MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo de suelo y tejido vegetal enfermo. Durante 2016 y 2017 se realizaron muestreos en los municipios de Copándaro, Morelia, Queréndaro, Tarímbaro, Vista Hermosa y Yurécuaro, Michoacán; y La Barca, Jalisco (Figura 1). Las muestras se obtuvieron de secciones de raíz, corona y tallo (10 a 20 cm de longitud) y de suelo en una parcela con antecedentes de cultivos previos de solanáceas y cucurbitáceas (Figura 2). En estos municipios, el cultivo de chile se realiza cada año, con excepción de Queréndaro donde se efectúan rotaciones de cultivos con gramíneas y otros cultivos por 3 a 5 años, y Morelia, donde se cultiva calabacita tipo zuchinni (C. pepo) principalmente. Las parcelas muestreadas presentaron suelos francos a franco-arenosos en Queréndaro, franco-arcillo-arenosos en Copándaro, Morelia y Tarímbaro y franco-arcillosos en Yurécuaro y La Barca. En las parcelas el riego fue por goteo. El tipo de chile que principalmente se cultiva en las regiones muestreadas es chile poblano y en menor proporción se cultivan los chiles tipo pasilla, serrano, jalapeño y güero. Los sitios muestreados en el área del municipio de Morelia presentaron cultivos de calabaza zucchini; mientras que en el municipio de Tarímbaro se muestreó un cultivo de jitomate (S. lycopersicum), el resto fueron cultivos de chile tipo serrano.

Figura 1 Sitios de colecta de solanáceas y cucurbitáceas con síntomas de marchitez.  

Detección preliminar de Phytophthora mediante inmuno-tiras. Las muestras de tejido vegetal enfermo se sometieron a una prueba serológica para la detección rápida de Phytophthora, incluyendo P. capsici, mediante el empleo de inmuno-tiras (InmunoStrip, Agdia^®). De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se tomaron aproximadamente 25 g de tejido radicular necrótico y se colocó en solución salina, se aplicó una fricción ligera y se insertó la inmuno-tira. Las muestras positivas se procesaron para aislar el patógeno. En una parcela de Queréndaro en la que se obtuvo un resultado negativo se procedió a realizar el aislamiento y se detectó a Fusarium solani (^{Reyes-Tena et al., 2019c}).

Figura 2 Cultivos de solanáceas y cucurbitáceas con síntomas de marchitez: a) calabacita tipo zuchinni en Morelia; b) chile serrano en Tarímbaro; c) chile pasilla en Queréndaro y d) chile poblano en Copándaro, Michoacán; e) chile pobla no en La Barca, Jalisco; y f) chile poblano en Yurécuaro, Michoacán.  

Aislamiento de Phytophthora a partir de suelo. Las muestras de suelo se obtuvieron de la rizósfera de C. annuum con síntomas de marchitez, cultivadas en una parcela localizada en el municipio de Copándaro. Cada muestra consistió en 100 - 150 g de suelo tomado de 10 - 15 cm de profundidad; las muestras se colocaron en una hielera para su traslado al laboratorio. Para el aislamiento de Phytophthora se realizó un bioensayo empleando hojas de Rhododendron como tejido trampa. El bioensayo consistió en colocar 10 g de suelo y 20 mL de agua destilada estéril en cajas Petri de 16 cm de diámetro. Las hojas de Rhododendron se lavaron con agua y jabón, se enjuagaron con agua destilada estéril y se colocaron con el pecíolo sumergido en la suspensión de suelo para facilitar la invasión del patógeno (^{Erwin y Ribeiro, 1996}). Las cajas se sellaron con parafina plástica Parafilm^® y se colocaron a 24 °C durante 36-48 h o hasta la presencia de necrosis en el pecíolo. Posteriormente, el pecíolo se transfirió a medio NARPH con natamicina (0.02 g L^-1), ampicilina (0.27 g L^-1), rifampicina (0.01 g L^-1), pentacloronitrobenceno (0.10 g L^-1) e himexazol (0.075 g L^-1) y se almacenó a 24 °C (^{Soto-Plancarte et al., 2017}).

