepGMV-Mo. El desarrollo de síntomas en el presente estudio fue consistente con reportes previos del aislado PepGMV-Mo (^{Brown et al., 2005}) y todas las plantas fueron susceptibles a infecciones virales. Sin embargo, algunos de los síntomas en el sistema in vitro se vieron atenuados debido a las diferentes variables que afectaban a estas plantas.

Poco se sabe de la intervención de ROS en el desarrollo de síntomas y patogénesis en el contexto de interacciones compatibles planta-virus. Si bien no se observó una RH en plantas infectadas con el PepGMV-Mo en el presente estudio, sí se observó una explosión oxidativa, con tres picos de aumento principales de H₂O₂, a los 30 mpi y hasta los 24 dpi. El primer pico de aumento observado a los 30 mpi se debió al daño mecánico causado por la inoculación biolística. La producción intensiva de EOR ha sido reportado en células heridas y células sujetas a tensión mecánica (^{Olson y Varner, 1993}), por lo que no sorprende que explosiones oxidativas ocurrieran en todos los tratamientos a los 30 min después de la inoculación biolística. En interacciones célula vegetal-bacteria, la fase I de la explosión es considerada una reacción biológicamente no específica (^{Wojtaszek, 1997}). El segundo pico de aumento, observado 12 hpi en plantas infectadas con el PepGMV-Mo, es consistente con reportes previos que asocian la producción de ROS durante la fase II con un disparador de la RH en la resistencia de plantas no hospederas (^{Wojtaszek, 1997}). Así, el segundo pico de aumento puede asociarse con la infección del PepGMV-Mo, con la respuesta de la planta a esta infección y al desarrollo de síntomas. Estudios anteriores, incluyendo un reporte acerca de la infección por Plum pox virus (PPV) de plantas de durazno susceptibles (^{Hernández et al., 2006}), indican que niveles altos de ROS pueden contribuir al desarrollo de síntomas y patogénesis en interacciones planta-virus compatibles. En interacciones planta-virus incompatibles, la generación de ROS juega un importante papel en la resistencia al virus. Sin embargo, en interacciones planta-virus compatibles, poco se sabe de la intervención de ROS en el desarrollo de síntomas y en la patogénesis. Previamente se reportó que la generación de ROS no es suficiente para causar una reacción hipersensible en interacciones planta-virus compatibles o el colapso de tejidos y la restricción del patógeno en el sitio de infección (^{Riedle-Bauer, 2000}). De manera similar, los resultados del presente estudio demuestran que en la interacción de chile habanero-PepGMV-Mo compatibles, la producción de ROS no fue suficiente para conferir tolerancia y la enfermedad se pudo desarrollar.

