Las variedades comerciales de nochebuena son las plantas de maceta más vendidas en el mundo (^{Canul et al., 2012}). En el 2018 en Estados Unidos de América el valor de la producción del cultivo de nochebuena fue superior a los 148 millones de dólares (^{USDA, 2019}). En este mismo año en México se produjeron 19 millones de plantas, con un valor de producción de 718 millones de pesos (^{SADER, 2019}). El cultivo de nochebuena se encuentra amenazada por plagas y enfermedades, donde los virus tienen mayor importancia (^{Bertaccini et al., 1996}). Las variedades de nochebuena son hospedantes del Poinsettia latent virus(PnLV) (^{aus dem Siepen et al., 2005}), Euphorbia leaf curl virus (EuLCV) (^{Ma et al., 2004}) y Poinsettia mosaic virus (PnMV), este último como el principal patógeno viral del cultivo y con distribución mundial (^{Clarke et al., 2006};^{Okano et al., 2010}).

Las variedades comerciales de nochebuena infectadas con el PnMV presentan comúnmente síntomas de mosaico y moteado en las hojas, así como deformación foliar incluyendo brácteas, algunas plantas pueden ser asintomáticas (^{Fulton y Fulton, 1980}; ^{Lebas et al., 2007}). En infecciones severas el PnMV interfiere en el proceso de pigmentación de las brácteas, atractivo principal de la nochebuena, poniendo en riesgo la producción del cultivo (^{Brunt et al., 1996}). En México, el PnMV infecta plantas de nochebuena silvestre, de traspatio y las variedades comerciales ‘Freedom’ y ‘Red Prestige’ (^{Jacobo et al., 2015}; ^{Ocampo et al., 2013}); no obstante, se desconoce la presencia de este virus en otras variedades que se comercializan en el país. Una de las limitantes en el estudio biológico del PnMV es el bajo porcentaje de éxito en la transmisión mecánica del virus en especies diferenciales (0-10%) (^{Guy et al., 1985}). Por lo anterior, los objetivos de esta investigación fueron la identificación del PnMV en 20 variedades comerciales de nochebuena y evaluación de dos soluciones amortiguadoras en la transmisión mecánica del PnMV en especies diferenciales. Las hipótesis fueron que las variedades de nochebuena que se comercializan en México se encuentran infectadas con el PnMV, y que al menos una solución amortiguadora es adecuada para transmitir mecánicamente el PnMV a especies diferenciales.

En diciembre de 2016-2018, se adquirieron plantas asintomáticas (A) y con síntomas (S) putativos a virus de 20 variedades comerciales de nochebuena (100% pigmentadas), en un vivero ubicado en Texcoco, Estado de México. Las ventajas de adquirir los materiales en esta temporada invernal son la diferenciación total de brácteas y presencia de hojas desarrolladas en las plantas, lo que facilita la observación de los síntomas virales. El material vegetal (esquejes enraizados) provenía de las empresas florícolas Floraplant^® y Vivero internacional de México^®, empresas que importan el material vegetal de Estados Unidos de América principalmente.

El número total de plantas en maceta adquiridas de cada variedad estuvo condicionado por la disponibilidad del material vegetal. Las variedades y número de plantas adquiridas en cada año fueron: 2016: ‘Silverstar Marble’ (tres plantas, A), ‘Silverstar Red’ (dos plantas, A), ‘Sparkling Punch’ (una planta, S), ‘Ice Punch’ (tres plantas, A), ‘Marblestar’ (dos plantas, A), ‘Cortez Electric Fire’ (una planta, A), ‘Carousel Dark Red’ (una planta, A) y ‘Primero White’ (seis plantas, A); 2017: ‘Cortez Red’ (dos plantas, S), ‘Enduring Marble’ (dos plantas, S), ‘Freedom Pink’ (dos plantas, A), ‘Monet Early’ (dos plantas, A), ‘Polar Bear’ (dos plantas, S), ‘Premier Pink’ (dos plantas, A), ‘Viking Cinnamon’ (dos plantas, A), ‘Winter Rose Early Red’ (dos plantas, S) y ‘Winter Rose White’ (dos plantas, A); 2018: ‘Amaris Hot Pink’ (11 plantas, S), ‘Primero Red Glitter’ (seis plantas, S) y ‘Orange Spice’ (seis plantas, A). Las plantas se establecieron en el invernadero de Floricultura del Departamento de Fitotecnia de la UACh. Se mantuvieron a temperaturas de 22 °C en el día y 15 °C en la noche, con un fotoperiodo de 11-12 h, y se manejaron agronómicamente como lo indica ^{Cabrera et al. (2006}). Se tomaron muestras de hojas jóvenes, brácteas y tallos de todas las variedades y se mantuvieron refrigeradas a -20 °C para su posterior análisis.

