MATERIALES Y MÉTODOS

Germoplasma de maíz nativo. Se evaluaron 55 poblaciones de maíz nativo que previamente ^{Briones-Reyes et al. (2015}) colectaron y caracterizaron, provenientes de 19 localidades ubicadas entre los 1498 y 2520 msnm, de cinco estados: 13 de la región de Montaña de Guerrero, 11 del Sureste del Estado de México, 13 de la Mixteca Alta de Oaxaca, seis de Puebla y 12 de Tlaxcala (Cuadro 1). Las colectas de maíz se mantuvieron en cuarto frío a -4 °C desde la colecta hasta el momento de su uso.

Fuente de inóculo e inoculación de semillas. La fuente de inóculo fueron teliosporas colectadas en 2014 en un lote de maíz (híbrido Cardenal, Asgrow^®) en el municipio de Tenango del Valle, Méx. Las teliosporas se retiraron de los soros, se pasaron por un tamiz de 117 micras (Mont Inox^®), se almacenaron en envases de plástico con sobres conteniendo CaCl₂ (J. T. Baker y Macron Fine Chemicals^® 94%), y se conservaron a 20 ± 2 °C hasta el momento de su uso. El inóculo se caracterizó morfológicamente utilizando la metodología de ^{Vánky (2012}) y molecularmente tomando como base la metodología propuesta por ^{Márquez-Licona et al. (2018}). La caracterización morfológica del inóculo se realizó observando laminillas con teliosporas del patógeno. Para esto, se midieron y caracterizaron 100 teliosporas al microscopio compuesto a 100 X (CX31RBSFA, Olympus^®). La caracterización molecular se realizó a partir de cultivos monobasidiales, amplificando la región ITS (Internal Transcribed Spacer) y parte de la región LSU rDNA (Large Subunit Ribosomal DNA) usando los iniciadores ITS1F/NL4 (^{Gardes y Bruns 1993}; ^{O’Donnell et al., 1998}).

La extracción total de ADN de los cultivos monobasidiales, se realizó con el kit comercial Ultra Clean^® Microbial DNA Isolation Kit (MoBio Laborarories Inc). La integridad del ADN se verificó en gel de agarosa al 1% y la cantidad de ADN se determinó por espectrofotometría a 260 nm de absorbancia (Nanodrop^® ND-1 V 3.2.1). Para la amplificación se usó una mezcla de 25 μL, buffer My Taq 1X, 10 pm de cada iniciador, 1U MyTaq™ DNA Polymerase (Bioline Germany) y 100 ng de ADN. La amplificación se realizó en un termociclador Mastercicler Pro (Eppendorf^®) a una temperatura de desnaturalización inicial de 94 °C por 4 min, seguido por 35 ciclos a 94 ºC por 1 min, 55 °C 1 min y 72 ºC por 1 min, más un ciclo de 72 °C por 10 min para la extensión final. La visualización de los productos amplificados se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% a 120 volts por 30 min. Para estimar el tamaño del fragmento amplificado se utilizó el marcador molecular Pst I (Microzone^®). Una vez finalizada la electroforesis, el gel se analizó con un fotodocumentador Chemi Genius 2 Bio Imaging System (Syngene^®). Los productos de PCR se purificaron según lo descrito por ^{Kirby (1965}) y se secuenciaron en Macrogen Europe, Amsterdam, Holanda. La calidad de las secuencias se determinó mediante la observación de los electroferogramas usando el software 4peaks^® Nucleobytes (^{Griekspoor y Groothuis, 1994}), mientras que las secuencias consenso hicieron usando el software U GENE (^{Okonechnikov et al., 2012}). Las secuencias obtenidas se compararon en la base de datos GenBank del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), utilizando la herramienta Blastn (^{Altschul et al., 1990}). Las secuencias se dieron de alta en la misma base de datos.

