Las plantas son una fuente importante de compuestos bioactivos contra plagas agrícolas. En particular las plantas con actividad nematicida y sus derivados tienen el potencial de utilizarse en campo y cubrir parte de la demanda de nematicidas químicos. Se han aislado compuestos químicos de varias familias de plantas, particularmente Asteraceae de manera in vitro (α-Terthienyl) (^{Chitwood, 2002}; ^{Oka, 2010}, 2012); sin embargo, esos compuestos no han demostrado su efectividad en campo y no se han desarrollado comercialmente (^{Gommers y Bakker, 1988}). Inula viscosa, una Asteraceae común en países mediterráneos, ha demostrado tener actividad nematicida debido que en sus brotes produce ácido cósico y ácido isocóstico compuestos que fueron aislados y aplicados contra Meloidogyne javanica (^{Oka, 2001}). Los extractos de las hojas y flores de la Verbesina encelioides también se evaluaron contra el nematodo M. javanica, con resultados favorables (^{Oka, 2012}). Además de las Asteraceae, los aceites esenciales y sus constituyentes monoterpenos de otras plantas herbáceas como Ocimum sanctum, Xylopia aethiopica, Thymus vulgaris, entre otras, han demostrado tener efectos nematicidas (^{Eloh et al., 2019}).

Meloidogyne incognita es uno de los nematodos más dañinos en la agricultura mundial, con afectaciones en una diversidad de cultivos anuales y perennes. La alimentación y desarrollo de las hembras provocan engrosamientos de las raíces y genera importantes lesiones al expulsar la masa de huevos hacia el suelo. Cuando se tiene alta densidad de población, el daño a las raíces es mayor que provoca perdida de rendimiento y calidad de la producción (^{Aissani et al., 2013}; ^{Pavaraj et al., 2012}). La estrategia de control más utilizada para el manejo del nematodo es el uso de plaguicidas sintéticos. Sin embargo, dichos plaguicidas incrementan los costos de producción y afectan la dinámica del suelo por el uso de moléculas de los grupos de los organofosforados, carbamatos y algunos productos fumigantes de alta residualidad, causando fuerte problemas de contaminación ambiental (^{Murcia y Stashenko, 2008}; ^{Álvarez et al., 2015}).

Ante esta problemática es importante evaluar alternativas de menor impacto como el uso de estrategias biorracionales, como el uso de Verbesina sphaerocephala. Esta Asteraceae es endémica del occidente de México (Jalisco, Michoacán, Nayarit, Guanajuato, Guerrero) (^{Rzedowski et al., 2011}) y se conoce con los nombres comunes de capitaneja, capitana, árnica capitaneja, vara blanca o palo espino, es una especie de uso no tan extendido y, solo se cuenta con información taxonómica y etnobotánica, esta última realizada en la comunidad de San Martin de las Flores Jalisco, donde los habitantes la utilizan por su actividad etnofarmacológica y potencial agrícola (^{Velasco-Ramírez et al., 2019}). Por consiguiente, se propone como, control nematicida botánico (extracto acuoso); ya que este tipo de extractos pueden ser elaborados por el mismo productor y así utilizarlos como alternativa para minimizar la incidencia y daños ocasionados por nematodos en cultivos de interés comercial, como el pepino (Cucumis sativus).

El pepino es la cuarta hortaliza mayormente cultivada en el mundo con una producción de 1,7 millones de toneladas en el 2016 (^{Sayedain et al., 2021}) siendo México el quinto productor mundial con una producción de 826,485 toneladas. Los principales estados productores de esta hortaliza en México son: Sinaloa (268,878 t ha^-1), Sonora (152,457 t ha^-1), Michoacán (67,653 t ha^-1) y el décimo lugar lo ocupa Jalisco (20,454 t ha^-1) (^{SIAP, 2020}). A pesar de su importancia, el cultivo presenta mermas considerables en los rendimientos, debido a plagas y enfermedades. Por ejemplo, las enfermedades han sido Fusarium spp, Rhizoctonia spp, Damping off (Phytophthora spp. yPythium spp.), Mancha angul (Pseudomonas syringae) y el nematodo agallador (Meloidogyne spp.) (^{Satyendra y Rekha, 2021}). Por lo anterior el objetivo de esta investigación fue probar si extractos acuosos obtenidos de las hojas de V. sphaerocephala promueven el desarrollo y reducen los daños causados por M. incognita en plantas del pepino (Cucumis sativus).

