Los bananos y plátanos (Musa spp.) están entre los cultivos más importantes en los países del trópico y el subtrópico. Estos ocupan el cuarto lugar en importancia a escala mundial después del arroz, el trigo y el maíz (^{FAO, 2017}). Sin embargo, la producción de estos cultivos se encuentra amenazada por el ataque de enfermedades como el Mal de Panamá o marchitez por Fusarium. Esta enfermedad causada por Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC) representa una de las enfermedades más destructivas y de importancia económica en el género Musa (^{Ploetz, 2015}). El control de esta enfermedad con el uso de agroquímicos resulta costoso y causa serios daños al medio ambiente. Por ello, en los últimos años se ha considerado al mejoramiento genético para la resistencia como la solución más adecuada. Toda técnica del mejoramiento necesita de un procedimiento para la selección positiva de los genotipos con cualidades superiores (^{Buddenhagen, 2009}). En trabajos previos se desarrolló un método para la diferenciación a nivel foliar de la resistencia de cultivares de banano a FOC raza 1 mediante la utilización de filtrados del cultivo del hongo (^{Companioni et al., 2003}). No obstante, los resultados para su introducción masiva en los programas de mejoramiento genético en el cultivo requieren ser validados para diferentes razas del hongo (aislado perteneciente al grupo de compatibilidad vegetativa (GCV) [01210] raza 1; y el aislado perteneciente al GCV [0124/125] raza 2. El presente trabajo se realizó con el objetivo de evaluar el método para la diferenciación rápida del Mal de Panamá mediante la utilización del filtrado del cultivo de FOC raza 1 GCV [01210] y raza 2 GCV [0124/125].

La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Interacción Planta-Patógeno del Centro de Bioplantas de la Universidad de Ciego de Ávila “Máximo Gómez Báez”, Cuba.

Material vegetal. Se utilizaron muestras foliares de plantas de banano de ocho a nueve meses de plantadas en el Banco de Germoplasma de Banano del Instituto Nacional de Investigaciones en Viandas Tropicales de Santo Domingo, Villa Clara, Cuba. Todos los cultivares de banano utilizados fueron clasificados previamente en resistentes o susceptibles a FOC raza 1 y 2, por ^{Pérez et al. (2004}).

Cepas fúngicas. FOC raza 1 GCV [01210]; y raza 2 GCV [0124/125], procedentes del cepario del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV), La Habana, Cuba.

Análisis estadístico. En el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el utilitario Statistical Package for Social Sciences (SPSS para Windows, versión 8, Copyright SPSS Inc., 1989-1997).

En la primera parte de la experimentación se procedió a la obtención de filtrados del cultivo del hongo durante el crecimiento in vitro de FOC raza 1 GCV [01210]; y raza 2 GCV [0124/125]. Para ello se determinó el momento óptimo para la cosecha del filtrado del cultivo del hongo de las razas 1 y 2 de forma diaria hasta los 30 días. Se realizaron las siguientes determinaciones: absorbancia del filtrado de cultivo del hongo (A), masa fresca del cultivo del hongo (g) y la actividad fitotóxica de los filtrados de cultivo del hongo.

Filtrados del cultivo del hongo (FC). Para obtener el cultivo en medio líquido de las cepas de FOC correspondientes a la raza 1 y 2 del hongo; se tomaron discos de micelio de 8 mm de diámetro próximos a la periferia de la colonia crecida en placas de Petri con medio de cultivo Agar Papa Dextrosa. Se añadió 100 mL de medio de cultivo Caldo Czapek modificado según ^{Companioni et al. (2004}) con un pH 5.5, en erlenmeyers de 250 mL de capacidad. Cada erlenmeyer se inoculó con un disco de micelio, y se incubó a 28±2 ^°C, 56 µmol.m^-2.s^-1 de intensidad luminosa, y con un fotoperíodo de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Los FC del hongo se cosecharon de forma diaria hasta los 30 días, para ambas razas del hongo. En cada uno de los tiempos de evaluación se colectaron tres erlenmeyers con un volumen de 100 mL de medio de cultivo inoculado. El medio de cultivo líquido se filtró en cada uno de los tiempos evaluados a través de cuatro capas de gasa y luego por papel de filtro Whatman No. 1. Posteriormente, se determinó la masa fresca del cultivo del hongo para determinar el crecimiento del microorganismo. Antes de la determinación de la absorbancia; y la actividad fitotóxica de los FC del hongo, el FC se centrifugó a 8000 rpm durante 20 minutos en una centrífuga Sigma-201M para eliminar los restos de micelio y conidios. El sobrenadante se pasó a través de filtros con poros de 0.22 mm de diámetro (Sartorius, NG, Göttingen, Alemania).