La viabilidad se verificó previo a la inoculación de la semilla como lo describen ^{Quezada-Salinas et al. (2013}). Para la inoculación, las teliosporas se adhirieron a la semilla usando una solución acuosa de grenetina al 10% a 20 °C (^{Márquez-Licona et al., 2018}). Las semillas (66 por cada población, 22 por repetición) se incorporaron a la solución de grenetina por 1 min, se recuperaron en una caja de Petri y se cubrieron completamente con teliosporas (~ 40 000 teliosporas/semilla). Las semillas inoculadas se secaron por 24 h a 22 °C. Como testigos se usaron semillas de maíz del híbrido Az 41801^® inoculadas y sin inocular.

Evaluación de la respuesta de maíz nativo. La respuesta de las poblaciones de maíz nativo a la infección por S. reilianum f. sp. zeae se evaluó sembrándolas en un lote en el Ejido Cinta Larga, Mixquiahuala, Hgo. (20° 11’ 24.6” N 99° 14’ 35.2” W; 2030 msnm; clima templado semiseco, en los ciclos primavera-verano de 2015 y 2016, bajo la misma aleatorización. En ambas evaluaciones, las poblaciones de maíz nativo evaluadas, el terreno usado en la evaluación, la fuente de inóculo y el porcentaje de germinación de las teliosporas se mantuvieron estables. La semilla inoculada de cada población se sembró en surcos de 3 m de largo y 0.80 m entre surcos, a una profundidad de 5 cm, con separación de 13.5 cm entre semillas. La unidad experimental consistió en un surco con 22 plantas con 3 repeticiones. El diseño experimental fue un Diseño en Bloques Completos al Azar. Después de la siembra, el terreno se regó por inundación (lamina de riego 140 mm), los riegos posteriores se realizaron en las etapas V5, V7, VT, R2 y R5. La escases de humedad entre el primer y el segundo riego incrementa el porcentaje de incidencia del carbón de la espiga según lo reportado por ^{Matyac y Kommedahl (1985}). Dentro de las prácticas agrícolas de remoción del suelo posteriores a la siembra, solo se realizó un paso de cultivadora en etapa V4. El manejo de plagas insectiles y malezas se realizó de acuerdo con el paquete tecnológico regional, mediante el uso de productos químicos comercializados en la región.

La incidencia de la enfermedad en las poblaciones se registró 45 días después del inicio de la floración. Se consideró como planta enferma aquella que presentó síntomas en la espiga, en la mazorca, o ambas. La incidencia de la enfermedad se determinó como el cociente entre plantas con síntomas y el total de plantas en la unidad experimental multiplicado por 100. Considerando los valores de incidencia, las poblaciones se agruparon de acuerdo con la escala propuesta por ^{Quezada-Salinas et al. (2017}), la cual considera los siguientes rangos 0-10%=altamente resistente, 11-25%= moderadamente resistente, 26-50%= moderadamente susceptible, 51-75%= susceptible y 76-100%= altamente susceptible. Para los datos de incidencia de la enfermedad se realizó un análisis de la varianza combinado a través de los dos años incluyendo en el modelo también al factor Estado, los genotipos se anidaron dentro de Estado y la Interacción año×gen (estado). A la variable respuesta incidencia se le aplicó la transformación logaritmo base 10. Las pruebas se hicieron bajo la transformación logaritmo para conservar la validez estadística del análisis de la varianza, sin embargo, los valores de las medias se expresaron en las unidades originales. La comparación múltiple de medias para años y estados se realizó mediante el método de la Diferencia Mínima Significativa y la comparación múltiple de medias ajustadas por mínimos cuadrados (lsmeans) realizó mediante el método de la Diferencia Significativa Honesta de Tukey, en ambos casos, considerando un nivel de significancia del 5%. Los análisis estadísticos se hicieron usando del software estadístico SAS^® Systems for Windows V 9.4 (^{SAS Institute Inc., 2013}).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Fuente de inóculo e inoculación de semillas. En la caracterización morfológica del inóculo, se observaron aglomeraciones de teliosporas de 73 µm de diámetro. Las teliosporas (10-12 x 11-13.5 µm) fueron de globosas a subglobosas, principalmente de coloración café obscuro, con presencia de ornamentaciones. Las características antes descritas concuerdan con lo reportado por (^{Vánky, 2012}) para la especie Sporisorium reilianum f. sp. zeae. En la caracterización molecular del inóculo, la comparación de la secuencias obtenidas en el presente estudio (KY856895, KY856896) mediante la herramienta Blastn (^{Altschul et al., 1990}), mostró 99% de identidad con un fragmento correspondiente a la región ITS del genoma completo de S. reilianum f. sp. zeae depositado en el GenBank (NCBI) por ^{Schirawski et al. (2010}), corroborándose la identidad del patógeno inoculado. Las teliosporas empleadas como fuente de inóculo tuvieron un 48% de germinación después de 24 h, incubadas en obscuridad a 25 °C, en medio de cultivo PDA acidulado, demostrándose así la viabilidad del inóculo, superando el porcentaje de viabilidad reportado en otras investigaciones como ^{Osorio y Frederiksen (1998}), ^{Potter (1914}) y ^{Quezada-Salinas et al. (2013}). En el presente estudio, las teliosporas germinadas formaron un basidio septado de cuatro células, cada célula originó una basidiospora hialina, unicelular, subglobosa, a partir de las cuales desarrollaron numerosas esporidias que formaron colonias tipo levadura color crema (Figura 1 A-B), lo que concuerda con lo reportado por ^{Márquez-Licona et al. (2018}).