Se recolectaron hojas jóvenes (fase vegetativa) sanas (asíntomaticas) de la especie silvestre Verbesina sphaerocephala en los cerros aledaños de la comunidad de San Martin de las Flores en el municipio de San Pedro Tlaquepaque, Jalisco (longitud: -103.282778 latitud: 20.585278 a 1540 msnm). Las hojas se secaron a temperatura ambiente en el laboratorio (~26 °C), se pulverizaron en un molino de cuchillas (Hamilton Beach® 80335) y fueron sometidas a un análisis de química proximal y análisis fitoquímico para determinar las principales biomoléculas contenidas en las hojas. Posteriormente, 100 g de peso seco se vertió en 1 L de agua destilada con agitación constante durante 15 min, seguido de autoclave a 121 °C por 1 h a 1.2 kg cm². Los extractos calientes fueron pasados a través de papel filtro Whatman No. 40 y almacenados en frascos de vidrio a 4 °C. Los extractos líquidos de V. sphaerocephala fueron designados como solución madre, adicionalmente se midió pH y conductividad eléctrica (CE, dS m^-1). Finalmente, el color de los extractos se determinó visualmente. Todos los parámetros se evaluaron por triplicado.

Una población de Meloidogyne incognita previamente identificada a través de claves morfométricas y pictóricas, (^{Eisenback et al., 1983}) y obtenida del cultivo de jitomate ubicado en el invernadero escuela del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA) de la Universidad de Guadalajara, se aisló para su cría y reproducción in vivo en plantas de jitomate (Solanum lycopersicum) en bolsas de polietileno con capacidad de 3 kg (20 x 15 cm) en condiciones de invernadero en el área de Fitopatología del CUCBA.

Para la obtención del inóculo se lavaron las raíces con agua corriente, se cortaron en trozos de aproximadamente 1 cm de longitud, se pesaron 10 g y se colocaron en una batidora. Posteriormente, se agregaron 20 mL de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 0.5% y 180 mL de agua destilada batiéndose durante 3 min. A continuación, se filtró por un tamiz de 25 µm, donde quedaron retenidos los huevos y se almacenaron en un vaso de precipitado; la suspensión de huevos se aforó a 200 mL. Del vaso de precipitados se tomó una alícuota de 1 mL de la suspensión de huevos y con ayuda de las cuadriculas de una caja contadora de disección se realizó el conteo en el microscopio compuesto (^{Hussey y Barker, 1973}). A los 20 días después de la siembra, en 24 bolsas de polietileno se procedió a la inoculación del nematodo, vaciando 105 mL maceta^-1 de la suspensión de huevos, distribuidos en tres orificios de 5 cm de profundidad. De esta manera se inocularon 3,030 huevos a cada maceta.

El experimento se llevó a cabo en septiembre del 2019 en el invernadero del CUCBA con semillas de pepino paraíso Enza Zaden (100 semillas) previamente esterilizadas en una solución de hipoclorito sodio al 10% durante 30 min y posteriormente enjuagadas con agua destilada, fueron sembradas en una charola de germinación en una mezcla de sustrato de turba y vermiculita 50:50 (esterilizado en autoclave a 121 °C por 20 min a 1.21 kg cm²), las cuales se dio riego diario a capacidad de campo. Se dejaron crecer en el invernadero durante 30 días y posteriormente se trasplantaron en macetas de plástico de una mezcla homogeneizada de sustrato de arena y suelo de hojas previamente esterilizado en autoclave en una proporción 70:30. Las plantas se mantuvieron en el invernadero a 27-32 °C bajo condiciones de luz natural con riegos cada dos días y fertilización cada 72 h, utilizando el fertilizante Poly-Feed® (19-19-19) con una dosis de 1g L^-1 hasta concluir el experimento.

Se montaron siete tratamientos diferentes: 1: Testigo, plantas sin nematodos (P), 2: plantas con nematodos (P+N), 3: plantas con nematodos y carbofuran (Furadan®) 350 g L^-1 (P+N+C), 4: plantas con nematodos y Trichoderma sp. 200 mL L^-1 (P+N+T), 5: plantas con nematodos y extracto de V. sphaerocephala al 25% (P+N+V 25%), 6: plantas con nematodos y extracto de V. sphaerocephala al 15% (P+N+V 15%) y 7: plantas con nematodos y extracto de V. sphaerocephala al 10% (P+N+V 10%). La aplicación de los extractos fue de 50 mL por maceta. Todos los tratamientos se aplicaron después del segundo día de trasplante y directamente después de la inoculación. El experimento fue organizado en un diseño de bloques al azar con cinco repeticiones (macetas) y se repitió dos veces.

