La cadena agroindustrial de maní (Arachis hypogaea) en Argentina se ubica fundamentalmente en la provincia de Córdoba y actúa como disparador del desarrollo local. Actualmente, en el sistema de producción de maní, se observa una alta presión de enfermedades fúngicas transportadas por la semilla, como el carbón del maní cuyo agente causal es Thecaphora frezzi y Tizón del maní ocasionada por Sclerotinia minor (^{INTA, 2018}; ^{Rosso et al., 2018}). Esto adquiere una implicancia relevante en la planificación del sistema productivo a largo plazo y con importantes efectos a nivel regional. Si bien, la aplicación de fungicidas sintéticos es la principal herramienta para el control de este tipo de enfermedades, es ineficiente y su uso tiene consecuencias controvertidas sobre el ambiente, la salud humana y el equilibrio en la microbiota edáfica (^{Andrés et al., 2016}). Para atender a estas limitantes surge como alternativa el biocontrol en el marco de un manejo sustentable de los cultivos, con la finalidad de mejorar la productividad a través del incremento en la disponibilidad de nutrientes y la protección a fitopatógenos (^{Sherathia et al., 2016}). Los productos empleados en el control biológico, son preparaciones de células vivas o latentes de microorganismos que aplicados al suelo o a la semilla, favorecen la relación planta-rizósfera (^{Bashan et al., 2013}). Existen hasta el momento, estudios realizados in vitro en maní acerca del beneficio al aplicar microorganismos (^{Ankati et al., 2018}; ^{Ganuza et al. 2017}). De acuerdo a lo propuesto por Bashan et al. (2013) los biológicos aplicados pueden influenciar en forma directa o indirecta sobre el crecimiento vegetal al ejercer control sobre los fitopatógenos y además producir efectos promotores del crecimiento vegetal. Bacillus es un género bacteriano de amplia distribución en los agro-sistemas (suelo, agua y planta) debido a su habilidad para formar endosporas y su capacidad para producir metabolitos antimicrobianos y antifúngicos (fenazinas, 2,4-diacetilfloroglucinol, lipopéptidos cíclicos) (^{Tejera-Hernández et al., 2011}, ^{Villarreal-Delgado et al., 2017}). Bacillus activa mecanismos de protección en plantas, los cuales incluyen cambios estructurales en la pared celular por acumulación de lignina (^{Singh et al., 2016}) y la producción de flavonoides, fitoalexinas y auxinas (^{Pretali et al., 2016}). En los ensayos realizados por ^{Shifa et al. (2016}), la aplicación de B. subtilis a semillas de maní y al suelo, redujeron significativamente la población de A. flavus; mientras que en los granos disminuyó la infección y el contenido de aflatoxina, evidenciando el efecto de B. subtilis como agente de control biológico de hongos potenciales generadores de aflatoxinas en maní. Trichoderma, es un hongo de amplia distribución, de gran adaptabilidad, fácil reproducción y capacidad antagónica (^{Sharma y Gothalwal, 2017}). En particular en maní, la inoculación con Trichoderma indujo el crecimiento vegetal, de acuerdo a los propuesto por Rojo et al. (2017). Se propone como objetivo de este trabajo evaluar el efecto de biocontrol sobre Aspergillus flavus, Fusarium sp., Sclerotinia minor y Thecaphora frezzi y la promoción de crecimiento en maní al inocular Trichoderma harzianum y Bacillus subtilis en condiciones controladas y campo.