Evaluación de la respuesta de maíz nativo. En 2015, el valor promedio de temperatura de marzo a septiembre fue de 17.7 °C, con una precipitación promedio fue de 67.5 mm, y humedad relativa promedio de 72.6%. En 2016, durante el mismo período, el valor promedio de temperatura fue de 16.8 °C, precipitación promedio de 101.2 mm y humedad relativa promedio de 74.8%. En los 30 días posteriores a la siembra, donde ocurre la infección de las plántulas, la precipitación promedio fue 41 mm superior en 2016, respecto al año anterior. Después de 45 días del inicio de la floración, las plantas del testigo no inoculado permanecieron sanas, demostrándose así la ausencia de inóculo en el suelo, mientras que las plantas provenientes de semilla inoculada mostraron formación de soros llenos de teliosporas que remplazaron total o parcialmente la espiga y la mazorca de las plantas (Figura 1 C-F) como lo mencionan ^{Xu et al. (1999}), observándose una marcada reducción en la producción de polen y grano como lo describen ^{Ghareeb et al. (2011}).

Figura 1  Sporisorium reilianum f. sp. zeae. A) Teliosporas germinadas en PDA 24 h después de la siembra. B) Cultivo monobasidial en PDA 5 días después de la siembra. C) Reemplazo parcial de la inflorescencia masculina. D) Síntomas de filodia en plantas enfermas. E) Atrofia de la inflorescencia masculina. F) Remplazo total de la mazorca por soros llenos de teliosporas. 

En 2015, 37 de las 55 poblaciones de maíz nativo presentaron síntomas del carbón de la espiga en al menos una de las repeticiones y la incidencia de la enfermedad en las 55 poblaciones de maíz nativo varió entre 0 y 28.8%. De las 55 poblaciones de maíz nativo, el 72.7% presentaron incidencias entre 0 y 10%, el 21.8% incidencias entre 11 y 25% y el 5.5% de las colectas presentaron entre el 26 y el 50% de incidencia. En la misma evaluación, se encontró que el 100 y el 83.3% de las poblaciones nativas del Estado de México y Tlaxcala, fueron altamente resistentes a S. reilianum f. sp. zeae; mientras que las poblaciones 19 y 21 de Guerrero y la población 30 de Oaxaca alcanzaron incidencias superiores al 26%, clasificándose como moderadamente susceptibles. Para el ciclo 2016, solo 21 de las 55 poblaciones de maíz nativo presentaron síntomas del carbón de la espiga del maíz en al menos una de sus repeticiones y la incidencia de la enfermedad en las 55 poblaciones de maíz nativo fluctuó entre 0 y 22.2%. De las 55 poblaciones de maíz nativo, el 94.5% presentaron incidencias entre 0 y 10% y el 5.5% de las poblaciones presentaron incidencia entre 11 y 25 %. En la misma evaluación, se encontró que el 100% de las poblaciones nativas de los estados de Edo. de México, Tlaxcala y Oaxaca, fueron altamente resistentes a S. reilianum f. sp. zeae, mientras que las poblaciones 19 y 24 de Guerrero y la población 16 de Puebla alcanzaron incidencias entre el 11 y el 25%, clasificándose como moderadamente resistentes (Cuadro 2). En el segundo año de evaluación (2016), la incidencia de la enfermedad en las poblaciones fue menor respecto a la evaluación del año anterior. Lo mismo sucedió en el testigo inoculado (híbrido AZ 41801^®), en donde se observó una disminución del 28.4% en la incidencia de la enfermedad entre la primera y la segunda evaluación. Lo anterior se puede atribuir a un incremento en la humedad del suelo, esto como resultado de una mayor precipitación en el segundo año de evaluación. Estos resultados sugieren que la condición de alta humedad posterior a la siembra afectó la capacidad del hongo para infectar las raíces de las plántulas de maíz, como lo mencionan ^{Matyac y Kommedahl (1985}).

