Las plantas se encuentran constantemente defendiéndose de los fitopatógenos mediante una amplia gama de respuestas que les permite de manera temprana reconocer, detener y contrarrestar la infección (^{Prusky et al., 2013}). La familia de proteínas PRs son un grupo de proteínas vegetales que se considera juegan un papel importante en la resistencia a las enfermedades causadas por diversos patógenos en plantas, incluyendo, hongos, virus, bacterias y oomicetos (^{Mahendranathan et al., 2016}). Este grupo de proteínas tiene una amplia distribución en el reino vegetal; en las plantas sanas, las proteínas PRs se encuentran en cantidades mínimas, pero su expresión aumenta significativamente durante y/o después del ataque de patógenos (^{Durrant y Dong, 2004}). Entre las proteínas PRs, la quitinasa (PR3) y la β-1,3-glucanasa (PR2), son dos grupos de enzimas hidrolíticas que abundan en diferentes especies de plantas, después de la infección por diferentes hogos fitopatógenos. Estas desempeñan un papel principal en la reacción de defensa contra dichos patógenos, pues actúan degradando la pared celular del patógeno, debido a que la quitina y el β-1,3-glucano son componentes estructurales importantes de las paredes celulares de dichos organismos. Las β-1,3-glucanasas parecen expresarse coordinadamente junto con las quitinasas después de la infección por hongos en plantas (Durrant y Dong, 2004).

En el género Agave, la enfermedad de marchitez y pudrición seca del cogollo es uno de los problemas fitosanitarios más graves que enfrenta, esta enfermedad ésta asociado principalmente con el hongo F. oxysporum (^{López-Bautista et al., 2020}). Este patógeno ataca a las plantas de Agave sin importar su etapa de desarrollo; inicia con un aclaramiento en las hojas basales, seguido de marchitez, necrosis y pudrición en el interior del cogollo, generando finalmente la muerte de la planta (^{Flores et al., 2009}; López-Bautista et al., 2020). Sin embargo, en Agave spp. se desconoce la actividad enzimática de defensa que se promueven durante la infección por F. oxysporum, por lo que el objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad de proteínas relacionadas a la patogénesis, tales como β-1,3-glucanasa y quitinasa en plantas de A. americana infectadas con F. oxysporum, así como observar el crecimiento intracelular del patógeno en la raíz por microscopia electrónica de barrido.

La cepa de F. oxysporum que se utilizó en este estudio, se obtuvo de tejido de la base del tallo de una planta de A. americana de aproximadamente tres años de haber sido trasplantada, que presentaba síntomas de marchitez, aunado a clorosis y enrollamiento foliar. Esta planta se localizó en una plantación comercial en el municipio de Comitán, Chiapas, México (16° 17’ 30” N, 92° 10’ 1” O). Para su asilamiento, se cortaron segmentos de tallo de aproximadamente 0.25 cm por lado, de la zona de la corona, que se desinfectaron sumergiéndolos durante 2 min en una mezcla de hipoclorito de sodio (6%), alcohol etílico (100%) y agua destilada estéril en proporción 1:1:8. Posteriormente, estos fragmentos se enjuagaron en dos ocasiones con agua destilada estéril. Los fragmentos se sembraron en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) suplementado con 0.12 g L^-1 de estreptomicina y 0.25 g L^-1 de cloranfenicol. Una vez identificado morfológicamente de acuerdo a las características reportadas a F. oxysporum (^{Leslie y Summerel, 2006}), se obtuvo un cultivo monospórico, se sembró nuevamente en medio PDA, con una película de celofán dulce esterilizado cubriendo el medio, con el fin de generar micelio y separarlo fácilmente. El micelio se utilizó para obtener ADN y amplificar el fragmento ITS1-5.8S-ITS4 por PCR punto final utilizando los iniciadores ITS1 5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´ e ITS4 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´ (^{White et al., 1990}). La cepa se reactivó en PDA incubándolo a 28 ± 2 °C durante 15 días, transcurrido este tiempo, se inoculó un cuadro micelial de 1 cm² en 250 mL de caldo papa dextrosa (24 g L^-1). El matraz se mantuvo en agitación constante a 120 rpm durante 10 días para obtener la suspensión de esporas. La concentración de conidios se determinó con una cámara de Neubauer.

