Las zonas áridas y semiáridas en México representan más de 50% de territorio y se dividen en matorrales (85%) y pastizales (15%), situación contraria hace 150 años (^{PMARP, 2012}). Por ello, ^{Sánchez et al. (2018}), indican la importancia de las gramíneas nativas para recuperar la antigua condición y funcionalidad del pastizal sin alterar el ecosistema árido vulnerable. Para establecer praderas de temporal utilizando semilla (sensu lato), existen recomendaciones como usar propágulos completos (glumas, lemas, paleas, aristas y ramillas modificadas) o cariópsides; la cual, entre más grande, tendrá embrión grande, mayor endospermo, peso y vigor de plántula (^{Quero et al., 2016}; ^{Quero et al., 2017}). Sin embargo, un problema que se puede tener son los hongos patógenos asociados a semilla de especies forrajeras de importancia que pueden resultar en enfermedades en el ganado (^{Pirelli et al., 2016}), por lo que una semilla infectada y/o contaminada puede introducir un patógeno en un lote/región/país (^{Sandoval et al., 2012}). Los tratamientos de semilla son una herramienta efectiva para combatir los impactos negativos de enfermedades, ayudan a los agricultores a producir cultivos de mejor calidad (^{FAO y AfricaSeeds, 2019}). Los tratamientos erradicantes son más especializados que los preventivos y están diseñados para eliminar un patógeno específico por medios físicos o químicos, estos pueden ser efectivos contra estados de infección profundos, ya que pueden penetrar el tejido de las semillas y matar patógenos sin causar fitotoxicidad. El control biológico de patógenos transmitidos por semillas se realiza a través de tres mecanismos, la inducción de resistencia, la competencia o eliminación del patógeno y la producción de antibióticos y están basados en el antagonismo que los microorganismos puedan presentar entre sí (^{Maude, 1985}). Dentro de los agroquímicos, existe en el mercado los de contacto que persiste en el exterior de la planta (aplicación foliar), que evitan que las esporas de los hongos germinen y penetren en las células del cultivo, por mencionar algunos de ellos: Captan, Zineb, Maneb, Mancozeb, Tiram, Folpet, Quintozano y Clorotalonil (^{Chirinos et al., 2020}). Otro grupo de agroquímicos, son los sistémicos, que se absorben a través del follaje, tallos y raíces y donde el sistema vascular ayuda a dispersar los compuestos activos por toda la planta (^{Arriagada, 2000}). El uso de los agroquímicos, conlleva a conocer su modo de acción para evitar riesgo de resistencia, por ello, conocer la sensibilidad del patógeno al fungicida es vital para el buen control sanitario de la semilla (^{Sandoval et al., 2012}). El método más utilizado para determinar sensibilidad, es integrar al medio de cultivo algún producto plaguicida bajo niveles controlados y condiciones de laboratorio (^{Dhingra y Sinclair, 1995}). En México, la necesidad de recursos genéticos forrajeros que garanticen establecimiento, calidad, alta persistencia y adaptación a condiciones regionales hace necesarios estudios sobre sanidad de semilla (^{Quero et al., 2007}) y, además, conocer la sensibilidad de los agroquímicos para integrar el manejo en la sanidad de la semilla. Por lo tanto, el objetivo de la investigación fue determinar el efecto in vitro de seis fungicidas y un biológico (Bacillus subtilis) contra Alternaria alternata, Bipolaris cynodontis y Fusarium incarnatum.

Se emplearon colonias de A. alternata, B. cynodontis y F. incarnatum, aisladas de semilla comercial de B. curtipendula cosechada en 2017 (^{Quero et al., 2020}). Las colonias se sembraron en medio PDA (papa-dextrosa-agar) durante ocho días, a 28 ± 2 °C. Se evaluaron fungicidas comerciales: de contacto (Captan y Mancozeb), sistémicos (Benomilo, Procloraz, Tiabendazol y Tiofanato-metil) y un producto biológico a base de B. subtilis. Las concentraciones finales se calcularon con base al ingrediente activo y volumen a preparar de medio PDA (Cuadro 1). El efecto del producto se determinó por agregación del fungicida al medio de cultivo PDA (^{Dhingra y Sinclair, 1995}) a diferente concentración: 0 (control), 0.005, 0.001, 0.05, 0.01, 0.5, 0.1, 1, 5, 10, 100, 150, 200, 250 y 300 mg L^-1. Se sembró un disco de micelio de 0.5 cm de diámetro en el centro de cajas Petri, con tres repeticiones por concentración. Los discos se obtuvieron de colonias puras de seis días de crecimiento en PDA, incubadas en oscuridad a 25 ± 2 °C. Se midió el diámetro bidireccional de colonias cada 48 h, hasta que el testigo llenó la caja y, por promedio, se calculó el crecimiento micelial:

%IM=CML-CMICMLx 100

dónde: IM, inhibición crecimiento micelial (%); CML, Crecimiento micelial; CMI, Crecimiento micelial influenciado (^{Patiño y Rodríguez, 2001}).