Los valores elevados en la incidencia de la enfermedad en el híbrido inoculado, respecto a la incidencia registrada en las poblaciones de maíz nativo, puede deberse a que no se han incorporado genes de resistencia a la enfermedad dentro del proceso de selección de las líneas parentales del hibrido, mientras que la diversidad genética presente en las colectas de maíz nativo es más amplia y puede expresar ciertos niveles de resistencia como lo mencionan ^{Fehr (1993}) y ^{Hallauer et al. (2010}). Por esta razón, la conservación de la diversidad genética del maíz es crucial para el mejoramiento genético a futuro, debido a que la falta de diversidad genética compromete la posibilidad de generar materiales con mejores rendimientos, la adaptación a condiciones ambientales adversas y el desarrollo de germoplasma resistente a enfermedades (^{Giordani et al., 2019}).

Respecto al análisis de la varianza combinado de la incidencia de carbón de la espiga en 55 genotipos de maíz evaluados durante dos años, se encontró que hubo diferencias altamente significativas para los efectos principales de año, estado y genotipo, pero no hubo efecto de interacción año × genotipo (Cuadro 3). Los resultados muestran que las poblaciones (genotipo), el origen y el año de evaluación influyeron en la incidencia del carbón de la espiga del maíz. Diferencias estadísticas significativas del mismo tipo fueron encontradas por ^{Briones-Reyes et al. (2015}) al evaluar la respuesta de las mismas poblaciones de maíz nativo a la pudrición de mazorca causada por Fusarium spp. bajo condiciones de infección natural. Las diferencias entre las poblaciones y el origen de estas muestran la diversidad fenotípica y genotípica presente en las variantes de maíz nativo existente en los estados de origen. Las diferencias significativas entre la incidencia de la enfermedad de un año de evaluación al siguiente, en donde la única fuente de variación fue la cantidad de humedad en el suelo, sugiere una relación inversamente proporcional entre la cantidad de humedad presente en el suelo y la incidencia de la enfermedad, lo que concuerda con lo descrito por ^{Matyac y Kommedahl (1985}).

La comparación múltiple de medias para los efectos de años y de estados, usando la prueba de la Diferencia Mínima Significativa y la transformación logaritmo de la variable respuesta incidencia de carbón de la espiga, dividió a las poblaciones en cuatro grupos definidos (Cuadro 4). El primer grupo considera las poblaciones provenientes de Tlaxcala y el Edo. de México, las cuales presentaron los menores porcentajes de incidencia de la enfermedad. El segundo grupo estuvo integrado por las poblaciones de origen en los estados de Oaxaca y Puebla. El tercer grupo lo integraron solo poblaciones originarias de Guerrero y el último grupo fue el testigo inoculado que presentó la incidencia media más alta del estudio.

