Los metabolitos secundarios, como los alcaloides, flavonoides, terpenos y fenoles son moléculas que las plantas sintetizan como mecanismos de defensa contra el ataque de patógenos (^{Scott et al., 2008}). Otras moléculas, como el quitosano, se pueden utilizar para obtener la producción de metabolitos secundarios en las plantas (^{López-Moya et al. 2019}). Los metabolitos secundarios que producen las plantas se pueden utilizar como bioplaguicidas (^{Báez-Valdez et al., 2010}) y, por tanto, constituyen alternativas ecológicas para remplazar el control químico de patógenos como Fusarium, un hongo que ataca el sistema vascular de las plantas, que causa enfermedades en varias especies vegetales y frutícolas (^{Dweba et al., 2017}; ^{McGovern, 2015}) y considerables pérdidas económicas. El control biológico de Fusarium se puede llevar a cabo utilizando compuestos naturales sintetizados por algunas especies vegetales del género Piper (Scott et al., 2008), ya que se ha reportado que los aceites esenciales y los extractos tienen efectos fungicidas en F. solani f. sp. piperis y F. oxysporum f. sp. vanillae (^{da Luz et al., 2017}; ^{Suprapta y Ohsawa, 2007}). La actividad fungicida de Piper se atribuye a los genes de resistencia como los que desarrollan algunas variedades de pimienta negra (P. nigrum) que producen metabolitos secundarios cuando son atacados por F. solani f. sp. piperis (da Luz et al., 2017). De igual manera, se han reportado por lo menos tres taxones americanos de Piper que son resistentes a Fusarium: la baja mortalidad de P. divaricatum expuesta a Fusarium fue atribuida a la producción de metabolitos secundarios, sobre todo fenoles (^{Erisléia-Meireles et al., 2016}); las semillas y plántulas de P. aduncum están protegidas por aceites esenciales (^{Potzernheim et al., 2012}); y P. tuberculatum expresa resistencia genética cuando son tratados con F. solani f. sp. piperis, que incluye algunos de los mismos genes relacionados con la resistencia sistémica adquirida (RSA) en P. nigrum (^{Nascimento et al., 2009}).

La RSA es un mecanismo de defensa generalizado contra una amplia variedad de patógenos que generan las diferentes proteínas que regulan las interacciones en la interfaz de las membranas celulares (^{Ádám et al., 2018}). Por ejemplo, el reconocimiento de la quitina fúngica desencadena una cascada de señales químicas y activan los genes de respuesta que sintetizan las proteínas, como la fenilalanina amonio liasa (PAL), responsable de la producción de flavonoides y fenoles mediante una ruta biosintética que incluye la fitohormona ácido salicílico como una molécula señal (^{López-Moya et al., 2019}). El ácido salicílico y el quitosano se utilizan juntos para inducir la resistencia de la planta a los patógenos. Ambos ofrecen una alternativa al uso de fungicidas porque modulan la RSA y estimulan la producción de fenoles, terpenos y flavonoides en respuesta a la infección causada por hongos como Fusarium (^{Golkar et al., 2019}). Por tanto, los objetivos del presente estudio fueron evaluar la producción de metabolitos secundarios de extractos de plantas de P. auritum tratadas con quitosano y determinar su actividad fungicida in vitro contra F. oxysporum f. sp. vanillae.

Se seleccionó una población silvestre de P. auritum en la localidad de San Andrés Tlalnelhuayocan, Veracruz, México (-96.9776678 O; 19.29358 N; 1450 msnm); las muestras se recolectaron en un bosque nuboso con suelo tipo andosol y clima templado húmedo. La población incluyó 72 plantas maduras con estructuras reproductivas, que se distribuyeron en 6 parcelas con 4 individuos en cada una. Se trataron tres parcelas con quitosano comercial (marca VEPINSA, Sinaloa, México) [de bajo peso molecular (de 22,000 a 33,000 g mol^-1), 27% de quitosano en el producto, 80% de desacetilación, 10% de humedad, 1.8% de ceniza, viscosidad (10g L^-1, 25 °C) 30 a 200 cps] disuelto a una concentración de 1 mg mL^-1 y pH 5.5 (Tratamiento A). Las otras tres parcelas fueron el control, tratado con una solución de Tween 80 al 0.01% (v/v) con pH 5.5 (Tratamiento B). Los tratamientos se aplicaron cada semana por un mes, siguiendo la metodología de ^{Benhamou y Thériault (1992}). Después de los tratamientos, se recolectaron 3 kg de P. auritum fresca (hojas, inflorescencias y tallos) y se secaron en estufa a 45 ± 5 °C antes de la maceración, separando las muestras tratadas y el control a una distancia de 1.5 m en el secador.