Los biológicos utilizados T. harzianum y B. subtilis fueron aislados de lotes de producción de maní de Córdoba e identificados como las cepas CT306 y CT104 respectivamente, y pertenecen a la colección del Centro de Transferencia de Calidad Agroalimentaria, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba (FCA UNC). El efecto antagonista de cada microorganismo fue evaluado in vitro en estudios previos. Se utilizaron semillas de maní Var. Granoleico cosecha 2016/17, provista por la empresa Aceitera General Deheza S.A., General. Deheza, Córdoba, Argentina. En el ensayo en condiciones controladas se evaluó la eficiencia de control de los biológicos en estudio sobre los siguientes patógenos asociados a semillas: A. flavus, Fusarium sp., S. minor y T. frezzi. Estos hongos se obtuvieron del cepario del Laboratorio de Fitopatología, FCA UNC, Argentina. Para la inoculación de las semillas de maní previamente desinfectadas (hipoclorito de sodio 0.3% (v/v) durante 10 minutos y enjuague posterior con agua destilada estéril) con cada fitopatógeno, se lavó superficialmente la placa de cultivo puro con solución salina estéril al 0.9%. La concentración de la suspensión de esporas para A. flavus y Fusarium sp. fue de 1x10⁶ conidios mL^-1 y de 1x10⁵ esclerocios mL^-1 de S. minor. En el caso de T. frezzi la inoculación de semillas se realizó recubriéndolas con una suspensión de teliósporas (1 g/25 mL de solución salina estéril). Posteriormente se procedió a la infestación de 100 semillas por peleteo con cada hongo en estudio. El inóculo de T. harzianum se obtuvo en medio de cultivo de extracto de malta durante 7 días a 28 °C con ciclos de 12 h de luz. Mientras que el de B. subtilis fue preparado en medio agar papa dextrosa en agitador rotativo durante 48 h a 25 °C.

El biocontrol de cada patógeno con los microorganismos se llevó a cabo por separado, para lo cual se prepararon macetas de 30 cm de diámetro con sustrato compuesto por tierra: arena (3:1) previamente esterilizado mediante autoclavavado (1 hora; 1 atm.). Las macetas se mantuvieron en cámara a 25 ºC y fotoperiodo de 12 h de luz. Los tratamientos evaluados fueron: a) Testigo (semilla infectada con patógeno en sustrato estéril); b) inoculación con T. harzianum (semilla infectada con patógeno en sustrato inoculado con T. harzianum 1x10⁸ conidios mL^-1; 1 L m³ de sustrato); c) inoculación con B. subtilis (semilla infectada con patógeno y a las 24 h inoculada con B. subtilis 2.5x10¹⁰ UFC en dosis de 100 mL/100 kg de semillas, en sustrato estéril) y d) inoculación combinada con T. harzianum y B. subtilis (semilla infectada con patógeno y a las 24 h inoculada con B. subtilis y T. harzianum en las mismas dosis y concentración de los tratamientos anteriores). El ensayo se condujo en un diseño completamente al azar. Cada unidad experimental estuvo constituida por cuatro macetas por duplicados para cada tratamiento evaluado. El ensayo se repitió completo dos veces. Desde la siembra y hasta los 60 DDS (días después de la siembra) se evaluaron los signos y síntomas de cada enfermedad por observación visual, lupa estereoscópica y microscopio óptico, de acuerdo a la descripción presentada en el Cuadro 1. En función del porcentaje de plantas con signos y síntomas de la enfermedad se establecieron las siguientes categorías de incidencia: nivel bajo= 10% de las plantas; nivel medio= 25% de las plantas, nivel alto= 50% de las plantas y ausencia= 0% de las plantas. En todos los casos donde se detectó enfermedad se realizó un aislamiento e identificación morfológica para la confirmación del patógeno.