Las pruebas serológicas se realizaron en el Laboratorio Nacional de Investigación y Servicio Agroalimentario y Forestal, en diciembre de 2019. Se realizó el diagnóstico con el método DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales para la detección del PnMV, adquiridos con la empresa Agdia^® (número de catálogo SRA 90700/0500). En cada variedad de nochebuena se realizó el análisis por duplicado (dos muestras por planta de cada variedad), de acuerdo con el protocolo establecido por el fabricante. Las muestras consistieron en 0.5 g de hojas jóvenes, maceradas individualmente en morteros estériles utilizando nitrógeno líquido. Las muestras depositadas en las placas sensibilizadas con el conjugado enzimático se incubaron a 4 °C durante 12 h. Como control positivo se utilizó la variedad comercial ‘Red Prestige’ (proporcionada por el Laboratorio de Virología Agrícola de la UACh.) y como control negativo una planta de nochebuena silvestre (recolectada en Tehuilotepec, Guerrero).

Los valores de absorbancia se midieron a 405 nm en un lector de microplacas Varioskan Flash Thermo Scientific^® a los 60 min de incubación. De acuerdo con ^{Ruiz et al. (2009}) se consideraron positivas las muestras con valores mayores a tres veces la media del testigo negativo.

Las pruebas moleculares se llevaron a cabo en el Laboratorio de Virología Agrícola del Departamento de Parasitología Agrícola de la UACh. La extracción del ARN total se realizó con el reactivo PureLink™ Plant ARN Reagent (número de catálogo 12322012) de la empresa Thermo Fisher Scientific^®, de acuerdo con el protocolo señalado por el fabricante. De cada variedad de nochebuena se tomaron muestras de 0.1 g de tejido vegetal en hojas jóvenes, tallos y/o brácteas, se maceraron individualmente con nitrógeno líquido en morteros estériles, cada macerado se depositó en tubos de microcentrífuga (1.5 mL) adicionando 500 µL de la solución de lisis. Las muestras se centrifugaron a 12,000 x g durante 2 min a 4 °C, se recuperó el sobrenadante y se mezclaron con 100 µL de cloruro de sodio 5 M y 300 µL de cloroformo, se centrifugaron durante 10 min y se recuperó la parte superficial, y se adicionaron 1.5 volúmenes de isopropanol (en relación al recuperado) y se incubaron a -4 °C durante 12 h. Posteriormente, se centrifugaron nuevamente durante 10 min, la limpieza del ARN se realizó con etanol al 70%, finalmente la pastilla del ARN se diluyó en agua libre de nucleasas (Promega^®) y se almacenó a -20 °C.

Se determinó la concentración del ARN total en un espectrofotómetro NanoDrop ThermoFisher Scientific^®, y se corroboró su integridad con electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v (120V/60 min), visualizado en un fotodocumentador Quantum Studio^®. Para determinar la viabilidad del ARN se amplificó un fragmento del gen ribosomal 18S, con los iniciadores 18S-F (5’-ACGGATCGCACGGCCTTCGTG-3’) y 18S-R (5’-ACCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’), que amplifican un fragmento de 300 pb, de acuerdo con las condiciones de RT-PCR señaladas por ^{Zamboni et al. (2008}).