Por otro lado, la inoculación se realizó en plantas de A. americana obtenidas in vitro de seis meses de edad, las cuales fueron aclimatadas previamente por tres meses en condiciones de invernadero. Las plantas se trasplantaron a macetas de plástico de 10 cm, usando una mezcla de peat moss y agrolita (1:1) previamente esterilizado a una temperatura de 121 °C y 15 lb de presión por una hora y se mantuvieron por 60 días en una cámara de crecimiento a una temperatura de 25 °C. El inóculo consistió de una suspensión de conidios de F. oxysporum (2 x 10⁸ conidios mL^-1), el cual fue aplicado en las raíces de las plantas trasplantadas, donde previamente se les realizó una herida de aproximadamente 0.5 cm. Posterior a esto, las plantas se incubaron en una cámara de crecimiento con una temperatura controlada a 28 °C y humedad relativa de 60-90%. Se inocularon 60 plantas (tres repeticiones de 20 plantas) y 20 plantas sin inocular (control).

Para observar el proceso de infección de F. oxysporum en plantas de A. americana, se recolectaron muestras de raíces de cinco plantas infectadas, a los 7, 15 y 30 días después de la inoculación (DDI); así mismo, se tomaron raíces de cinco plantas sin inocular. Las muestras se procesaron de acuerdo con el protocolo descrito por ^{Ruíz-May et al. (2011}) con ligeras modificaciones. Las muestras se fijaron durante 72 h con glutaraldehído (2.5% v/v) en un tampón fosfato (0.2 M; pH 7.2). La fijación fue seguida por un enjuague con tampón fosfato (0.2 M; pH 7.2), enseguida se deshidrataron gradualmente con etanol (30%, 50%, 70%, 85%, 96% y 100%) y se secaron con CO₂ líquido (Balzers CPD 020 Critical Point Dryer; Bal-Tec, Schalksmuhle, Alemania). Posteriormente, las muestras de aproximadamente 0.5 mm se montaron en trozos metálicos con cinta adhesiva conductora de carbono, recubiertas por pulverización catódica con oro coloidal y se observaron a 10-20 kV utilizando un microscopio electrónico de barrido Zeiss DSM 940A (Zeiss, Oberkochen, Alemania).

Muestras de raíces de cinco plantas infectadas por F. oxysporum y de cinco plantas control se recolectaron a los 0, 7, 15 y 30 DDI, este procedimiento se repitió tres veces. El extracto enzimático se obtuvo siguiendo la metodología de ^{Pan et al. (1991}), con ligeras modificaciones. Brevemente, se homogenizaron 0.3 g de raíces liofilizadas de A. americana con nitrógeno líquido, con 1.5 mL de amortiguador de extracción (acetato de sodio 0.05 M, pH 5.0, adicionado con 250 mM sacarosa, 50 mM de NaCl 1mM de β-mercaptoetanol, 1 mM (PMS), se agregó 0.15 g de polivinil polipirrolidona (PVPP), el homogenado se centrifugó a 13,000 rpm por 30 min a temperatura ambiente, finalmente el sobrenadante se almacenó a -20 °C para su posterior uso en los ensayos enzimáticos. El contenido proteico de los extractos enzimáticos se determinó por el método de ^{Bradford (1976}).

La actividad de quitinasa o de β-1,3 glucanasa se determinó en los extractos enzimáticos de las raíces colectadas a los 0, 7, 15 y 30 DDI con F. oxysporum, así como de plantas control. El ensayo de quitinasa se realizó de acuerdo a la metodología de ^{Ferrari et al. (2014}) con ligeras modificaciones. Para la mezcla de reacción con extracto enzimático se utilizaron 50 µL de glicol-quitina al 0.05% como sustrato y 448 µL de amortiguador de acetato 0.5 mM (pH 5.0), con una incubación a baño maría de 40 °C por 30 min, transcurrido el tiempo se enfriaron los tubos y se les agregó una solución de ferrocianuro de potasio (C₆FeK₄N₆). Los tubos se colocaron a 95 °C por 15 min, transcurrido el tiempo, los tubos se dejaron enfriar y se determinó su absorbancia a 420 nm. La curva patrón se realizó con N-acetilglucosamina. La actividad de quitinasa se expresó en unidades de µmol min^-1 mg^-1 de proteína.

