El jitomate (Solanum lycopersicum) se encuentra entre las hortalizas de mayor producción en el mundo. México ocupa el décimo lugar en producción y el estado de Sinaloa se ha consolidado como el primer productor de jitomate; representando aproximadamente la tercera parte de la producción nacional, situación que es reconocida a nivel internacional (^{SAGARPA, 2018}). Por lo que, actualmente el manejo de producción se ha centrado en el desarrollo seguro, ecológico, duradero y eficaz; debido a la importancia, muchos investigadores se han enfocado a conocer más respecto a los microorganismos que se encuentran presentes en el torrente del floema de las plantas (^{Ortiz-Galeana et al., 2018}). En la agricultura moderna, las bacterias promotoras de crecimiento vegetal tienen un gran potencial, actualmente el cultivo de la mayoría de las hortalizas requiere de la producción de plántulas vigorosas, factor importante para un buen desarrollo del fruto (^{Luna-Martínez et al., 2013}). El endofitismo es el fenómeno de asociación mutualista, de una planta con un microorganismo que vive dentro de los tejidos de esta sin causar ningún síntoma de enfermedad; además de ser un recurso biológico participando en diversas funciones indispensables relacionadas con el crecimiento, desarrollo, tolerancia y adaptación al estrés (^{Gundel et al., 2012}). Sin embargo, dependiendo de la disponibilidad de nutrientes y el estado metabólico de la planta huésped la respuesta de asociación a largo plazo de un endófito puede ser mutualista o antagonista (^{Eaton et al., 2011}).

Lo anterior, ha conducido al estudio de mecanismos indirectos por competencia de espacio y nutrientes (consumo de lixiviados-exudados, producción de sideróforos, inducción a la respuesta sistémica en plantas mediante la producción de fitohormonas y patrones moleculares) (^{Chowdhury et al., 2015}). Diversos trabajos han demostrado que las bacterias endófitas son capaces de interactuar de una manera muy eficiente con sus hospederos, tales como promoción del crecimiento y protección vegetal contra la infección de fitopatógenos. ^{Nawangsih et al. (2011}), aislaron bacterias endofíticas utilizando tallos de plantas de jitomate asintomáticas reportando seis cepas con efecto antagonista sobre la marchitez bacteriana (Ralstonia solanacearum) del jitomate; proponiendo un método de control alternativo para apoyar la agricultura sostenible de esta hortaliza. En la actualidad el interés en la protección al medio ambiente, la implementación de una agricultura sustentable y las diferentes regulaciones internacionales para importar/exportar productos sin agroquímicos demandan mejorar la eficiencia a través del estudio y explotación de los efectos benéficos que puede ejercer la microbiota endófita, por lo que se considera que aquellos microorganismos que establecen una interacción positiva con las plantas desempeñan un papel importante en los sistemas agrícolas (^{Sánchez-Bautista et al., 2017}). Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue identificar las bacterias endófitas aisladas de plantas de jitomate, y caracterizarlas en función de propiedades promotoras del crecimiento vegetal.

Para la realización del estudio se recolectaron plantas de jitomate de la variedad Missouri durante la temporada de siembra 2017-2018 en parcelas del campo agrícola del Ejido Gabriel Leyva Solano localizado en el Municipio de Guasave del estado de Sinaloa, México (25° 39’ 50 latitud norte y 108° 38’ 18 longitud oeste). Las plantas asintomáticas se eligieron al azar de la superficie sembrada y se trasladaron al laboratorio para su análisis. Por otra parte, basado en la hipótesis de que existe diversidad de endófitos en semillas (^{Surette et al., 2003}) se realizó el establecimiento de plantas de jitomate bajo condiciones in vitro. Para ello se utilizaron semillas de dos variedades de jitomate saladette (THB y SUN6366) proporcionadas por una casa comercial. Las semillas se colocaron en papel filtro humedecido con agua estéril y fueron precultivadas tres días bajo condiciones de iluminación natural a 25 °C. Posteriormente se establecieron en medio de sales ^{Murashige y Skoog}, sin reguladores de crecimiento y fueron transferidas a una cámara de crecimiento bajo condiciones controladas (22 °C, fotoperiodo de 16 h día^-1 y flujo fotosintético de 225 μmol m^-2 s^-1).