La extracción fitoquímica se llevó a cabo con un Soxhlet, utilizando 10 g de material vegetal mezclado con etanol y concentrado en un evaporador rotativo (250 rpm a 45 °C) (^{Carmona-Hernández et al., 2014}). Los alcaloides totales se midieron por espectrofotometría con 544 nm de absorbancia utilizando el método verde de bromocresol, y los resultados se expresaron en µg de equivalente de piperina (EP) por mg de extracto (^{Tiwari et al., 2017}). Para los flavonoides totales, se utilizó el método de reducción de aluminio con 420 nm de absorbancia y los resultados se expresaron como µg de equivalente de quercetina (EQ) por 10 mg de extracto (^{Blainski et al., 2013}). Para el total de fenoles, se utilizó el reactivo Folin-Ciocalteu con 760 nm de absorbancia expresada como µg de equivalente de ácido tánico (EAT) por 10 mg de extracto (Blainski et al., 2013). Los terpenos totales se obtuvieron siguiendo la metodología de ^{Ghorai et al. (2012}) y los resultados se expresaron como mg de equivalente de mentol (EM) por 100 mg de extracto. La respuesta de la fitohormona ácido salicílico se midió utilizando la metodología de ^{Rahman et al. (2016}): se agregaron 1000 µL de extracto etanólico (1 mg mL^-1) a 50 µL de ClFe₃ y 950 µL de agua bidestilada, y la absorbancia se midió a 540 nm. Los resultados se expresaron como µg de equivalente de ácido salicílico (EAS) por mg de extracto. Se realizaron cinco réplicas de cada análisis.

La actividad inhibitoria in vitro de extractos de P. auritum se probó utilizando cultivos fúngicos de F. oxysporum f. sp. vanillae en placas Petri (de 90 mm diámetro) con tres réplicas y cinco concentraciones de extractos (0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0 mg mL^-1) y un control (EtOH), añadidos al papa dextrosa (PDA). Las pruebas se realizaron colocando 5 mm de micelio en el centro de las placas Petri. El crecimiento del diámetro se midió cinco días después de la incubación a 27 °C (^{Rongai et al., 2015}). El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente fórmula: % inhibición de crecimiento = ((crecimiento del control - crecimiento del tratamiento) / crecimiento del control) *100.

Para el análisis de varianza (ANEVA) se utilizó el programa STATISTICA 10 con las pruebas post hoc de Tukey. La concentración efectiva media (EC₅₀) se estimó con un modelo probit y el programa Biostat 6.0 (^{Amini y Sidovich, 2010}).

Hubieron diferencias significativas en la producción de metabolitos secundarios entre los extractos de plantas de P. auritum con y sin tratamiento de quitosano (Cuadro 1). Conforme a estudios anteriores en los que se utilizaron otras especies vegetales, las concentraciones de flavonoides, terpenos y fenoles fueron significativamente más altas (P<0.05) en los extractos de plantas tratadas con quitosano. Por ejemplo, la aplicación de quitosano (200 mg) a Hypericum perforatum indujo la producción de flavonoides (^{Brasili et al., 2014}), la producción de terpeno aumentó con la adición de quitosano (1 g) en Mentha piperita (^{Chang et al., 1998}) y las concentraciones de fenol fueron más altas con el tratamiento de quitosano (200, 500 y 1000 ppm) en extractos de Origanum vulgare spp. hirtum (^{Yin et al., 2012}). Al igual que en el estudio de ^{López-Moya et al. (2019}), el tratamiento de quitosano aumentó la producción de ácido salicílico en las plantas, que puede desencadenar la producción de fenilalanina amonio liasa (PAL), exacerbando la producción de flavonoides, terpenos y fenoles, lo cual pudo haber contribuido a la RSA (^{Wiesel et al., 2014}). A diferencia del efecto positivo en los flavonoides, terpenos y fenoles, el tratamiento con quitosano disminuyó significativamente (P<0.05) la concentración de alcaloides. Este efecto fue reportado anteriormente en Stemona curtisii (^{Pitta-Alvarez et al., 1999}) a concentraciones de quitosano de más de 0.1 mg mL^-1, en menos de 4 semanas.

La concentración efectiva media (EC₅₀) de extractos de P. auritum contra F. oxysporum f. sp. vanillae fue significativamente menor con el tratamiento de quitosano (EC₅₀ = 1.473 mg mL^-1; error estándar = 0.288) que la del control (EC₅₀ = 5.123 mg mL^-1; error estándar = 0.646) (P<0.001). La curva de inhibición muestra que la concentración más alta de extracto etanólico de P. auritum (4 mg/mL) inhibió el 100% del crecimiento de Fusarium con el tratamiento de quitosano comparado con el 41% sin quitosano (Figura 1). La actividad fungicida de P. auritum contra F. oxysporum y otros hongos fitopatogénicos fue anteriormente reportada por ^{Pineda et al. (2012}). La actividad podría ser atribuida a las altas concentraciones de fenoles, flavonoides y terpenos. Se sabe que las especies americanas de Piper poseen genes de resistencia asociadas con la producción de fenilpropanoides (^{Erisléia-Meireles et al., 2016}; ^{Nascimento et al., 2009}; ^{Potzernheim et al., 2012}). Los resultados que aquí se describen muestran que el quitosano tiene un efecto desencadenante en la producción de fenoles, flavonoides, terpenos y ácido salicílico en los extractos de P. auritum, pero tiene también un efecto antagonista en la producción de alcaloides. La actividad fungicida de los extractos etanólicos de P. auritum contra F. oxysporum f. sp. vanillae mejoró notablemente con la adición de quitosano.

Figura 1 Extractos etanólicos de la actividad fungicida de Piper auritum contra F. oxysporum f. sp. vanillae previamente tratada con quitosano (media y erros estándar).