Una de las principales limitantes de la producción de los agroecosistemas con papayo (Carica papaya) es la enfermedad ocasionada por el virus de la mancha anular del papayo (PRSV-P) (^{Rivas-Valencia et al., 2008}). Este virus pertenece al género Potyvirus y se transmite de manera no persistente por diferentes especies de áfidos, presentes en plantas arvenses en áreas cercanas o dentro de la parcela. La enfermedad se manifiesta con clorosis en las hojas jóvenes, moteado amarillo y verde, aclaramiento de las nervaduras, manchas aceitosas en los peciolos, tallo y frutos; más avanzada la enfermedad, se observa la deformación y reducción del área foliar (^{Chalak et al., 2017}). Estos síntomas acompañan una disminución en la calidad de la hoja y puede ocasionar pérdidas del 30 al 100% de la producción (^{Hernández-Castro et al., 2015}). El control químico dirigido a la eliminación de vectores, es ineficiente; el control cultural busca identificar y eliminar plantas recientemente infectadas, que actúan como fuente de inóculo; medidas que están dirigidas a retrasar la incidencia viral y disminuir parcialmente el daño al cultivo (Hernández-Castro et al., 2010). En México, la variabilidad genética del PRSV-P puede ser tan amplia como la diversidad de los nichos ecológicos en donde se cultiva papayo (^{Ordáz-Pérez et al., 2017}). Esta variabilidad puede ocasionar que algunas cepas tengan distintos síntomas (^{Spetz et al., 2003}). ^{Cabrera-Mederos et al. (2008}) afirman que los síntomas dependen del aislado viral. Por su parte, ^{González et al. (2003}) lograron distinguir diferencias en la sintomatología producida por cepas atenuadas y severas de PRSV-P al inocularlas mecánicamente en distintas especies de hospederos. ^{Noa-Carrazana et al. (2006}) reportaron al menos tres aislados diferentes del virus, provenientes de los municipios de Tierra Blanca, Cotaxtla, La Antigua, Paso de Ovejas, todos de la zona central de Veracruz, que conforman la principal zona productora de esta fruta. Por lo tanto, se planteó como objetivo caracterizar la diversidad de síntomas mediante gráficos radiales y analizar la evidencia patogénica como soporte de la variabilidad poblacional de PRSV-P presente en plantaciones comerciales de papayo var. Maradol roja en la zona Centro del estado de Veracruz.

Se colectó tejido foliar de plantas de papayo var. Maradol roja de ocho a quince meses de edad en parcelas comerciales en los municipios de La Antigua, Cotaxtla, Tlalixcoyan y Tierra Blanca, Veracruz, México. Las plantas mostraban los siguientes síntomas característicos de PRSV-P: aclaramiento de nervaduras principales y ramificadas, mosaico liso, parches verdes, islas verdes, estrías, clorosis general y sectorial, arrepollamiento, epinastia y filiformidad. Se inspeccionaron cinco parcelas de cada municipio, donde se observaron ≈200 plantas enfermas por parcela, lo cual permitió distinguir las diferencias o similitudes en síntomas presentes en campo. Se colectaron dos hojas por planta enferma, que mostraban severidad diferencial de la enfermedad; se mantuvieron en bolsas herméticas en una hielera con geles refrigerantes, para su uso posterior en transmisión mecánica. En laboratorio, se conformaron seis grupos de hojas con síntomas y severidad diferencial. Por cada grupo de síntomas similares se tomó la hoja más representativa para la transmisión mecánica en 10 plantas de papayo sanas de tres meses de edad. Para ello, se sembraron semillas de papayo var. Maradol Roja (Semillas del Caribe^®). Las charolas para almácigo se lavaron y desinfestaron (NaClO 5%), y se llenaron con el sustrato Cosmo Peat^®. Las plántulas se trasplantaron a bolsa negra para vivero (40 x 40 cm, calibre 600), en una mezcla 1:1 de sustrato Cosmo Peat^® y suelo rico en materia orgánica; se llevaron a un invernadero con malla antiáfidos del Campus Veracruz, Colegio de Postgraduados. Se aplicó imidacloprid en drench a las plantas para prevenir que cualquier áfido pudiera enfermar a las plantas, y abamectina para prevenir la presencia de ácaros; las aplicaciones se realizaron cada siete días.