Se realizaron tres evaluaciones (cada 10 días) durante el crecimiento inicial del cultivo hasta concluir el experimento y se consideraron las variables de altura de la planta (cm, desde el meristemo apical a la raíz principal), diámetro del tallo (mm), concentración de clorofila [SPAD (Soil Plant Analisis Development)- 502], número de hojas y número de flores. Al término del experimento, 40 días después, las plantas junto con la raíz fueron removidas, lavadas con agua potable de grifo y posteriormente se registró longitud de las raíces (cm), índice de agallamiento y número de huevos en 10 g de raíz. Por otro lado, se realizó la extracción y conteo de larvas en 20 g de raíz de acuerdo a lo establecido por ^{Bridge y Page (1980}) y se registró el peso seco del tejido, el cual se mantuvo a 60 °C durante 48 h en un horno de secado marca felisa®. Finalmente, se contabilizaron número de larvas en 100 g de suelo por tratamiento, basado en la técnica del embudo de Baermann a partir de sustrato húmedo (^{Barker, 1985}).

Los datos recopilados del experimento se analizaron mediante ANOVA de una vía para cada variable por tratamiento y tiempos de evaluación y una prueba de comparación de medias Tukey (p <0.05) utilizando el software estadístico Statgraphics® Centurion XV (New Jersey, United States) para Windows.

Las evaluaciones de química proximal de V. sphaerocephala mostraron 17.7% de proteínas, 10.4% de fibra cruda, 15.2% de cenizas totales, 4.6% de extracto etéreo, 2.9% de Nitrógeno, 45.2% de Carbohidratos y 6.8% de humedad; lo cual contiene una gran cantidad de carbohidratos, que explica la alta capacidad de absorción de agua. El análisis fitoquímico (Cuadro 1) arrojó resultados donde demuestran la presencia de metabolitos secundarios fenólicos y alcaloides en extractos acuosos obtenidos de las hojas, que muchos de ellos pueden estar presentes en la interacción planta patógeno y función defensiva frente a parásitos o insectos por su toxicidad, respectivamente. Los valores de pH para los extractos de V. sphaerocephala fueron alcalinos (8.33) y la CE fue de 1 a 1.3 dS m^-1 y el color fue verde intenso.

El efecto de los extractos de V. sphaerocephala sobre el desarrollo de plantas de C. sativus para la variable altura de planta fue significativamente (P= 0.0103) mayor en el tratamiento P+N durante la primera evaluación con un promedio de 24.6 cm, en la segunda evaluación el tratamiento de P+N+V10% obtuvo un mayor crecimiento con 26 cm y en la tercera evaluación el tratamiento de P+N+V25% obtuvo un promedio de 27.2 cm (Figura 1A). El diámetro del tallo fue significativamente (P= 0.0514) mayor en los tratamientos P+N+T y P+N+V15% durante la primera evaluación con promedios de 0.48 y 0.50 mm respectivamente. En la segunda evaluación, el diámetro del tallo de las plantas del tratamiento P+N+V25% fue significativamente (P= 0.06521) mayor con un promedio de 0.50 mm. Al final del experimento el diámetro del tallo de las plantas de los tratamientos P+N+V10% y P+N+V15% fue significativamente (P= 0.09524) mayor con valores de 0.56 y 0.51 mm respectivamente (Figura 1B). Con lo que respecta al número de hojas, en la primera evaluación los tratamientos P+N, P+N+T y P+N+C fueron mayores (P= 0.0605) obteniendo ocho hojas promedio, en la segunda evaluación el tratamiento P+N+V10% obtuvo el mayor (P= 0.0001) número de hojas (12) y en la tercera evaluación todas las plantas tratadas con V. sphaerocephala presentaron mayor (P= 0.0009) número de hojas promedio (10) respecto a las plantas de los demás tratamientos (Figura 1C). El número de flores fue mayor (P= 0.0517) en el tratamiento P+N con seis flores por planta en promedio en la primera evaluación. En la segunda evaluación el mayor número de flores se observó en el tratamiento P+N+V10% (P= 0.0001) obteniendo un promedio de nueve flores. En la tercera evaluación la mayor cantidad de flores se registró en los tratamientos P, P+N y P+N+C, debido a que todas las plantas tratadas con V. sphaerocephala ya se encontraban en etapa de fructificación (Figura 1D). El índice de clorofila registrado en la primera evaluación fue similar en todos los tratamientos (P= 0.0565). En la segunda evaluación los tratamientos P+N+T, P+N+C, P+N+V15% y P+N+V25% presentaron un índice de clorofila mayor al resto de los tratamientos. En la tercera evaluación hubo un decremento significativo en todos los tratamientos debido a la carga floral y fructífera en las plantas (Figura 1E).