Para la detección del PnMV en las variedades de nochebuena, se amplificó un fragmento de la proteína de la cápside del virus, con los iniciadores específicos PnMV-F (5´-GTGCCAGCCGCCGTTCTTCT-3´) y PnMV-R (5´-GAGCCGGCGACTCCAT CCA-3´) que amplifican un fragmento de 700 pb y se llevó bajo las condiciones de RT-PCR señaladas por ^{Ocampo et al. (2013}). Los productos de RT-PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% p/v (120V/60 min). Los iniciadores utilizados en las pruebas moleculares (18S-F, 18S-R, PnMV-F y PnMV-R) se sintetizaron en el Instituto de Biotecnología de la UNAM en Cuernavaca, Morelos. Como control positivo se utilizó la variedad comercial ‘Red Prestige’ y como control negativo una planta de Nicotiana clevelandii, en ambos casos se utilizó tejido foliar para el análisis.

Los productos de RT-PCR se enviaron a secuenciar a Macrogen en Corea y se compararon con las registradas en el GenBank para el PnMV, usando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Por otro lado, se realizó inoculación mecánica del PnMV en plantas diferenciales de Nicotiana benthamiana, N. glutinosa, N. clevelandii y Chenopodium amaranticolor, a los 60 días después de la emergencia de las plantas. El inóculo se obtuvo de las variedades comerciales positivas al PnMV analizadas por RT-PCR, exceptuando ‘Amaris Hot Pink’, por lo que se tuvieron 12 fuentes de inóculo. Se utilizaron dos soluciones amortiguadoras: amortiguador de Fosfatos + DIECA (ácido dietilditiocarbámico) con pH 8.6 y amortiguador de Fosfatos de Na (mono y dibásico) con pH 7.8, con la finalidad de incrementar el porcentaje de éxito en la transmisión del virus, debido a su baja tasa de transmisión en especies diferenciales (^{Chung et al., 2004}; ^{Guy et al., 1985}). Para preparar las soluciones virales e inoculación de las plantas diferenciales se siguió la metodología descrita por ^{Jacobo et al. (2015}), se maceraron individualmente hojas jóvenes de cada fuente de inóculo en un mortero estéril y se adicionó el amortiguador respectivo en relación 1/10 p/v. Se inocularon 24 plantas por especie diferencial: dos plantas por fuente de inóculo (una para cada solución amortiguadora). Se establecieron dos plantas como testigos negativos en cada especie, inoculadas únicamente con cada una de las soluciones amortiguadoras. Utilizando un hisopo estéril embebido con la solución viral o solución amortiguadora (testigos negativos) se frotaron de 4 a 5 hojas jóvenes por planta diferencial, asperjadas previamente con carborundum de 600 mallas.

Los materiales inoculados se mantuvieron en observación en el invernadero de Floricultura del Departamento de Fitotecnia de la UACh. Estos materiales no se fertilizaron. A los 60 días después de la inoculación (ddi) todos los materiales se analizaron molecularmente para determinar la transmisión del PnMV (de acuerdo con la metodología antes descrita para la extracción de ARN y RT-PCR en las variedades comerciales de nochebuena).

Las variedades comerciales de nochebuena que se observaron asintomáticas en el momento de su adquisición permanecieron sin cambios aparentes en el invernadero y representaron el 65% de la población evaluada. De acuerdo con ^{Lebas et al. (2007}) el PnMV en ocasiones no induce síntomas en las plantas infectadas, lo que explicaría la “apariencia sana” en estas variedades. El 35% de la población de nochebuenas presentó síntomas putativos a virus desde el momento de su adquisición y durante su permanencia en el invernadero (1 año aproximadamente). En estas plantas se observaron síntomas de mosaico, moteado, clorosis y deformación foliar. ^{Carballo et al. (2001}) y ^{Chung et al. (2004}) mencionan que estos síntomas son característicos en variedades de nochebuena infectadas con PnMV. En la variedad ‘Enduring Marble’ se presentó amarillamiento de nervaduras, ^{Bertaccini et al. (1996}) asocia este síntoma secundario a la infección por el virus. En ‘Primero Red Glitter’ las brácteas presentaron deformaciones severas y no se pigmentaron en su totalidad, de acuerdo con ^{Brunt et al. (1996}) estos síntomas se asocian a la infección del PnMV (Figura 1).