La actividad de β-1,3 glucanasa se determinó por el método de ^{Honorato et al. (2015}). La reacción se inició mediante la adición de alícuotas de 7 μL del extracto enzimático en una mezcla de 986 μL de amortiguador de acetato de sodio 50 mM (pH 5.0) y 7 μL del sustrato laminarina (0.15%). La mezcla de reacción se incubó en baño de agua durante 10 min a 40 °C. Después del período de incubación, la cantidad de azúcares reductores se determinó agregando 333 μL de ácido dinitrosalicílico (DNS) a la mezcla y luego se incubo la mezcla resultante en baño maría durante 10 min a 90 °C. La reacción se detuvo enfriando las muestras en hielo durante 5 min. Las absorbancias de las muestras se midieron a una longitud de onda de 540 nm. La actividad de glucanasa se expresó en unidades de µmol min^-1 mg^-1 de proteína.

Los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) para determinar si existían diferencias significativas entre los tratamientos evaluados, seguido por una comparación de medias usando la prueba de Tukey (p≤0.05). Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el software STATGRAPHICS^® Centurion XVI.II (^{Statgraphic, 2010}).

El aislamiento se corroboró molecularmente como Fusarium oxysporum de acuerdo a la base de datos de GenBank y se denominó ITTG_Foxy_C6, el cual forma parte del cepario del Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez con número de accesión en GenBank (MT791313).

La colonización de las raíces por F. oxysporum se observó mediante microscopía electrónica de barrido en los diferentes días de muestreo (Figura 1). A los 7 DDI se realizaron cortes longitudinales de las raíces y no se observó la presencia del hongo, sin embargo, en la superficie de la raíz se observó micelio y esporas, lo cual sugiere que el hongo aún no había entrado en la raíz. ^{Czymmek et al. (2007}) y ^{Padilla-Ramos et al. (2018}) mencionan que, durante la adhesión de las esporas a la superficie de la raíz, se forma una densa red de hifas (micelio) así como secreciones y/o efectores por parte del hongo que permiten iniciar la penetración. Además, mediante microscopía electrónica se ha demostrado la ausencia de apresorios o hifas especializadas de penetración en F. oxysporum, así como la formación de hifas que penetran la pared de las células epidérmicas y la formación de un septo en el punto de penetración (^{Perez-Nadales y Di Pietro, 2011}). En cortes longitudinales de raíces de 15 DDI, se observaron hifas de F. oxysporum, esto significa que el hongo logró superar las defensas de la planta, invadiendo y creciendo dentro de la raíz por los espacios inter e intracelulares alcanzando los vasos del xilema a través de orificios generados por el hongo. A los 30 DDI, el hongo colonizó completamente el interior de la raíz, a medida que el micelio crece, se ramifica y produce microconidios, los cuales suben por los vasos del xilema gracias a la corriente de savia bruta (sales minerales y agua) (Figura 1). La invasión y proliferación del hongo dentro de las raíces provoca una obstrucción de los vasos conductores, lo cual origina un desequilibrio hídrico, en consecuencia, las hojas empiezan con síntomas de amarillamiento y posteriormente marchitez (^{Wang et al., 2015}). En condiciones óptimas F. oxysporum requiere de 30 días para llevar a cabo su proceso de infección en raíces de A. americana.

Figura 1. Fotografías de microscopia electrónica de barrido de raíces de Agave americana infectadas con Fusarium oxysporum A) Superficie de raíz a los 7 DDI, B) Corte longitudinal de raíz a los 15 DDI, C) Corte longitudinal de raíz a los 30 DDI. C: Conidios, H: Hifas. 