Figura 1 Efecto de los extractos de V. sphaerocephala sobre el desarrollo de plantas de C. sativus durante la etapa vegetativa (E1), floración (E2) y maduración (E3). A) Altura de planta; B) Diámetro del tallo; C) Número de hojas; D) Número de flores; E) Índice de clorofila; F) Longitud de raíz y G) Peso seco de raíz. Las medias con letras diferentes representan diferencia estadísticamente significativa según la prueba de Tukey (P≤ 0.05). P (sin nematodos), P+N (con nematodos), P+N+T (nematodos + Trichoderma), P+N+C (nematos + carbofuran), P+N+V 10, 15 y 25% (nematodos + extractos de Verbesina en diferentes concentraciones). 

La longitud de raíces en todos los tratamientos de V. sphaerocephala fueron significativos (P= 0.0968) con un promedio de 25 cm (Figura 1F). El peso seco de raíz fue significativamente (P= 0.0650) mayor para el tratamiento P+N+V10% con un promedio de 1.7 g (Figura 1G).

El efecto de los extractos de V. sphaerocephala sobre la afectación de M. incognita en plantas de C. sativus, 50 días después del trasplante, presentaron un índice de agallamiento menor (P=0.05124) respecto al tratamiento P+N. Las raíces de los tratamientos P+N+V10% y P+N+T presentaron el menor índice de agallamiento (14.3%); seguidas de los tratamientos con extractos al 15%, Carbofuran y extractos al 25%. Se observó que las plantas con el tratamiento V. sphaerocephala al 10% (P+N+V10%) no se encontraron agallas ni masas de huevos, observando que dichos extractos disminuyeron la reproducción de las hembras y eclosión de los huevos (Figura 2A). El número de huevos en 10 g de raíz se observaron diferencias significativas (P= 0.0001) en el tratamiento P+N, los valores más bajos se encontraron en los tratamientos P+N+V10%, P+N+V15% y Trichoderma, los cuales provocaron una reducción en un 20, 23.6 y 24.8%, en el número de huevos en comparación al tratamiento control (Figura 2B).

Figura 2 Efecto de los extractos de V. sphaerocephala sobre la afectación causada por M. incognita en plantas de C. sativus. A. Índice de agallamiento. B. Huevos en 10 g de raíz. C. Larvas en 100 g de suelo. Las medias con letras diferentes representan diferencia estadísticamente significativa según la prueba de Tukey (P≤ 0.05). P (sin nematodos), P+N (con nematodos), P+N+T (nematodos + Trichoderma), P+N+C (nematodos + carbofuran), P+N+V al 10, 15 y 25% (nematodos + extractos de Verbesina en diferentes concentraciones). 

Respecto al número de larvas en el sustrato, los tratamientos con aplicación de carbofuran y con extractos de V. sphaerocephala al 15% presentaron el menor número 100 y 200 larvas respectivamente. La densidad de población de larvas en estos tratamientos fue significativamente menor a las densidades de población de larvas presentada en el tratamiento control. Por el contrario, en el tratamiento con aplicación de Trichoderma se registró el mayor número de larvas (380 larvas) por 100 g de sustrato. Los extractos de V. sphaerocephala no impidieron por completo el desarrollo de las larvas; probablemente porque estos productos solo paralizan los nematodos sin provocarles la muerte (Figura 2C).