Figura 1. Síntomas putativos a virus en variedades comerciales de nochebuena. A-E) ‘Primero Red Glitter’; A-C): deformación de la lámina foliar y mosaico clorótico; D): bráctea deforme (en proceso de diferenciación); E): conjunto de brácteas con deformación severa; F) ‘Winter Rose Early Red’, mosaico; G): ‘Cortez Red’, deformación y mosaico; H): ‘Enduring Marble’, clorosis y amarillamiento de nervaduras; I y J) ‘Polar Bear’; I): clorosis: J): moteado; K) ‘Sparkling Punch’, manchas cloróticas; L): ‘Primero White’ hoja asintomática. 

Los valores de absorbancia (DAS-ELISA) presentados en todas las variedades comerciales fueron superiores al límite de detección (LD). Los valores promedios de absorbancia en las variedades estuvieron entre 0.908 y 1.837. ‘Monet Early’ presentó los valores mayores de absorbancia, mientras que ‘Sparkling Punch’ presentó valores menores. Los resultados serológicos indicaron que el 100% de las plantas estuvieron infectadas con el virus PnMV.

La amplificación del fragmento del gen ribosomal 18S con el ARN obtenido en las variedades comerciales garantizó la viabilidad del ARN en las pruebas moleculares. Se realizó RT-PCR con los iniciadores específicos para la identificación del PnMV. Se corroboró la presencia del virus en 13 variedades: sintomáticas: ‘Sparkling Punch’, ‘Amaris Hot Pink’, ‘Polar Bear’, ‘Primero Red Glitter’ y ‘Winter Rose Early Red’; y asintomáticas: ‘Silverstar Marble’, ‘Silverstar Red’, ‘Ice Punch’, ‘Marblestar’, ‘Cortez Electric Fire’, ‘Carousel Dark Red’, ‘Primero White’ y ‘Monet Early (Cuadro 1), mediante la amplificación del fragmento esperado. Se identificó molecularmente al PnMV en 65% de las variedades evaluadas, la identificación del virus en diferentes tejidos de la planta se realizó para disminuir el riesgo de obtener falsos positivos, por falta de carga viral en determinados tejidos. Mediante las pruebas serológicas y moleculares se identificó al PnMV tanto en plantas sintomáticas como asintomáticas, estos resultados evidencian que el virus puede estar presente en las plantas de nochebuena sin inducir síntomas, como lo mencionan ^{Lebas et al. (2007}) lo que representa una fuente de inóculo latente del patógeno, poniendo en riesgo la sanidad de las plantas en la producción del cultivo.

Las secuencias de ADN del PnMV obtenidas en 11 de las variedades comerciales tuvieron porcentajes de similitud del 95-98% con la secuencia de un aislamiento del virus reportado en Japón con número de accesión AB550788.1. De acuerdo con ^{Jacobo et al. (2015}) las secuencias de ADN obtenidas del virus en las variedades ‘Freedom’ y ‘Red Prestige’ se alinearon a esta misma secuencia con porcentajes de similitud del 92%. En ‘Marblestar’ se obtuvo un porcentaje de similitud del 97% con la secuencia de ADN del virus reportado en Alemania con número de accesión AJ271595.1. El amplicón obtenido en ‘Amaris Hot Pink’ no se mandó a secuenciar.