Previo a esta investigación, en A. americana no se tenían reportes de la confirmación de la marchitez ocasionada por F. oxysporum mediante microscopía electrónica de barrido en especies de Agave. Sin embargo, sí hay trabajos similares en diferentes cultivos como en chile criollo tipo serrano CM334 (Capsicum annum) donde se determinó el avance de la necrosis a los 3, 23 y 30 después de la infección causada por el hongo, reportándose su avance hasta el tallo de la planta; registrando la presencia de micelio, microconidos y macroconidios en todos los segmentos evaluados (^{Sanzón et al., 2012}). En el caso del cultivo de garbanzo (Cicer arietinum) se observó que F. oxysporum colonizó el interior de la raíz en solo tres días (^{Joshi et al., 2012}). Aunque la sintomatología observada en plantas de A. americana es atribuida a F. oxysporum es conveniente realizar análisis más exhaustivos, ya que recientemente ^{López-Bautista et al. (2020}), demos traron la asociación de cinco de especies de Fusarium, asociados con síntomas de marchitez y/o pudrición seca en Agave tequilana, las cuales mediante un estudio filogenético se clasificaron en tres com plejos: F. oxysporum (FOSC), F. solani (FSSC) y F. fujikuroi (FFSC), con predominación de F. oxysporum (FOSC) con 56% de representatividad regional. Por lo anterior, síntomas de marchitez y pudrición seca del cogollo del agave se consideran un síndrome causados por diferentes especies de Fusarium con adaptabilidad parasítica diferencial a nivel intra e interespecie (López-Bautista et al., 2020).

La actividad específica de quitinasa durante el tiempo analizado mostró un aumento significativo (63.43 µmol min^-1µg proteína) a los 15 DDI con respecto a las plantas no infectadas (27.24 µmol min^-1µg proteína), dicho incremento en la actividad puede deberse a que algunas proteínas PRs se expresan en niveles basales de forma constitutiva, pero su expresión aumenta en respuesta a un ataque de patógeno y a la posterior activación de la respuesta sistemática adquirida (SAR) (^{Durrant y Dong, 2004}). Además, la inducción de proteínas PRs es una forma de limitar la entrada o propagación del patógeno al interior de la planta (^{Gupta et al., 2013}). En presencia de hongos fitopátogenos, las plantas producen enzimas como la β-1,3-glucanasa y la quitinasa (^{Santos et al., 2004}) para desintegrar los componentes de la pared celular de hongos hasta sus unidades estructurales básicas, glucanos y quitina. Se observó diferencia estadística significativa en la actividad de quitinasa a los 30 DDI en plantas infectadas y no infectadas (Figura 2) con menor actividad en las plantas infectadas (21.1 µmol min^-1µg proteína). Por otro lado, la actividad de la β-1,3 glucanasa fue menor en plantas infectadas (30.484 µmol min^-1µg proteína) en comparación con las no infectadas (32.167 µmol min^-1µg proteína). Sin embargo, a los 15 DDI se observó un ligero incremento de su actividad en plantas infectadas (Figura 3).

El aumento de la actividad de quitinasa y β-1,3-glucanasa por diferentes hongos se ha reportado en diversas especies de plantas tales como, jitomate (Solanum lycopersicum), melón (Cucumis melo) y limón (Citrus x limon) (^{Ramammoorthy et al., 2002}; ^{Baldé et al., 2006}; ^{Fanta et al., 2003}). Nuestros resultados sugieren que, en plantas de A. americana, la actividad de quitinasa y β-1,3 glucanasa actúan como mecanismo de defensa ante la infección por F. oxysporum a los 15 DDI. Sin embargo, este incremento en las actividades de las proteínas PRs probablemente no es suficiente para impedir la colonización del hongo en las raíces como se muestra en la Figura 1.

Figura 2. Actividad de quitinasa (PR3) en raíces de Agave americana durante la infección con Fusarium oxysporum. Letras diferentes representan diferencia estadística significativa (ANOVA) p≤0.05. 

El análisis de microscopía electrónica de barrido confirmó la infección de F. oxysporum en raíces de A. americana a los 15 días después de su inoculación. La identidad el hongo fue confirmado molecularmente. Estos resultados sugieren que en plantas de A. americana se induce el mecanismo de defensa mediado por la activación de quitinasa, la cual está implicada en la defensa durante la infección de F. oxysporum; sin embargo, el incremento de esta enzima no es suficiente para impedir la colonización de raíces en esta especie. Estos resultados son los primeros aportes sobre la actividad enzimática de quitinasa y β-1,3-glucanasa como posibles mecanismos de defensa en el Agave americana.

Figura 3. Actividad de β-1,3 glucanasa (PR2) en raíces de Agave americana durante la infección con Fusarium oxysporum. Letras diferentes representan diferencia estadística significativa (ANOVA) p≤0.05.