Absorbancia del FC del hongo. A los FC del hongo obtenidos para ambas razas del patógeno, se les realizó el análisis de la absorbancia en la región UV del espectro. Para ello alícuotas de 1 mL del FC del hongo se diluyeron 1/25 en agua destilada estéril; y se midió la absorbancia desde 250 a 300 nm en un espectofotómetro UV-Vis (LKB-Pharmacia).

Actividad fitotóxica del FC del hongo. Se determinó mediante el bioensayo de punteadura según ^{Companioni et al. (2003}) en cada tiempo evaluado (1 hasta 30 días). Se colectaron hojas de mediana edad según la posición en la planta (hojas 3, 4, 5) del cultivar Gros Michel (grupo AAA, susceptible a raza 1); y Bluggoe (grupo ABB, susceptible a raza 2). Estas se lavaron durante 20 minutos con detergente comercial, se enjuagaron con agua destilada estéril; y se secaron con papel de filtro Whatman No. 1. Se realizaron punteaduras con una aguja estéril sobre el lado adaxial del limbo de la hoja con 3 cm de separación entre ellas. Después del daño, se agregaron 5 µL del FC del hongo colectado en cada tiempo evaluado. Las hojas se incubaron a 28±2 ^°C, 56 µmol.m^-2.s^-1 de intensidad luminosa, fotoperíodo de 12 horas luz/12 horas oscuridad y 70% de humedad relativa por 48 horas. Transcurridas las 48 horas se evaluó la actividad fitotóxica de los FC del hongo, a través de la expresión sintomatológica de necrosis formada alrededor del punto de aplicación del FC del hongo, expresada como área de la lesión elíptica (mm²).

El medio de cultivo Caldo Czapek, no inoculado con el hongo e incubado como se describió, se utilizó como tratamiento testigo para todos los experimentos evaluados en este trabajo. En este experimento, cada tratamiento incluyó tres hojas de plantas diferentes (18 heridas/hoja). Posteriormente, se determinó la respuesta de cultivares de Musa spp., a la aplicación de FC del hongo de la raza 1 y 2, evaluada por el bioensayo de punteadura en hojas de banano según ^{Companioni et al. (2003}). Se compararon quince cultivares de bananos con diferentes niveles de resistencia frente al patógeno in vivo según ^{Pérez et al. (2004}). El FC de la raza 1 de FOC se cosechó a los 15 días; y la raza 2 a los 29 días después de la inoculación en el medio de cultivo Caldo Czapek.

Sustentado en los valores de absorbancia (250-300 nm) de los FC del hongo obtenidos durante el crecimiento in vitro de la cepa de FOC raza 1, se aprecian tres momentos fundamentales de excreción de metabolitos al medio de cultivo, correspondientes a los 15-16, 21-23 y 29-30 días de cultivo respectivamente (Figura 1). El máximo de absorbancia se registró a los 15 días de cultivo con 0.340. Sin embargo, en los filtrados de cultivo de FOC raza 2 se detectaron los mayores valores de absorbancia a los 29 y 30 días de cultivo (0.755 y 0.724 respectivamente), que resultaron superiores a los alcanzados por FOC raza 1 a los 15 días de cultivo (Figura 2). Las especies del género Fusarium producen una amplia variedad de metabolitos secundarios (^{Sieber et al., 2014}). También es bien conocido que la expresión del metabolismo microbiano no está necesariamente asociada al máximo incremento de la masa del micelio sino a diferentes momentos en el crecimiento de los microorganismos; en dependencia de sus fuentes nutricionales y las condiciones de su cultivo in vitro (^{Etzerodt et al., 2016})

Las condiciones de cultivo para ambas cepas de FOC posibilitó la excreción al medio, de metabolitos extracelulares producidos por el patógeno en diferentes momentos de su crecimiento in vitro. Los cuales pudieran estar asociado con la patogenicidad y/o la virulencia de estas cepas patogénicas

Figura 1. Excreción al medio de cultivo de metabolitos durante el crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 1 GCV [01210[ en Caldo Czapek modificado. 