En el caso de los tejidos de raíz, tallo y hojas de plantas recolectadas en campo se lavaron con agua destilada estéril. Para las raíces se retiraron cuidadosamente las partículas adheridas de suelo. Posteriormente, se esterilizaron superficialmente, sumergiendo en etanol al 70% durante 30 segundos, pasado el tiempo se lavaron con solución de hipoclorito de sodio (2.5%) durante 5 min, y etanol al 70% durante 30 s, finalmente se lavaron de cinco a 10 veces con agua destilada estéril. Consecutivamente, el tejido vegetal (foliar, tallo y raíz) se maceró de manera individual en 20 mL de agua estéril tomando 50 µL de una dilución de 10^-4 para cada tejido, las cuales fueron establecidas en agar nutritivo por triplicado; para el caso de las plantas obtenidas de las semillas establecidas in vitro se maceró la planta completa y se sembraron en agar nutritivo para obtener y aislar las bacterias.

Las cajas Petri se incubaron durante ocho días a 27 °C (^{Yang et al., 2011}). Se realizaron continuas rondas de purificación en medio agar nutritivo de las colonias bacterianas, obteniendo cepas con características morfológicas similares para realizar el análisis de morfología colonial, el cual se llevó a cabo en un estereoscopio de cada uno de los aislados de 48 h de crecimiento; en donde las variables consideradas fueron: tamaño, color, forma, bordes, elevación, superficie, aspecto, luz transmitida, consistencia y luz reflejada. Posteriormente, se realizaron conteos de las unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de peso fresco para cada tejido; la técnica de tinción de Gram se realizó siguiendo el protocolo del kit comercial (Golden Bell).

Para la identificación molecular se partió del ADN genómico de siete cepas bacterianas donde se utilizaron los oligonucleótidos F2C (5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’) y C (5’-ACGGGCGGTGTGTAC-3’) (^{Shi et al., 1997}), para amplificar el gen que codifica la subunidad 16S del ADNr. El producto se purificó con el kit Wizard^® SV Gel y PCR Clean-Up System y se envió a secuenciar en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO) en CINVESTAV-IPN; la homología de las secuencias obtenidas se comparó dentro de la base de datos del GenBank, utilizando el programa Blast del NCBI y RDP. El análisis filogenético del gen 16S del ADNr, se realizó con el software MEGA 5 Beta (^{Tamura et al., 2011}). La solidez de la topología de NJ se evaluó mediante la prueba de bootstrap, usando 1000 réplicas. Los árboles filogenéticos se construyeron con el método de Neighbor-Joining (NJ) (^{Saitou y Nei, 1987}) y el modelo de sustitución de Tamura-Nei. Con la finalidad de identificar potenciales microorganismos promotores de crecimiento vegetal, se compararon de manera cualitativa las capacidades de cada uno de aislados bacterianos utilizando como control positivo la cepa (B25) Bacillus cereus (^{Figueroa-López et al., 2016}); y cada uno de los experimentos se realizó por triplicado. Para el análisis de producción de sideróforos se utilizó medio agar de cromo azurol S (CAS), preparado de acuerdo a la metodología descrita por ^{Schwyn y Neilands (1987}). La producción de quitinasas se evaluó, con quitina como única fuente de carbono de acuerdo con la metodología de ^{Shanmugaiah et al. (2008}). La evaluación de capacidad de solubilización de fosfato, se realizó en placas de agar-^{Pikosvkaya, se incubaron a 25 °C durante una semana (Pikosvkaya, 1948}).

A las diez semanas se obtuvieron 50 plantas de jitomate establecidas in vitro, con un crecimiento aproximado de 5 cm. Por otra parte, se recolectaron en campo 20 plantas de jitomate en fase de crecimiento vegetativo y asintomático. Se obtuvieron un total de 25 aislados de bacterias: 10 de in vitro y 15 de campo (9 raíz, 4 tallo y 2 tejido foliar); obteniendo siete aislados axénicos (Gram negativo); uno de in vitro y seis de campo (4 raíz y 2 tejido foliar) (Cuadro 2); con los cuales se realizaron conteos de unidades formadoras de colonia por gramo de peso fresco (log₁₀ UFC g^-1) (Cuadro1). Los resultados coinciden con lo propuesto por ^{Sørensen y Sessitsch, (2007}); donde señalan que la rizosfera es una fuente de adquisición de endófitos para las plantas permitiendo que las bacterias rizosféricas penetren los tejidos internos de las plantas por grietas de las raíces y heridas de tejidos que ocurren como resultado del crecimiento de la planta.