El SA exógeno puede inducir resistencia a virus, incluso en plantas que no poseen un gen de resistencia. Esta resistencia se caracteriza por una reducción en la infectividad del virus y un retraso en el inicio de los síntomas, además de que ocurre en la ausencia de la muerte celular macroscópica o de una reacción hipersensible (^{Murphy et al., 1999}). Esto sugiere que las plantas poseen otro mecanismo por el cual el SA media en la resistencia a los virus. Sin embargo, los niveles mayores de SA a 12 hpi no inhibieron el desarrollo de síntomas en las plantas in vitro de chile habanero infectadas con el PepGMV-Mo. Los resultados del presente estudio demostraron que el PepGMV-Mo, un virus de ADN, puede inducir un aumento en SA en una interacción compatible junto con una respuesta bimodal, como ya ha sido reportado (^{García-Neria y Rivera-Bustamante, 2011}). Además, esta respuesta puede restringir la propagación de ciertos virus de ARN en infecciones compatibles (Murphy y Carr, 2002; ^{Takahashi et al., 2002}). Los marcadores para la señalización del SA, como el PR-1, son sobrerregulados durante las infecciones sistémicas por varios virus de ARN (^{Huang et al., 2005}). Se encontró que la infección por el CaMV, por ejemplo, estimulaba la expresión dependiente de SA de PR-1, PR-2 y PR-5 en ecotipos susceptibles de Arabidopsis (^{Laird et al., 2004}). También se ha encontrado que los virus de ADN estimulan vías de señalización mediadas por el SA, tanto en interacciones compatibles como incompatibles. ^{Garcia-Neria y Rivera-Bustamante (2011)} reportaron dos picos de aumento en los días dos y cinco post-inoculación en los niveles de SA en infecciones de PepGMV tanto compatibles como incompatibles. Estos investigadores demostraron que la cinética de la producción de SA era similar, tanto en plantas resistentes como susceptibles, aunque la concentración en la planta resistente era de dos a tres veces mayor en tejidos infectados. En el tejido infectado sistémico, también observaron una respuesta bimodal, aunque en el tejido sistémico infectado, los niveles de AS fueron menores que en el tejido infectado inoculado. Las plantas susceptibles presentaron dos picos de aumento en el contenido de SA en los días 5 y 10 post-inoculación. En el presente trabajo se usaron plantas susceptibles para los experimentos. En este estudio se observaron dos picos de aumento de SA, el primero a las 12 hpi y el segundo, a los 21 dpi. Estos resultados fueron similares a los resultados obtenidos por ^{Garcia-Neria y Rivera-Bustamante (2011)}, con un pico de aumento en los primeros días después de la inoculación con el virus en plantas susceptibles y otro pico de aumento al final del curso temporal del experimento. Nuestros resultados sugieren que la RSA está involucrada en la interacción compatible entre PepGMV-Mo y el chile habanero, aunque no fue suficiente para conferir resistencia a las plantas de chile.

Nuestros hallazgos también indican una interacción entre el H₂O₂ y el SA, que resulta en un sistema autoamplificante para la defensa de las plantas: el H₂O₂ induce la acumulación de SA, y éste aumenta los niveles de H₂O₂ (^{Van Camp et al., 1998}). El aumento en los niveles observados de SA a las 12 hpi en plantas infectadas con PepGMV-Mo estuvo acompañado de aumentos en los niveles de H₂O₂. Esta relación fue confirmada a los 21 dpi en plantas infectadas, cuando un aumento en los niveles de H₂O₂ ocurrió de forma simultánea con un aumento en el contenido de SA.

Las plantas reaccionan a las infecciones virales con una sobrerregulación de enzimas depuradoras de radicales libres, como SODs, catalasas y peroxidasas (^{Riedle-Bauer, 2000}). En las plantas, el principal depurador enzimático de H₂O₂ de células fotosintéticas es la CAT, que convierte al H₂O₂ en H₂O y O₂ (^{Quan et al., 2008}). Se observó un aumento temprano en la actividad de CAT en la interacción compatible entre PepGMV-Mo y las plantas de chile habanero, lo cual resultó en un nivel de actividad 2 veces mayor al del testigo a las 4 hpi. Tras este pico, la actividad de CAT fue similar a la de las plantas testigo. Nuestros resultados contrastan con las reducciones ya reportadas para la actividad de la catalasa en Phaseolus vulgaris infectado con el WClMV y en tabaco infectado con el TMV (^{Chen et al., 1993}; ^{Clarke et al., 2002}; ^{Neuenschwander et al., 1995}). En plantas de pepino inoculadas con Cucumber mosaic virus (CMV), la actividad de CAT no fue afectada (^{Riedle-Bauer, 1998}). La reducción de CAT después de 4 hpi puede haber conducido al aumento observado en niveles de H₂O₂ y la inducción de RSA (^{Neuenschwander et al., 1995}).