Para la inoculación se maceraron 2 g de hoja infectada y se le agregaron 10 mL de una solución tampón fosfato de potasio 0.01 M pH 7. En las tres primeras hojas completamente expandidas del ápice de la planta sana, se causó una lesión con carborundum; inmediatamente se aplicó la solución tampón con las partículas virales, con la ayuda de un hisopo (^{Valderrama et al., 2015}). En total se inocularon 60 plantas, 10 plantas por grupo de síntomas, además, se separaron 10 plantas sanas como testigo. Se consideró como colecta al virus inoculado en 10 plantas, lo cual se corroboró mediante análisis molecular. En el Cuadro 1 se propone una nomenclatura que describe cada síntoma foliar producido por el PRSV-P en las plantas inoculadas. Para observar si los síntomas caracterizados al momento de la colecta en campo se replicaban en el invernadero, éstos se ordenaron de acuerdo a una escala de severidad del daño (Cuadro 2) (^{Flores-Bautista et al., 2018}). Se elaboraron gráficos radiales con el programa Sigma Plot^® para facilitar la caracterización del sistema de síntomas y relacionarlo con cada colecta. Con los gráficos se pueden observar y comparar los valores relativos entre colectas, respecto a un punto central inicial, el cual indica una hoja sin presencia de síntomas.

Para la identificación molecular, se realizó la prueba RT-PCR a las plantas inoculadas en invernadero para identificar la presencia de PRSV-P. Se utilizó un termociclador Multigene Labnet^® con el producto de Promega RT-PCR System^®. El ARN del virus se obtuvo con el kit de extracción Zymo Research^®, según las indicaciones del fabricante. Para amplificar el gen de la proteína de la cápside (CP), se utilizaron los primers descritos por ^{Noa-Carrazana et al. (2006}): 3F (5´GACCATGGTCCTAGAATGAAGCTGTGGATG 3´) y 11R (3´TTTTTTTTCTCTCATTCTAAGAGGCTC 5’). Se utilizó un programa de un ciclo de 45 min a 45 °C, un ciclo de 2 min a 94 °C, 40 ciclos de 30 s a 94 °C, 1 min a 60 °C y 2 min a 68 °C; y un ciclo de extensión final de 7 min a 68 °C. Los productos obtenidos se visualizaron por electroforesis en un gel de agarosa 1%. Los fragmentos de interés se purificaron con el kit de Zymo Research^®; se secuenciaron con el equipo AB 3130^® mediante la técnica de Sanger y tecnología capilar en el Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C., México. Las secuencias se compararon con otras de aislamientos mexicanos en el GenBank^® (DQ008449.1, DQ008448.1 y DQ00847.1), con 92 a 98% de identidad, lo que corroboró la identidad del virus.

La presencia de PRSV-P se confirmó mediante la observación de amplicones positivos de 1071 pares de bases, correspondiente a la región de la cápside viral (CP) (Figura 1). Los primeros síntomas aparecieron a los 40 días posteriores a la inoculación (dpi) mecánica; se observaron cambios en la sintomatología, así como el incremento en la severidad de algunos síntomas hasta los 60 dpi. ^{Chávez-Calvillo et al. (2016}) también observaron el mayor daño de PRSV-P a los 60 dpi, con mayor deformación de la hoja, aclaramiento de nervaduras y mosaico severo. ^{Singh et al. (2017}) mencionan que el PRSV-P produjo síntomas sistémicos de mosaico y deformación de las hojas en C. papaya y otros hospederos. Las escalas de severidad de diversos autores catalogan a los síntomas de manera genérica, mientras que en este trabajo se presenta una caracterización detallada de cada síntoma foliar del PRSV-P observado (Figura 2). Algunos síntomas producidos por el PRSV-P coinciden con los registrados por ^{Hernández-Castro et al. (2010}), como clorosis, mosaico y reducción de lámina foliar; en contraste, la caracterización propuesta en este trabajo presenta dos tipos de clorosis y cuatro síntomas asociados a mosaico.

Figura 1 Amplicones positivos a la proteína de la cápside de PRSV-P analizados por RT-PCR. Electroforesis en gel de agarosa al 1X en tampón TAE. (1 kb): marcador de peso molecular; (+): control positivo; (-): control negativo; (C4Ant14, C5TB1, C6Tla3, C1Cot4, C2Ant5): Colectas del virus con sistema de síntomas diferenciado (Cuadro 1). 

Figura 2 Caracterización de síntomas foliares del PRSV-P inoculado mecánicamente en plantas de papayo var. Maradol Roja de tres meses de edad, en invernadero, de diciembre 2018 a mayo 2019. Campus Veracruz, Colegio de Postgraduados. A) Aclaramiento nervaduras principales; B) aclaramiento nervaduras ramificadas; C) mosaico liso; D) parches verdes; E) islas verdes; F) estrías; G) clorosis general; H) clorosis sectorial; I) arrepollamiento; J) epinastia; K) filiformidad; L) hoja sana. 