Aislamiento de Phytophthora a partir de tejido vegetal. Para favorecer el aislamiento de Phytophthora, se cortaron trozos de raíz y tallo en la zona de crecimiento activo del patógeno, es decir, trozos con la interfase entre necrosis y tejido sano. Los trozos de tejido se desinfestaron en una solución de cloro comercial 10% v/v (0.6% ingrediente activo de hipoclorito de sodio). Posteriormente, se enjuagaron en agua destilada estéril y se colocaron en papel secante estéril de acuerdo al procedimiento descrito por ^{Soto-Plancarte et al. (2017}). Los trozos de tejido se sembraron en medio NARPH. Después de 48 a 72 h se observó el crecimiento de micelio.

Los aislados obtenidos se transfirieron a medio agar-agua para su purificación mediante la técnica de punta de hifa, y posteriormente al medio agar-harina de maíz. Para determinar si los aislados presentaban bacterias contaminantes se colocó un disco de agar con micelio por 24 h a 24 °C en un tubo de ensaye con medio Luria Bertani estéril, si no se observó turbidez, el aislado se consideró libre de bacterias. En caso de observarse contaminación por bacterias, el cultivo se transfirió a medio agar-papa-dextrosa con ácido tartárico a 0.14% (^{Soto-Plancarte et al., 2017}). Posteriormente, se transfirieron discos de medio con micelio de 5-7 días de edad para su conservación en agua destilada estéril dentro de micro-tubos a 15 °C. Los aislados se depositaron en la colección de oomycetes (Colección Patología Vegetal) del Laboratorio de Patología Vegetal, Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.

Morfología comparativa de aislados de Phytophthora capsici . Los aislados obtenidos se crecieron en medio Agar-V8 y se almacenaron a 24 °C durante 5-7 días. Cuando el crecimiento cubrió las placas de medio de cultivo, se cortaron en trozos de aproximadamente 1x1 cm. Para inducir la formación de esporangios se adicionaron de 15 a 18 mL de agua destilada estéril, el agua se cambió cada 24 h durante tres días. A los aislados que formaron pocos esporangios, se les adicionó extracto de suelo no estéril y se dejaron a 24 °C durante 24 h (^{Almaraz-Sánchez et al., 2013}). Cuando los aislados esporularon se realizó la descripción de los caracteres asexuales. La prueba de caducidad de los esporangios se realizó de la siguiente manera. Se colocó una gota de agua en un portaobjetos y se colocó un trozo de agar con micelio sobre la gota de agua agitándolo ligeramente. Las observaciones bajo el microscopio óptico se realizaron a una ampliación de 40X para registrar la caducidad o persistencia del pedicelo en los esporangios. Se registró el tipo de esporangióforo, forma de los esporangios, longitud de la papila, longitud del pedicelo y presencia o ausencia de clamidosporas. Por otro lado, todos los aislados se sometieron a una prueba de crecimiento a 35 °C en medio Agar-V8 durante 48 h.

Para determinar el tipo de compatibilidad sexual, los aislados se cruzaron con dos aislados de tipo de compatibilidad conocido (A1 y A2) en medio agar-V8. Los cultivos se observaron 5-10 días después de la inoculación para detectar la formación de oosporas. Se registró el tipo de oospora y el tipo de anteridio. Los resultados se compararon con la clave lúcida descrita por ^{Abad et al. (2019}) para Phytophthora del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de América (USDA), la cual se encuentra disponible en http://idtools.org/id/phytophthora/index.php.

Prueba de Patogenicidad. La patogenicidad de siete aislados (CPV259, CPV260, CPV267, CPV271, CPV272, CPV277 y CPV279) se determinó en un estudio previo (^{Reyes-Tena et al., 2019a}). En el presente estudio se seleccionó adicionalmente un grupo de siete aislados para realizar pruebas de patogenicidad, estos fueron CPV282, CPV290, CPV291, CPV293, CPV296, CPV297 y CPV301. Estos 14 aislados correspondieron a diferentes hospedantes, municipios tanto de Michoacán como de Jalisco y los dos tipos de compatibilidad. Para la producción de inóculo y desarrollo de plántulas de chile se siguió el protocolo descrito por Reyes-Tena et al., (2019a). La siembra y producción de plántulas de la variedad susceptible California Wonder se realizó en bandejas de seis celdas de 100 cm³ con Mezcla 3 (Sunshine®) como sustrato. Después de 56 días de la siembra las plantas se inocularon con el patógeno. Se inocularon seis plantas por aislado, con 1 mL de una suspensión de 1 x 10^-4 zoosporas en la base del tallo de cada planta, utilizando una jeringa dosificadora de 50 mL (Ape ®). Las plantas se mantuvieron saturadas con agua por 24 h para favorecer la infección. Se registró la aparición de síntomas y se reaisló al patógeno en medio selectivo NARPH.