En el campo, la siembra se realizó en el Módulo Maní del Campo Escuela de la FCA UNC (31° 28 49.42” S y 64° 00 36.04” O) Córdoba, Argentina. Los tratamientos evaluados fueron: a) Testigo (semilla sin tratamiento); b) Fungicida (Pretratado con Metalaxil-M 1.0 g/Fludioxonil 2.5 g; 750 cc/100 kg semilla); c) Fungicida + T. harzianum (Pretratado con fungicida + Preinoculación con T. harzianum 1 x 10⁸ conidios viables mL^-1; 200 mL/100 kg semilla + adherente); d) Fungicida + B. subtilis (Pretratado con fungicida + Preinoculación con B. subtilis (2.5 x 10¹⁰ UFC/L; 100 mL/100 kg semilla); e) Fungicida + T. harzianum + B. subtilis (Pretratado con fungicida + Preinoculación con T. harzianum y B. subtilis en las mismas dosis y concentración de los tratamientos anteriores). Se sembraron cuatro surcos de 100 m de longitud para cada tratamiento distanciados entre ellos 70 cm, con una distribución de 14 semillas por metro lineal. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones para cada tratamiento. Los datos fueron relevados de acuerdo a un muestreo aleatorio sobre los dos surcos centrales de todas las plantas en 1 m². Las variables evaluadas fueron: porcentaje de plantas emergidas a los 28 DDS, crecimiento de plantas medido como peso seco (PS) a los 30 y 165 DDS (^{Pérez y Arguello, 1995}). Al final del ciclo (165 DDS) se procedió a la cosecha manual de cada repetición en cada tratamiento para poder determinar: grado de madurez de acuerdo al método de raspado de vaina (^{Pérez et al., 2004}), porcentaje de infección de vainas con T. frezzi (^{March y Marinelli, 2005}), rendimiento de vainas y granos (qq/ha) y calidad granométrica como porcentaje de granos confitería correspondientes a 38/42, 40/50, 50/60 y 60/70 granos por onza. Las datos se analizaron mediante el análisis de varianza (ANOVA), previa validación del supuesto de homogeneidad de varianzas mediante la prueba de Levene (a = 0.05). La comparación de medias se realizó mediante test LSD (p≤0.05) con el paquete estadístico InfoStat (^{Di Rienzo et al., 2018}).

De acuerdo a los resultados presentados en el Cuadro 2, en condiciones controladas los tratamientos con T. harzianum y B. subitilis de forma individual y combinados, mostraron ausencia de Fusarium sp., mientras que S. minor mostró nivel de incidencia bajo con la aplicación de los antagonista de forma individual y ausencia de la enfermedad al inocularlos de manera combinada. El control de T. frezzi fue más eficiente al aplicar los biocontroladores de manera combinada (Cuadro 2). Sin embargo, al aplicarlos de manera individual se observó que T. harzianum presentó mejor control que B. subtilis. Estos resultados coinciden con lo observado por ^{Rojo et al. (2007}) quienes al aplicar T. harzianum ITEM 3636 en semillas de maní, lograron un efectivo control de F. solani. Estos autores sostienen que el biológico incorporado resultó ser un microorganismo eficiente y competitivo en la rizósfera. El efecto registrado al aplicar Trichoderma estaría relacionado a complejos mecanismos posiblemente asociados a la degradación de las paredes del hongo de acuerdo a lo propuesto por ^{Howell (2003}), ^{Harman et al. (2004}) y ^{Woo et al. (2006}).

En maní, evaluaciones preliminares inoculando B. subtilis, demostraron un eficiente control de hongos asociados a semillas (^{Illa et al., 2013}). En los resultados presentados en el Cuadro 2, se debe destacar la inhibición del crecimiento del hongo A. flavus por la inoculación con B. subtillis en maní. Resultados similares fueron encontrados por ^{Shifa et al. (2016}) quienes reportaron inhibición del crecimiento de A. flavus del 93 al 100% en ensayos de cultivo dual y la disminución en los porcentajes de infección en ensayos de invernáculo y campo. Estos autores resaltan la importancia de la aplicación de Bacillus para lograr diminuir la presencia de este hongo potencial generador de aflatoxina, lo que representa un aporte a la producción de maní inocuo.