Se utilizó un diseño completamente al azar y, con los datos de porcentaje de inhibición, se realizó un análisis de varianza simple, por patógeno. Al no cumplirse la distribución normal de datos, estos se transformaron mediante arcoseno (^{Gabriel et al., 2021}) y la comparación de medias con Tukey (p≤0.05) mediante el programa estadístico R. La concentración efectiva (CE₅₀) se obtuvo al transformar cada concentración [log(x)] y relacionarla con el porcentaje de inhibición.

En la mayoría de los tratamientos se obtuvo una reducción de crecimiento micelial de los patógenos con respecto al control. Tanto la sensibilidad de A. alternata, B. cynodontis y F. incarnatum, a las diferentes concentraciones de los fungicidas evaluados, como el cálculo de la mayor concentración efectiva que inhibe el 50% del crecimiento micelial del hongo (CE₅₀) (Cuadro 2), fueron determinadas a ocho días después de la siembra.

Efecto sobre el crecimiento micelial de Alternaria alternata . Tiabendazol y Benomilo en diferentes concentraciones no fueron eficientes para inhibir el hongo; lo anterior, debido a que se observó un máximo de 7.2 y 10.8% de inhibición con dosis más altas 5 y 100 mg L^-1, respectivamente (Cuadro 2). Estos datos coinciden con ^{Herrera et al. (2011}) y ^{Cristóbal et al. (2013}), quienes indicaron que, con dosis de 500 y 450 mg L^-1 de Benomilo, se inhibe 35.6 y 45% del crecimiento de Alternaria spp., concentraciones mayores a las evaluadas en este experimento. En el caso de Captan se observó inhibición de 83.3% a 200 mg L^-1, superior a lo que reportaron ^{Parveen et al. (2013}) con 36% de inhibición de A. alternata a la misma concentración. Mancozeb mostró datos similares a Captan con 85% de inhibición, pero a dosis superior (Cuadro 2). ^{Malandrakis et al. (2015}) indicaron datos similares para A. alternata. Procloraz presentó inhibición similar a Mancozeb y Captan, con 84.1%, pero, a dosis inferior (1 mg L^-1); por tanto, este producto podría ser viable para el control de este hongo. ^{Iacomi et al. (2004}) reportan inhibición del 100% para A. alternata en rábano, superior a los datos reportados en este trabajo. Solo Tiofanato-metil (10 mg L^-1) inhibió 100% a la dosis más alta evaluada. Para B. subtilis, a partir de 0.05 y 1 mg L^-1 inhibió el 93%, similar a lo reportado por ^{Ñacato et al. (2018}), quienes determinaron a B. subtilis como altamente eficiente para el control biológico contra Alternaria spp. (Cuadro 2).

Efecto sobre el crecimiento micelial de Bipolaris cynodontis. Tiabendazol (5 mg L^-1) y Benomilo (100 mg L^-1), fueron los de menor eficiencia para inhibir el crecimiento micelial de B. cynodontis con 4.5 y 27.7% de inhibición. ^{Alburqueque y Gusqui (2018}), reportaron 10.3% de inhibición de Phytophthora infestans; 37%, para Botrytis cinerea y 100%, para Rhizoctonia solani, a 200 mL L^-1 de Tiabendazol, con dosis superior comparado con esta investigación.

Captan, Mancozeb, Procloraz y Tiofanato-metil inhibieron 100% del hongo a altas concentraciones evaluadas, datos inferiores a lo reportado por ^{Imran et al. (2013}), donde registraron el 53% de inhibición de B. oryzae a 50 mg L^-1. ^{Arce et al. (2019}), puntualizaron que los porcentajes de inhibición de Bipolaris spp. con Benomil, Mancozeb y Tiofanato-metil fueron bajos, en comparación a los valores observados en la presente investigación (Cuadro 2). ^{Rondón et al. (2006}) reportan datos similares de inhibición (100%) en Colletotrichum gloeosporioides con Procloraz y a partir de 100 mg L^-1.

Para el caso particular del producto biológico B. subtilis, este fue más eficiente que los fungicidas químicos a las concentraciones evaluadas, con porcentaje de inhibición micelial de 94.7 a 100%. Datos similares a aquellos reportados por ^{Rivero et al. (2008}). Para B. subtilis se reporta un CE₅₀ de 0.00023 mg L^-1, concentración inferior al resto fungicidas evaluados (Cuadro 3).