Cuando FOC raza 1 [GCV 01210] se cultivó en medio líquido, no se apreció un incremento rápido del crecimiento del microorganismo evaluado en masa fresca en los primeros 18 días. Este resultado puede ser asociado a una lenta adaptación de la cepa fúngica al medio de cultivo; y a otras condiciones establecidas para su crecimiento y desarrollo. A partir del día 18 el patógeno crece exponencialmente, y se registró un máximo de 12.2 g en su masa fresca a los 22 días posteriores a la inoculación (Figura 3A). Sin embargo, asociado con la excreción de metabolitos extracelulares por el patógeno, el efecto de los FC del hongo en las respuestas de los tejidos foliares de plantas susceptibles exhibió notorias diferencias en diversos tiempos de cultivo del hongo (Figura 3C). De modo general, aunque pueden apreciarse varios momentos con ligera actividad fitotóxica del FC, los mayores niveles se detectaron a los 15-16, 21-23 y 29-30 días de cultivo. Los mayores niveles de actividad fitotóxica se corresponden con los incrementos en la absorbancia del filtrado de cultivo y por ende la síntesis de metabolitos microbianos extracelulares. En sentido general, los FC obtenidos mostraron especificidad en su modo de acción. Los mayores niveles de fitotoxicidad evaluados como área de la lesión sobre el genotipo susceptible, se lograron cuando el FC que se cosechó a 15-16 días durante el crecimiento de FOC raza 1 en el medio de cultivo Caldo Czapek. Según ^{Brakhage (2013}), la producción de los metabolitos microbianos ocurre en diferentes fases de la curva de crecimiento de los microorganismos, estrechamente relacionada a una fase en particular para cada uno de ellos; pero muy influenciada por las condiciones de cultivo. Por otro lado, ^{Zhang et al. (2015}) demostraron que las fitotoxinas microbianas son productos metabólicos del patógeno, caracterizados como factores de patogenicidad y/o de virulencia. Basado en los resultados obtenidos en el presente trabajo, estos productos metabólicos son sintetizados por el patógeno en determinada fase de crecimiento. La curva de crecimiento del hongo raza 2 muestra incrementos de la masa fresca del microorganismo a partir de los nueve días de cultivo, alcanzando valores máximos a los 18 días posteriores a la inoculación en el medio de cultivo (16.1 g) (Figura 3B). Lo cual evidencia una mayor adaptación y asimilación de los componentes del medio de cultivo bajo las condiciones establecidas para su crecimiento in vitro en relación a la cepa de la raza 1 de FOC. Mientras que FOC raza 2 es capaz de producir moléculas fitotóxicas de forma continua a partir de los 10 días de su crecimiento bajo las mismas condiciones establecidas para ambas cepas (Figura 3D). Sin embargo, aunque la evaluación de la actividad fitotóxica muestra la excreción de metabolitos fitotóxicos al medio de cultivo de forma continua, pudiera existir un proceso de conversión de los compuestos inicialmente sintetizados a otros que aún conservan la mostrada actividad fitotóxica. En el cultivar Bluggoe (susceptible) se observan daños, medidos como área de la lesión, de forma continua con los FC de 11 a 30 días de cultivo del hongo. Pero, a los 29 días del cultivo del patógeno en medio líquido se apreció un mayor daño sobre los tejidos de las plantas susceptibles. Varios investigadores en múltiples interacciones planta-patógeno han descrito la obtención de filtrados de cultivo con actividad fitotóxica para su uso como agentes de selección precoz de resistencia. Además, se han desarrollado esquemas para el aislamiento y purificación de los metabolitos involucrados en la respuesta selectiva de las plantas (^{Ramírez et al., 2015}). La selección precoz de resistencia en plantas frente a diferentes ‘formae specialis’ de Fusarium oxysporum ha sido un objetivo primordial en el mejoramiento genético convencional y biotecnológico. Extractos crudos y metabolitos puros de cultivos de FOC se han usado en la selección de plantas resistentes (^{Companioni et al., 2003}; ^{Saraswathil et al., 2016}).

Figura 2. Excreción al medio de cultivo de metabolitos durante el crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 2 GCV [0124/125] en Caldo Czapek modificado. 