Las plantas de N. benthamiana que se inocularon con el PnMV (solución de fosfatos + DIECA) presentaron verrugas, clorosis sistémica, deformación y puntos cloróticos en las hojas (Figura 2), estos síntomas coinciden con los descritos por ^{Lebas et al. (2007}) quienes al inocular plantas de esta especie con el virus observaron verrugas y clorosis sistémica en hojas. Las plantas inoculadas con PnMV utilizando el amortiguador de fosfatos de Na (mono y dibásico) se mostraron asintomáticas, posiblemente a la incompatibilidad del amortiguador con el virus. De acuerdo con ^{Guy (1985}) el PnMV presenta un porcentaje de éxito en la transmisión mecánica del 0-10%.

Figura 2. Síntomas observados en las plantas diferenciales inoculadas con el PnMV. A-E): N. benthamiana; A): verrugas; B): clorosis sistémica; C): deformación; D): puntos cloróticos; E): Testigo (-), daño mecánico; F-I): N. glutinosa; F): deformación; G): manchas blancas; H): mosaico ligero; I): Testigo (-), daño mecánico; J-L): N. clevelandii; J): clorosis; K): daño mecánico; L): Testigo (-), hoja sana; M-O): C. amaranticolor; M y N): daño mecánico; O): Testigo (-), daño mecánico. 

En el caso particular de N. glutinosa, N. clevelandii y C. amaranticolor, no se observaron diferencias en los síntomas expresados con respecto a la utilización de las soluciones amortiguadoras. En N. glutinosa se observaron síntomas de mosaico ligero atribuibles a la transmisión del virus. Las plantas de N. clevelandii presentaron síntomas de clorosis en las hojas, posiblemente como respuesta a infección viral. En C. amaranticolor las plantas inoculadas se mostraron asintomáticas (Figura 2).

Todas las plantas diferenciales inoculadas con el PnMV se analizaron por RT-PCR, los resultados obtenidos fueron negativos. Las plantas diferenciales de N. benthamiana, N. glutinosa y N. clevelandii están reportadas como hospedantes del PnMV, mientras que C. amaranticolor no es susceptible a la infección por este patógeno (^{Brunt et al., 1996}). A pesar de los resultados negativos en las pruebas moleculares, los síntomas observados en N. benthamiana, se puede atribuir a la infección del PnMV, ya que de acuerdo con Brunt et al. (1996), ^{Floeistad y Blystad (1999)} y ^{Lebas et al. (2007}) en esta especie se ha podido inocular mecánicamente y reaislar el virus, y señalan esta especie como adecuada para el diagnóstico del patógeno, ya que las plantas inoculadas con el virus se infectan sistémicamente.

Los resultados negativos en las pruebas de RT-PCR del PnMV en las plantas diferenciales pueden atribuirse a la presencia de inhibidores, como se observó en las variedades comerciales de nochebuena, donde mediante las pruebas serológicas se obtuvieron resultados positivos (validados por los controles negativos y positivos) que no se pudieron corroborar molecularmente, ^{Lebas et al. (2007}) mencionan que las causas probables pueden ser la presencia de inhibidores y látex que dificultan la extracción de ARN, por lo que sugieren la identificación del virus mediante RT-PCR para caracterizar aislamientos y las pruebas DAS-ELISA para detección del patógeno.

Se detectó el Poinsettia mosaic virus en 100 % de las variedades comerciales de nochebuena evaluadas con la técnica serológica DAS-ELISA y en 65% mediante pruebas moleculares RT-PCR. El 35% de las variedades mostró síntomas característicos de la infección viral, mientras que el 65% fueron asintomáticas. La identificación del PnMV se obtuvo tanto en plantas sintomáticas como asintomáticas. El origen del material vegetal no influyó en los resultados. El empleo de la solución amortiguadora de fosfatos + DIECA, pH 8.6 en la inoculación mecánica de PnMV en plantas de Nicotiana benthamiana, propició la aparición de síntomas putativos a la infección por el virus, pero no se corroboró molecularmente.