Efecto sobre el crecimiento micelial de Fusarium incarnatum. El Tiofanato-metil presentó menor eficiencia de inhibición micelial para el hongo en la dosis más alta evaluada, con 88.5% de inhibición. El resto de los fungicidas presentaron eficiencia de inhibición micelial que osciló de 93 a 100%, en las dosis más elevadas evaluadas. Estos datos evidencian la susceptibilidad del hongo a los fungicidas evaluados. Respecto a CE₅₀, Mancozeb requiere altas dosis (300 mg L^-1) para inhibir 50% de hongo, por lo que su eficiencia fue baja. Por otra parte, B. subtilis (CE₅₀ a 0.00014 mg L^-1) fue eficiente en todas las dosis evaluadas, con inhibición que osciló de 97 a 100%, mostrando que, a partir de 0.01 mg L^-1 inhibió el 100% a F. incarnatum. ^{Romero et al. (2015}), obtuvieron datos similares con B. subtilis a dosis de 0.01 mg L^-1 contra F. solani, aislado de chayote; por otro lado, ^{Song et al. (2014}) observaron que a concentración de 1 x 10⁶ UFC de B. subtilis, se alcanzó un control de 70% contra F. incarnatum, aislado de raíz de Ginseng (Panax ginseng).

Captan inhibió en promedio, 93% del crecimiento micelial de los tres hongos (Cuadro 3); lo anterior, debido a su modo de acción multisitio que interfiere con el mecanismo de respiración celular, dificultando el desarrollo micelial y translocándose hacia diversos tejidos a partir del tratamiento a semillas o suelo (^{Peláez et al., 2016}). Mancozeb presentó efectividad de 93%, su mecanismo de acción se basa en la modificación e inactivación de proteínas sensibles a redox como aquellas para transcripción, traducción y estrés oxidativo del ADN, además de otros procesos metabólicos que resultan en citotoxicidad; además, a través de un modo de acción de multisitio que no genera resistencia en el patógeno (^{Roede y Miller, 2014}). Benomilo solo fue efectivo para F. incarnatum; al igual que Tiabendazol, resultó efectivo solo para Fusarium; lo anterior se observó también con Benomilo, dado que pertenecen al mismo grupo químico y poseen similitud de acción (^{Peláez et al., 2016}). ^{Sandoval et al. (2011}) mencionaron que Fusarium es sensible a Benomilo; sin embargo, es probable que sea mutagénico y puede incrementar el grado de resistencia de patógenos ante su efecto. Por otro lado, Procloraz presentó efectividad de 94%, este fungicida pertenece al grupo químico de Imidazoles, con acción preventiva, translaminar, sistémica y curativa que inhibe la biosíntesis de ergosterol en la membrana celular fúngica, mismo que se relaciona con el crecimiento y división celular (^{Tapia, 2005}). Tiofanato-metil presentó alta efectividad de inhibición (96%) de crecimiento de las tres especies de hongos investigadas, este es un fungicida sistémico (con movimiento en la planta a través de xilema), de tipo preventivo; el cual, causa anormalidades en la germinación de esporas, interfiere en la mitosis y la síntesis del ADN de las células fúngicas (^{Alburqueque y Gusqui, 2018}). Es reconocido que el tratamiento a semillas controla patógenos de raíz como Rhizoctonia y Fusarium spp.; sin embargo, el mejor inhibidor fue el biológico B. subtilis; lo anterior, dado que a la concentración mínima evaluada (0.005 mg L^-1) inhibió 97% del crecimiento micelial de las tres especies de hongos fitopatógenos aislados previamente y definidos como dominantes en semilla comercial de B. curtipendula. Se ha identificado a B. subtilis como productor de una amplia gama de compuestos bioactivos potencialmente inhibidores del crecimiento de hongos fitopatógenos (^{Bottero et al., 2017}); los cuales, tienen múltiples mecanismos de acción, alterando procesos celulares como homeostasis intracelular de calcio, metabolismo energético y procesamiento de ARN (^{Villareal et al., 2018}).

Las concentraciones evaluadas están representadas por su análogo logarítmico, dando como resultado la línea sigmoidea donde B. subtilis establece una marcada respuesta antagónica, la cual, además, posee elevada resistencia al manejo y de fácil adquisición en el mercado, por lo que es una herramienta valiosa para optimizar el establecimiento de praderas de esta especie, mejorando así la sanidad de la semilla.

Los resultados muestran la efectividad de los fungicidas evaluados para el control de los tres hongos; con excepción de Benomilo y Tiabendazol. La combinación de fungicidas contacto + sistémico es una práctica común que complementan el tratamiento, asegurando la protección de la semilla y su germinación suprimiendo la acción de hongos patógenos (^{Arriagada, 2000}).

Los fungicidas de contacto Captan y Mancozeb y los sistémicos Procloraz y Tiofanato-metil dieron resultados variables para el control de A. alternata, B. cynodontis y F. incarnatum. Los fungicidas sistémicos inhibieron el crecimiento micelial a bajas concentraciones; lo anterior, en comparación con aquellas alcanzadas por Captan y Mancozeb. No es recomendable el uso de Benomilo y Tiabendazol debido a la baja inhibición presentada. Bacillus subtilis fue el de mayor inhibición micelial desde 90% para la mínima concentración evaluada (0.005 mg L^-1) y, por tanto, representa una alternativa importante para mejorar la calidad sanitaria de semilla de Bouteloua curtipendula dado su potencial para controlar patógenos, por su costo accesible y disponibilidad en el mercado.