^{Rodríguez et al. (2014}) observaron síntomas de aclaramiento de nervaduras, mosaico, ampollas y deformación de la hoja a 45 dpi; adicionalmente, en el presente estudio se caracterizaron al mosaico liso, a las islas verdes, a tres tipos de deformación foliar y dos tipos de aclaramiento de nervaduras (Figura 2). Además, se observó una diferenciación en la sintomatología de cada una de las plantas inoculadas en invernadero respecto a campo (Cuadro 3). La representación de los síntomas en gráficos radiales (Figuras 3 y 4) permitió caracterizar las colectas de forma diferencial, y observar los distintos grados de severidad de cada uno de los síntomas. La Figura 3 muestra los síntomas presentados en otoño-invierno, diferenciándose las colectas C4Ant14 (36% de severidad en aclaramiento de nervaduras principales y ramificadas) y C5TB1 (36% de severidad en aclaramiento de nervaduras principales), concentrándose la longitud de las curvas en la parte superior derecha, en donde se encuentran los síntomas moderados, que manifiestan menor daño a la planta.

Figura 3. Diagramas radiales de severidad de síntomas foliares producidos por seis colectas del PRSV-P en C. papaya en el ciclo otoño-invierno 2018, 55 días posteriores a la inoculación mecánica. 

Figura 4. Diagramas radiales de severidad de síntomas foliares producidos por seis colectas del PRSV-P en C. papaya en el ciclo primavera-verano 2019, 195 días posteriores a la inoculación mecánica. 

Las colectas C1Cot4, C2Ant5, C3Ant1 y C6Tla3 muestran curvas con una tendencia hacia la parte superior izquierda del gráfico, zona donde se grafican los síntomas que tipifican la deformación del área foliar; además, en estas colectas también se observó la asociación de síntomas. Tal y como lo sugieren ^{Rodríguez et al. (2014}), se observó una relación entre la severidad de síntomas y la temperatura, los cuales fueron menos severos a temperaturas superiores a 35 °C. En la temporada primavera-verano 2019 (Figura 4) se lograron observar “estrías” en las colectas C1Cot4 y C5TB1, síntoma que no se presentó en la época de temperaturas frescas (23 °C, otoño-invierno).

Es posible que la disminución en la severidad y la atenuación de síntomas en las seis colectas estuvo asociada a temperaturas mayores de 35 °C, tal y como lo mencionan ^{Ordáz-Pérez et al. (2017}). La colecta C5TB1 presentó mayor severidad en los primeros 60 dpi de esta temporada, con síntomas de filiformidad y epinastia, los cuales causan mayor daño en la planta. ^{Cabrera-Mederos et al. (2010}) observaron algo similar, con un mosaico del PRSV-P más ligero y ausencia de filiformidad cuando se sometieron a las plantas infectadas a 38 °C en invernadero; posteriormente, al reducir la temperatura a 20 °C bajo condiciones controladas, los síntomas se tornaron nuevamente severos. ^{Bau et al. (2004}) observaron variación en la expresión de síntomas de PRSV-P, de acuerdo a la temporada del año, con un incremento en la época fría (19 °C) y de lluvias (26 °C). En general, el desarrollo de enfermedades virales está asociado a temperatura entre 16 y 30 °C (Cabrera-Mederos et al., 2010); temperaturas superiores provocan una baja concentración viral, lo que resulta en atenuación de síntomas y la aparente recuperación de la planta a la enfermedad.

Las seis colectas de PRSV-P se pudieron separar por sintomatología foliar mediante la caracterización de síntomas propuesta en este trabajo y el uso de gráficos radiales. La mayor severidad de síntomas se presentó en la época de menor temperatura ambiental, respecto a la época de primavera-verano. Las diferencias encontradas entre las distintas colectas podría ser un indicador de la variabilidad genética del virus. Por ello, es necesario realizar estudios con plantas indicadoras para determinar si la sintomatología producida por colecta se replica en diferentes hospederos. Además, con estudios moleculares en regiones que participen en el desarrollo de sintomatología y severidad, como cápside viral (CP) y componente auxiliar (HC-Pro), se podría observar si existe diferencia en los nucleótidos, lo cual pueden producir diferencias en la expresión de síntomas y en la severidad del virus. En conjunto, ensayos biológicos y moleculares podrían determinar diferentes aislados virales, tales como aislados atenuados y severos.