Estudios han indicado la presencia de compuestos terpenoide, flavonoide y ácidos aromáticos libres (^{Bohlmann et al., 1980}) en especies como V. virgata (^{Martínez et al., 1983}), V. sordescens (^{Bohlmann et al., 1982}), V. glabrata y V. luetzelgurgii (^{Bohlmann et al., 1980}). En esta investigación se presenta el primer estudió fitoquímico de V. sphaerocephala (Cuadro 1) donde fue evidente la presencia de fenoles (ácidos fenólicos y/o polifenoles principalmente) que funcionan como antioxidantes y pueden tener propiedades preventivas de algunas enfermedades e implicados como reguladores en procesos defensivos en las plantas e incluso con efectos alelopáticos (^{Willians et al., 2004}); también fue clara la presencia de alcaloides cuyas propiedades han sido documentadas como sustancias protectoras de las plantas contra el ataque de bacterias, virus, hongos y herbívoros (^{Bruneton, 2001}). Con base a estos resultados, se pretende investigar en un futuro las actividades antioxidantes e inhibitoria de radicales, así como el tipo de alcaloides que contiene V. sphaerocephala para determinar su modo de acción.

Durante las evaluaciones a lo largo del experimento, los extractos de V. sphaerocephala al 10 y 25% en todas las variables demostraron que estimulan el desarrollo de la planta aun en condiciones de maceta y con la presencia de M. incognita tal como lo mencionan ^{Mora et al. (2013}), donde hacen referencia que varias especies de Verbesina tienen compuestos orgánicos activos como reguladores de crecimiento.

De acuerdo con los resultados obtenidos en cada una de las variables de crecimiento de pepino en maceta, los extractos de Verbesina al 10% fueron eficientes para altura de planta, número de hojas, flores, índice de clorofila y peso seco en raíz, como señala ^{Oka (2012}) en una investigación hecha con extractos acuosos de V. encelioides donde evaluó la actividad nematicida de M. javanica y el efecto en el crecimiento de Inula viscosa, la cual coincide con estos resultados donde Verbesina es eficaz como bioestimulante, ya que actuó sobre la fisiología de las plantas de pepino de diferentes formas y no se vio afectado el vigor y rendimiento del cultivo ante la infestación por M. incognita. Lo que respecta a la afectación de M. incognita sobre las plantas de pepino indicaron que Trichoderma mejoró la resistencia de las raíces a los síntomas de agallamiento. Es posible que al ser considerado como inoculante que promueve el crecimiento y brinda beneficios y protección a las plantas haya estimulado el desarrollo a las raíces lo que ayuda a disminuir la afectación por nematodos (^{Hernández-Melchor et al., 2019}). ^{Baños et al. (2010}) recomienda el uso de Trichoderma spp. en el manejo de Meloidogyne spp. en hortalizas, ya que afirman ser un biorregulador efectivo contra nematodos de este género por medio de sus toxinas e hifas. Por otro lado, la aplicación de Trichoderma no mostró actividad nematicida, ya que se encontró mayor número de nematodos en el suelo. Es posible que al estimular el desarrollo de las raíces haya permitido que mayor número de hembras establecieran su sitio de alimentación, con la consiguiente mayor tasa de multiplicación. Hay que destacar, que el cultivo de pepino es susceptible al ataque del nematodo M. incognita como lo manifiesta ^{Julca et al. (2001}).

Resultados similares fueron reportados por ^{Oka (2012}), utilizando V. encelioides, quien evaluó extractos acuosos de hojas para combatir el nematodo M. javanica. ^{Vázquez-Sánchez et al. (2018}) determinó la efectividad de extractos acuosos de hojas de V. sphaerocephala contra Naccobus inmovilizando al nematodo, los cuales bloquearon la alimentación y capacidad para invadir las raíces de la planta huésped. Extractos de ajo (Allium satium), cempasúchil (Tagetes erecta), papayo (Carica papaya) y barrenillo (Cynodon dactylon) también han sido utilizados para determinar los efectos nematicidas sobre Meloidogyne spp. en frijol (Phaseolus vulgaris) (^{Parada y Guzmán, 1997}). La aplicación de aceites esenciales de Tagetes zypaquirensis también ha sido útil para el manejo del nematodo Meloidogyne spp. como lo da a conocer ^{Álvarez et al. (2015}) y lo recomienda ^{Eloh et al. (2019}) en una evaluación hecha con la selección de 10 plantas cultivadas en África occidental para combatir M. incognita.

En esta investigación se determinó que el uso de extractos acuosos de V. sphaerocephala al 10 y 15% puede tener un potencial biológico para minimizar la afectación de las raíces causada por M. incognita. Por lo cual, es necesario realizar estudios más rigurosos para determinar el efecto de los extractos sobre la tasa de multiplicación de M. incognita.