El aumento en la actividad de las POX en el desarrollo de la enfermedad se ha correlacionado con la expresión de resistencia, aunque también se ha reportado un aumento de actividad en hospedantes que permiten la infección sistémica (^{Kozlowska et al., 2001}; ^{Riedle-Bauer, 2000}). En el presente estudio, la actividad de la peroxidasa aumentó a lo largo del experimento. Un estudio previo, realizado por ^{Milavec et al. (2008}), demostró que en el periodo temprano, después de la inoculación de plantas de papa con Potato virus Y (PVY), el virus indujo un aumento de dos veces en la actividad de las POX solubles, POX unidas iónicamente y POX unidas covalentemente a las 3 hpi, mientras que en plantas susceptibles, la actividad de las POX disminuyó en el periodo temprano y el aumento no se observó antes de las 24 hpi. En contraste con esta última observación, en el presente trabajo, en las plantas susceptibles infectadas con PepGMV-Mo, el primer aumento en la actividad de POX se observó a las 2 hpi en comparación con la inoculación simulada y con plantas sanas, similar a los resultados obtenidos para plantas de papa tolerantes y resistentes al PVY (Milavec et al, 2008). Previamente se reportó que en plantas de papa con inoculación simulada y susceptibles a PTY^NTN, las peroxidasas solubles y las unidas iónicamente disminuyeron en relación con las plantas intactas. Los autores propusieron que estos efectos pudieran ser el resultado de lesiones y del efecto de sustancias presentes en la savia de plantas sanas (^{Milavec et al., 2001}). En contraste, se observó que la actividad total de las POX aumenta en plantas con inoculación simulada en relación con plantas sanas. Estas diferencias podrían deberse al uso de diferentes inoculaciones simuladas. En el reporte de ^{Milavec et al. (2001)}usaron la savia de la planta sana como inoculación simulada y en este trabajo usamos el vector de clonación Bluescript como inoculación simulada. Este último tratamiento no contiene las sustancias presentes en la savia que podrían desactivar la actividad de las POX. ^{Riedle-Bauer (2000)} reportó que en las plantas susceptibles de Cucumis sativa y Cucurbita pepo infectadas con el Cucumber mosaic virus (CMV) y el Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), la actividad total de POX aumentó 14 y 6 veces en plantas a los 20 dpi, respectivamente, mientras que las hojas sistémicas presentaron síntomas virales, con un aumento en la acumulación de H₂O₂. En el presente trabajo se obtuvieron resultados similares. La actividad de POX en hojas sistémicas continuó en aumento a lo largo del curso temporal del experimento, con una mayor actividad observada entre los 18 y 24 dpi. Este aumento en la actividad de POX se relacionó con un aumento en la acumulación de H₂O₂ a 24 dpi. Estos resultados sugieren que la actividad total de las peroxidasas está involucrada en la producción de H₂O₂ durante las interacciones planta-virus (^{Riedle-Bauer, 2000}). Desde hace mucho tiempo se ha sugerido que las peroxidasas producen H₂O₂ (^{Milavec et al., 2008}; ^{Elstner y Heupel, 1976}). Más recientemente se encontró que las peroxidasas de las paredes celulares son responsables de al menos parte del H₂O₂ producido en la explosión oxidativa (^{Hernández et al., 1993}; ^{Bestwick et al., 1997}; ^{Bolwell et al., 1995}). Tomados de manera conjunta, los datos obtenidos indican que los aumentos en las defensas antioxidantes no son suficientes para conferir resistencia o tolerancia para las plantas de chile habanero en la interacción compatible con PepGMV-Mo y que los síntomas observados podrían estar relacionados con este aumento. La manera en que los aumentos en la actividad de H₂O₂, SA y POX a los 21 dpi se relacionan con la remisión de síntomas requerirá de más investigación, de preferencia en un sistema in vivo.

Conclusiones

Los resultados in vitro demuestran que las plantas de chile habanero responden al virus compatible PepGMV-Mo al activar la síntesis y acumulación de H₂O₂ y SA y al aumentar la actividad de CAT y POX. Asimismo, la vía de RSA se activó pero es insuficiente para conferir resistencia a las plantas de chile habanero.

Agradecimientos

Agradecemos al CONACyT por la Beca de doctorado #106105 y por la beca de doctorado entregada a Cristina Aguilar-Sánchez. Nuestros agradecimientos también para el Dr. Rafael Rivera-Bustamante por donarnos los clones infecciosos de PepGMV, a la Dra. Rosa Maria Escobedo-Gracia Medrano por sus comentarios críticos y a la M.C. Miriam Monforte-González por su apoyo técnico.

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Recibido: 15 de Noviembre de 2021; Aprobado: 13 de Marzo de 2022

^*Corresponding autor: oamv@cicy.mx

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