RESULTADOS

En total se obtuvieron 41 aislados de Phytophthora spp. de cultivos de cucurbitáceas y solanáceas que presentaron un rango de incidencia de la enfermedad marchitez de 20-80% (Cuadro 1). El 76% de los aislados fueron recuperados de muestras provenientes de los municipios de Copándaro, Morelia, Queréndaro y Yurécuaro, Michoacán

En el Cuadro 2 se presenta la descripción de los diferentes caracteres sexuales y asexuales observados. Los aislados mostraron esporangios dispuestos en esporangióforos simples simpódicos. Cuarenta aislados presentaron esporangios caducos, papilados y con pedicelo largo, solo el aislado CPV-269 mostró esporangios semipapilados con pedicelo mediano. Con respecto a la forma de los esporangios, 10 aislados mostraron formas irregulares o distorsionadas (Figura 3c). En general, predominaron las formas elipsoide, ovoide y globosa. La presencia de clamidosporas globosas y terminales (Figura 3e) se detectó en el aislado CPV-279. El 88% de los aislados crecieron a 35 °C, excepto los aislados CPV-280, CPV-285, CPV-294, CPV-295 y CPV-296. Todos los aislados presentaron oosporas pleróticas con anteridio anfígino (Figura 3d). Cuarenta aislados fueron heterotálicos y un aislado fue homotálico. En el tipo de compatibilidad, 21 aislados fueron tipo A1 y 19 fueron tipo A2. Ambos se recuperaron en parcelas de cultivos de chile en los municipios de Copándaro, Queréndaro, Tarímbaro y Yurécuaro, Michoacán y en La Barca, Jalisco. Una proporción de tipos de compatibilidad sexual cercana a 1:1 se encontró en los municipios de Copándaro, La Barca, Tarímbaro y Yurécuaro. En Morelia se obtuvieron aislados del tipo A2.

Con lo que respecta a la prueba de patogenicidad, se observaron síntomas de marchitez a partir del tercer día en la variedad California Wonder con los siete aislados inoculados, y en todos los casos se reaisló a P. capsici, comprobando la patogenicidad de los aislados.

Figura 3 Estructuras sexuales y asexuales de Phytophthora capsici: a) esporangióforo simple simpódico, b) esporangios elipsoides papilados, c) esporangio con formas irregulares, d) oosporas pleróticas con anteridio anfígino, e) clami dosporas globosas, terminales, y f) esporangio caduco. 

DISCUSIÓN

Se identificó a P. capsici como agente causal en un total de 14 aislados (siete corresponden a una prueba de patogenicidad de un estudio previo, ^{Reyes-Tena et al., 2019a}) y 27 asociados a la enfermedad marchitez, en cultivos de cucurbitáceas y solanáceas en los municipios muestreados de Jalisco y Michoacán. La identificación morfológica, coincidió con la identificación molecular que se realizó en una muestra de aislados (^{Reyes-Tena et al., 2019a}; ^{Reyes-Tena et al., 2019b}). Los aislados de este patógeno presentan los dos tipos de compatibilidad sexual (A1 y A2) en una proporción cercana a 1:1, en cuatro municipios, Copándaro, La Barca, Tarímbaro y Yurécuaro. Lo que sugiere que podría estar ocurriendo reproducción sexual (^{Castro-Rocha et al., 2016}). Un resultado similar en la proporción de ambos tipos de compatibilidad se reportó en poblaciones de P. capsici recuperadas en cultivos provenientes de Aguascalientes, Chihuahua, Ciudad de México, Estado de México, Guanajuato, Michoacán, Querétaro y Zacatecas (Castro-Rocha et al., 2016; ^{Fernández-Pavía et al., 2007}; ^{Pérez-Moreno et al., 2003}; ^{Silva-Rojas et al., 2009}). La proporción de compatibilidad sexual cercana a 1:1 también se encontró en poblaciones de China, Estados Unidos de América y Sudáfrica (^{Bi et al., 2014}; ^{Fernández-Pavía et al., 2004}; ^{Gevens et al., 2007}; ^{Meitz et al., 2010}; ^{Yin et al., 2012}). La presencia de un solo tipo de compatibilidad (A2) en Morelia es comparable con lo reportado por Pérez-Moreno et al. (2003) con aislados obtenidos en Salvatierra, Guanajuato donde se encontró solo A2; y con estudios en poblaciones de Argentina, España y Perú, donde se detectaron poblaciones clonales (^{Gobena et al., 2012}; ^{Hurtado-Gonzáles et al., 2008}; ^{Silvar et al., 2006}). Esto podría sugerir que la presencia del patógeno es reciente y no se han introducido aislados de ambos tipos de compatibilidad. El 88% de los aislados crecieron a 35 ^oC lo cual fue similar a lo observado por ^{Pons-Hernández et al., 2020}, quienes reportan un 96% para aislados de Guanajuato.