Por otra parte, se ha reportado que existe una mayor diversidad de filotipos en la rizosfera de plantas de tomate de cáscara (Physalis ixocarpa), que la diversidad de endófitos bacterianos (^{Márquez-Santacruz et al., 2010}). La morfología colonial de los aislados presentó pocas diferencias entre sí a las 48 h de crecimiento, caracterizadas por tener color blanco o crema, solo una mostró pigmentos de color rojo brillante, forma circular, borde ondulado, con superficie brillosa. La comparación de las secuencias obtenidas del gen 16S ADNr de los siete aislados endófitos contra la base de datos del NCBI, indicó estrechas relaciones con las especies bacterianas identificadas en el GenBank, con identidades mayores al 97% representando a: Methylobacterium radiotolerans (NR074244.1), Shinella sp. (KF261566.1), Burkholderia cepacia (AB162427.1), Sphingobium herbicidovorans (NR113843.1), Pseudomonas sp. (KR067597.1), Achromobacter xylosoxidans (KR136349.1) y Rhizobium radiobacter (KF975413.1).

Los datos generados por la base de datos permitieron dar a conocer de manera tentativa a los organismos; sin embargo, es necesaria una caracterización molecular más exhaustiva para asignar a que especie pertenecen. La Figura 1 ilustra las relaciones filogenéticas de los aislados presentando siete clusters (I a VII); en donde la inclusión de secuencias de referencia permitió corroborar la identidad de estas mostrando un agrupamiento con las caracterizadas y publicadas en otros trabajos. ^{Turner et al. (2013}) proponen que la interacción planta-microorganismo es diversa; sin embargo, aquellas relacionadas con la promoción del crecimiento vegetal son importantes para el uso agro-biotecnológico (entre otras muchas aplicaciones).

En este trabajo, se destacan los géneros Pseudomonas y Burkholderia; dichos géneros han sido ampliamente estudiados por la producción y emisión de su diversa gama de productos metabólicos secundarios incluyendo antibióticos y compuestos orgánicos volátiles antifúngicos (^{Hernández-León et al., 2015}). Otros reportes, muestran que los géneros Pseudomonas y Burkholderia, son miembros dominantes en la microbiota rizosférica con habilidad para la utilización de sustratos carbonados, lo que apoya la teoría de que estas bacterias son estimuladas por la presencia y composición de distintos exudados radiculares (^{Marrero et al., 2015}; ^{Kumar et al., 2016}). En este estudio las cepas de Pseudomonas y Burkholderia, se aislaron en raíces de plantas de jitomate recolectadas en campo, lo cual es consistente en otros estudios. ^{Madhaiyan et al. (2007}), demostraron que la bacteria Burkholderia sp. reduce la acumulación de cadmio y plomo en raíces y brotes en plántulas de tomate como también del metal que está disponible en el suelo debido a la absorción y bioacumulación por parte de la bacteria. Un paso importante es el uso de tres formulaciones comerciales de Pseudomonas registradas en la Agencia de Protección Ambiental de EE. U.U, para la supresión de enfermedades de las plantas, respectivamente. Estos productos se aplican en empacadoras para prevenir enfermedades fúngicas durante el almacenamiento de cítricos, frutas de hueso y papa (^{Stockwell et al., 2006}).

Figura 1. Relaciones filogenéticas de siete bacterias endófitas (marcadas línea roja) aisladas de tejido (raíz, tallo follaje) de jitomate colectadas en campo y bajo condiciones in vitro (Semilla). Aislamientos comparados con secuencias GenBank. 