En el Cuadro 5 se presentan los resultados de las comparaciones de medias para los genotipos anidados dentro de estados y a través de los dos años. En este análisis, se encontró que ocho de las 11 poblaciones de maíz nativo del Estado de México no fueron afectadas por el patógeno en ninguna de sus repeticiones, en ambas evaluaciones, mientras que seis de las 13 poblaciones de Guerrero tuvieron una incidencia media de la enfermedad igual o superior al 10%. La resistencia observada en las poblaciones de maíz del Estado de México podría explicarse considerando que el primer reporte de la enfermedad en México fue en Amecameca, Edo. de México (^{Borlaug, 1946}) en plantas de teocintle, por lo que los maíces de la región habrían estado expuestos al patógeno, ocurriendo así la coevolución entre el patógeno y el hospedante. Por otra parte, las poblaciones de maíz de Guerrero fueron las más susceptibles a la enfermedad, correspondiendo a nuestra hipótesis inicial, generada a partir de observaciones en campo en donde se ha registrado una mayor susceptibilidad a la enfermedad en híbridos generados a partir de líneas provenientes del estado de Guerrero (Raza Tuxpeño) (comunicación personal Dr. Fernando Castillo González). En caso contrario, cuando las mismas 55 poblaciones fueron evaluadas en su respuesta a la pudrición de mazorca por Fusarium spp., las poblaciones de maíces nativos provenientes del Edo. de México mostraron una mayor susceptibilidad a la pudrición de mazorca como lo reportaron ^{Briones-Reyes et al. (2015}).

Considerando la escala empleada para la clasificación de las poblaciones y la separación de medias mostrada en el Cuadro 5 se puede observar que 48 de los 56 genotipos evaluados se encuentran dentro del rango de 0 a 10% de incidencia de la enfermedad, por lo que se consideran altamente resistentes a la enfermedad. Siete de los genotipos evaluados se encuentran en el rango entre el 11 y el 25% de incidencia de la enfermedad, considerándose moderadamente resistentes a la enfermedad y solo el testigo inoculado se ubicó entre el rango de 51 y 75% de incidencia de la enfermedad clasificándose como susceptible al carbón de la espiga del maíz. Los resultados anteriores demuestran que la diversidad presente en las poblaciones de maíz evaluadas permitiría la selección de germoplasma resistente a la enfermedad. De igual forma, la variación en la respuesta a la enfermedad en los materiales evaluados hace evidente que el tipo de resistencia a esta enfermedad es de tipo cuantitativo. Lo anterior se corrobora por el método de selección (S1 recurrente) empleado por ^{De León (2020)}, para la generación de variedades de polinización libre con resistencia a la enfermedad.

La información obtenida en el presente estudio es la primera exploración sobre la presencia de genes de resistencia a la enfermedad en maíces nativos, que permiten excluir de un programa de mejoramiento para resistencia a la enfermedad a aquellas poblaciones que presentaron un mayor porcentaje de incidencia en ambas evaluaciones. La información generada en el presente estudio pretende incentivar el rescate y uso de los materiales nativos de maíz, así como incentivar el inicio de programas de mejoramiento para el desarrollo de líneas con resistencia genética a la enfermedad como lo han hecho ^{Quezada-Salinas et al. (2017}) y la subsecuente generación de variedades de polinización libre con alto rendimiento y resistencia genética a la enfermedad, como la variedad de polinización libre CP-Vero1 generada por ^{De León (2020)}. Finalmente, se sugiere continuar la evaluación de germoplasma nativo de maíz considerando un mayor número de poblaciones clasificadas por raza, evaluaciones simultaneas bajo diferentes ambientes y estudios moleculares para asegurar la presencia de genes resistencia en las poblaciones que pretendan usarse como posibles fuentes de resistencia a la enfermedad.

CONCLUSIONES

Existe variación en la respuesta de germoplasma nativo de maíz a la infección de S. reilianum f. sp. zeae. dependiendo de su origen geográfico. La variación en la respuesta de las poblaciones a la infección sugiere la presencia de genes de resistencia al patógeno en las poblaciones que no fueron afectadas por la enfermedad. Los maíces nativos de Guerrero mostraron una mayor susceptibilidad a la enfermedad, mientras que los maíces colectados en el Estado de México y Tlaxcala presentaron la mayor resistencia. La condición de alta humedad en el suelo en las primeras etapas del desarrollo del cultivo reduce la incidencia de la enfermedad.