La ocurrencia de reproducción sexual en poblaciones de P. capsici en cultivos de cucurbitáceas y solanáceas en Jalisco y Michoacán, podría favorecer la supervivencia y el surgimiento de mayor variabilidad genética dentro de las poblaciones de este patógeno en esta región del país, lo que podría dificultar los programas de manejo (^{Babadoost y Pavon, 2013}; ^{Lamour y Hausbeck, 2000}). Existe el antecedente de una elevada diversidad genética en poblaciones del centro de México (^{Castro-Rocha et al., 2016}); sin embargo, es necesario considerar factores genéticos adicionales que pudieran ocasionar variabilidad porque el elevado polimorfismo que presenta P. capsici podría estar mediado por otros procesos causantes de variabilidad como: mutaciones, recombinación genética, procesos epigenéticos y transferencia horizontal de genes y cromosomas (^{Raffaele y Kamoun, 2012}). Otro factor desfavorable en el manejo de la marchitez, es la práctica de rotación de cultivos susceptibles como C. pepo y S. lycopersicum. Es preferible que la rotación de cultivos se lleve a cabo en periodos de 3 a 5 años con hospedantes no susceptibles, con el propósito de reducir los niveles de inóculo del patógeno (^{Barchenger et al., 2018}).

La forma de los esporangios registrada en el presente estudio coincide con la descripción para P. capsici, la cual puede presentar formas variadas desde ovoides, ovo-ovoides, sub-globosos, globosos, elipsoides, fusiformes, piriformes y con formas irregulares y la frecuente presencia de esporangios bipapilados (^{Li et al., 2007}; ^{Soto-Plancarte et al., 2017}). Los aislados provenientes de C. pepo mostraron esporangios con formas irregulares o distorsionadas; reflejo de la plasticidad fenotípica de esta especie (^{Iribarren et al., 2015}). Por otro lado, el aislado CPV-269 presentó esporangios semipapilados con pedicelo mediano, esta característica es típica de P. capsici con pedicelos cortos, medianos y largos (^{Granke et al., 2011}; ^{Martin et al., 2012}). Esporangios semipapilados han sido reportados previamente en aislados de P. capsici (^{French-Monar et al., 2006}). En este estudio, el aislado CPV-279 obtenido de C. annuum presentó clamidosporas apicales globosas, este aislado previamente fue identificado a nivel molecular como P. capsici mediante la secuenciación de los genes de la citocromo oxidasa 1 y 2 (^{Reyes-Tena et al., 2019a}). La presencia de clamidosporas es una característica poco común en P. capsici y no está considerada en la descripción de la clave lúcida para esta especie (^{Aragaki y Uchida, 2001}; ^{Bowers et al., 2007}; ^{Donahoo y Lamour, 2008}; Martin et al., 2012). Sin embargo, existen varios reportes de P. capsici en EE. UU. y Malasia que forman estas estructuras (^{Farhana et al., 2013}; Granke et al., 2011; ^{Islam et al., 2004}). Por este motivo, la alta variabilidad fenotípica que presenta este patógeno podría correlacionarse con el lugar y el hospedante de donde fueron obtenidos, sin embargo, se necesitan estudios para confirmarlo.

CONCLUSIONES

Los resultados proveen información acerca de la presencia y distribución de P. capsici en zonas de producción de solanáceas (35 aislados) y cucurbitáceas (seis aislados) en municipios de Michoacán y Jalisco. Se aislaron 33 aislamientos del cultivo de C. annum, seis de C. pepo y dos de S. lycopersicum. Debido a que no existen estudios previos en estas zonas de producción, la información de este trabajo es útil para que los productores adopten medidas de prevención y apliquen productos específicos contra este patógeno.