El grupo de bacterias llamadas rizobacterias promotoras del crecimiento en plantas (PGPR) incluye el género Rhizobium. Las investigaciones se han orientado su estudio como promotor del crecimiento de plantas leguminosas y no leguminosas (^{Piñerúa et al., 2013}). Por otra parte, estudios realizados por ^{Santillana et al. (2005}), reportaron que cepas de Rhizobium, estimulan la germinación de semillas de jitomate y promueven su crecimiento. En la actualidad, la agricultura sustentable plantea mejorar la eficiencia de la fijación del nitrógeno mediante el uso de plantas leguminosas y rizobios competitivos, capaces de ser usados en biorremediación y fitorremediación y de esta manera extender las ventajas de la simbiosis a otros cultivos (^{Piñerúa et al., 2013}). En este estudio la cepa de Methylobacterium fue aislada de tejido vegetal de plántulas de jitomate establecidas bajo condiciones in vitro sin reguladores de crecimiento, no hay reportes de dicho género bajo condiciones in vitro en plantas de jitomate. Diversos estudios han reportado que presentan la capacidad de producir fitohormonas que estimulan el crecimiento vegetal, favoreciendo la fijación de nitrógeno y protegiendo a la planta contra patógenos (^{Pérez-Montaño et al., 2014}). Otro grupo de bacterias importantes aisladas del tejido de plantas de jitomate lo conforman S. herbicidovorans y A. xylosoxidans.

Actualmente, existen pocos trabajos reportados en relación a S. herbicidovorans, el cual es ampliamente utilizado contra las malas hierbas de hoja ancha en la agricultura, pastos, césped e industrias (^{Müller et al., 2004}). Estudios enfocados a la evaluación de la actividad antifúngica de A. xylosoxidans contra aislados de F. oxysporum y F. solani, reportaron efectos positivos reduciendo hasta en un 80% el crecimiento del micelio del patógeno en comparación con el control, sugiriendo un uso potencial como agente de biocontrol (^{Dhaouadi et al., 2018}). Se ha reportado la inoculación de A. xylosoxidans F3B en Arabidopsis thaliana estimulando un aumento significativo en la longitud de la raíz y peso fresco, considerando dicha bacteria como endófita (^{Ying-Ning et al., 2009}).

En la evaluación de actividades relacionadas con la promoción del crecimiento vegetal se observó que las cepas Pseudomonas, Burkholderia y Rhizobium presentaron alta capacidad fosfatosolubilizadora, frente al control (B25) Bacillus cereus (Cuadro 2). En la producción de sideróforos el aislado con mayor producción ante el control fue Pseudomonas sp. (Cuadro 2). Esta característica asocia a las rizobacterias, con el aumento del hierro disponible en el suelo permitiendo su absorción por la planta para constituir un mecanismo de promoción de crecimiento (^{Gouda et al., 2018}). Aunque no es frecuente encontrar evaluaciones cuantitativas de la síntesis de sideróforos por el género de Pseudomonas, se ha reportado la producción de varios sideróforos, con una gran afinidad por el Mo, V, Cu y Zn (^{Harrington et al., 2012}). Por otra parte, las bacterias endófitas pueden ser usadas como agentes de biocontrol mediante la producción de enzimas como hidrolasas y quitinasas consideradas como enzimas de defensa de las plantas contra la infección de patógenos (^{Perez et al., 2013}). En este trabajo la cepa con mayor actividad quitinasa fue Burkholderia cepacia (Cuadro 2).

Las especies bacterianas endófitas asociadas al cultivo de jitomate fueron: Methylobacterium radiotolerans (in vitro), Shinella sp. y Achromobacter xylosoxidans (tejido foliar), Burkholderia cepacia, Pseudomonas sp., Sphingobium herbicidovorans y Rhizobium radiobacter (raíz). En general, bajo las condiciones evaluadas en la presente investigación se observó que aproximadamente el 86% de las cepas aisladas tienen capacidad de producir sustancias promotoras de desarrollo vegetal, de acuerdo con lo anterior estos resultados muestran el posible papel benéfico de los endófitos bacterianos en plantas de jitomate. Lo que sienta las bases para futuros estudios de campo para determinar el efecto de estas cepas sobre la producción y calidad de frutos de tomate.