Figura 3 Actividad fitotóxica de filtrados de cultivo cosechados diariamente durante el crecimiento in vitro de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 1 y 2. Masa fresca del patógeno (A y B), y área de la lesión en cultivares de banano susceptibles a la enfermedad in vivo (C y D). 

Los cultivares que se mostraron más susceptibles al FC de la raza 1 fueron Manzano Criollo, Gros Michel, Pisang Lilin y Yangambi km 5, sin diferencias estadísticas entre ellos, seguido del cultivar Paka. Todos los cultivares FHIA evaluados (01, 02, 03, 04, 18 y 21) se mostraron resistentes a la acción fitotóxica del FC raza 1 GCV [01210], sin diferencias estadísticas en sus respectivas respuestas. También se mostraron resistentes los cultivares Burro Criollo, Pelipita, Pisang jari guaya y Bluggoe, con respuesta similar a la de los FHIA (Cuadro 1).

^{Pérez et al. (2004}) determinaron, entre otros estudios, la reacción de diferentes cultivares frente a las poblaciones de FOC de Cuba, y la frecuencia de plantas enfermas. Sus resultados muestran que la raza 1 afecta con mayor frecuencia los cultivares Gros Michel, Yangambi km 5, Paka y Manzano. Mientras que menores afectaciones mostraron Pisang Lilin, Pisang jari buaya, FHIA03 y FHIA-18. En los resultados descritos en este trabajo, el bioensayo del FC del hongo raza 1 en hojas del cultivar Pisang Lilin mostró una reacción de susceptibilidad, en contraposición a la respuesta de tolerancia determinada previamente en condiciones de campo por Pérez et al. (2004). Por su parte, el FC de 29 días de FOC raza 2 causó los mayores daños a los cultivares Burro Criollo, Pisang jari guaya, FHIA-03 y Bluggoe. Mientras que los cultivares Manzano Criollo, Gros Michel, Pelipita, Pisang Lilin, Paka y Yangambi Km 5, mostraron una respuesta de resistencia similar a los FHIA evaluados. El bioensayo del cultivar Pisang jari buaya reveló una respuesta de susceptibilidad, diferente a la tolerancia mostrada en las mencionadas evaluaciones de campo. En tal sentido, el problema que concierne las pruebas de resistencia en condiciones in vivo es la tarea de garantizar una distribución homogénea del inóculo del patógeno en todas las plantas a evaluar. Algunas plantas pueden haber recibido una cantidad excesiva del inóculo, mientras que las otras pueden no recibir suficiente inóculo para desarrollar la enfermedad (^{Mert y Karakaya, 2003}). Además, existe preocupación por el efecto del ambiente en las plantas inoculadas estudiadas en campo (^{Ribeiro et al., 2011}). Por otra parte, no siempre es posible caracterizar las poblaciones de FOC mediante pruebas de patogenicidad debido a las interacciones de la planta con el ambiente. Existen demostradas evidencias acerca de la respuesta diferencial de las plantas bajo condiciones ambientales diferentes para grupos diferenciales ya establecidos (^{Li et al., 2013}). Los FC de 15 y 29 días obtenidos a partir de las cepas FOC de las razas 1 y 2, lograron diferenciar más del 93% de los individuos con una respuesta conocida al patógeno in vivo. El 7% restante consistió en ambos casos de una respuesta intermedia a la enfermedad en condiciones naturales. Es importante señalar que para establecer un método de evaluación de la resistencia a las enfermedades es necesario que el mismo sea superior al tradicional en trabajo, espacio y tiempo aspectos que son tenidos en cuenta en este método ensayado para ambas razas del patógeno.

Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el método para la diferenciación de la susceptibilidad o resistencia al Mal de Panamá según ^{Companioni et al. (2003}) puede realizarse de forma rápida; y no destructiva con el uso de FC del hongo tratados en las hojas para diferentes poblaciones del patógeno, lo cual podría ser aplicable para los programas de mejoramiento genético de musáceas, tanto convencional como biotecnológicas. Por otro lado, constituyen los primeros resultados enfocados a la validación del método que rompe el esquema biológico natural del ciclo de la enfermedad. Además, propician las bases para futuros proyectos relacionados con la identificación de los metabolitos fitotóxicos, y de la especificidad de presuntos genes de avirulencia del patógeno. Lo cual permitirá determinar el papel de los metabolitos involucrados en la respuesta de Musa spp. al marchitamiento por Fusarium.