En los ensayos de campo la emergencia de plantas a los 28 DDS (Cuadro 3) para todos los tratamientos aplicados, fue mayor respecto al Testigo (p≤0.05). Los tratamientos que incluyeron productos biológicos, mejoraron el porcentaje de plantas emergidas respecto al tratamiento fungicida, sin diferencias significativas entre los productos biológicos ensayados. El incremento de la emergencia en los tratamientos con biológicos pudo deberse al control de hongos fitopatógenos asociados a las semillas de maní. Al respecto, ^{Marani-Barbosa et al. (2013}) informaron que el control eficiente de A. flavus transportado por la semilla, mejoró la emergencia de las plántulas de maní en el campo. Resultados detectados con mejor efecto al aplicar de manera combinada un biológico más fungicida que de forma individual ya fue relatada tanto para Bacillus (^{Illa et al., 2013}; ²⁰¹⁶) como para Trichoderma (^{Vinale et al., 2008}). El crecimiento de plantas medido a los 30 DDS (Cuadro 3), mostró que todos los tratamientos con productos biológicos superaron al Testigo (p≤0.05). Además, no se detectaron diferencias significativas entre el tratamiento con el fungicida y los de los biocontroladores evaluados. Mientras que a los 165 DDS, se observó el efecto positivo de los biológicos aplicados solos y combinados, presentando diferencia estadística al tratamiento fungicida. Así la aplicación de biológicos mejoró el crecimiento en 11.8% respecto al tratamiento fungicida y 27.4% en relación al Testigo. El valor promedio de vainas maduras fue del 29%, sin diferencias significativas entre los tratamientos evaluados (Cuadro 3). De lo expuesto se deduce que el índice de madurez se comportó de manera independiente al estado sanitario de las vainas y la aplicación de los biocontroladores.

En base a los resultados presentados en el Cuadro 4, el rendimiento de vainas y granos fue mayor en todos los tratamientos respecto al Testigo. Además, la aplicación de los biológicos solos y combinados logró aumentar los rendimientos en grano en un 45.2% respecto al Testigo y 9.4% al compararlo con el tratamiento fungicida. Estos resultados concuerdan con ^{Shifa et al. (2016}), quienes reportaron que al aplicar Bacillus más fungicida (Tebuconazole) en semillas de maní ocasionó un incremento de alrededor del 40% en el rendimiento de vainas. El porcentaje de granos de calidad confitería (Cuadro 4) no mostró diferencias significativas entre los tratamientos aplicados a las semillas, pero sí con respecto al Testigo. El incremento en los rendimientos aparece como consecuencia del efecto promotor del crecimiento por los biológicos aplicados (^{Rojo et al., 2007}). En relación a ello, estudios llevados a cabo han demostrado que existe una correlación positiva entre el crecimiento alcanzado por la planta de maní y el rendimiento (^{Prassad et al., 2009}). El porcentaje de incidencia de T. frezzi en vainas no fue significativamente diferente entre el Testigo y el tratamiento Fungicida (Cuadro 4). Esto demostró que el producto sintético no controló la enfermedad en contraposición a lo propuesto por ^{Astiz y Wojscko (2011}) in vitro y ^{Buffoni y Marraro (2010}) en maní Colorado en ensayos de campo. Es de destacar que el control de esta enfermedad se vuelve relevante debido a las importantes pérdidas ocasionadas y su posible expansión hacia nuevas áreas de cultivo (^{Ganuza et al., 2017}). Por su parte, los tratamientos con B. subtilis y T. harzianum aplicados de forma individual y combinados, no mostraron diferencias significativas (p≤0.05) entre ellos pero sí al compararlos con el Testigo y el tratamiento con Fungicida. Los resultados obtenidos al aplicar biocontroladores muestran una disminución en la incidencia de T. frezzi. Esto concuerda con lo informado por Ganuza et al. (2017) al evaluar semillas de maní inoculadas con T. harzianum ITEM 3636, quienes observaron un control de 17% y 25% de T. frezzi, dependiendo del año evaluado.

Es importante destacar que el pretratamiento de semillas con biológicos, se constituiría en una alternativa a considerar para el control de esta severa enfermedad que disminuye en más del 30% el rendimiento, haciendo inviable económicamente la producción (^{Paredes et al., 2017}). Los resultados de este estudio demuestran que hay beneficios al aplicar B. subtiliss y T. harzianum en maní, desde el punto de vista sanitario como en el incremento del rendimiento. Además, se debe tener en cuenta que numerosos estudios han demostrado la inocuidad de estos microorganismos y que no existen restricciones en los códigos alimentarios al registrar su presencia en granos. La inoculación con T. harzianum y B. subtilis en condiciones controladas mostró la actividad antifúngica sobre los patógenos A. flavus, Fusarium sp., S. minor y T. frezzi en plantas de maní a los 60 DDS. El mejor control se logró con la aplicación combinada de los biológicos evaluados. En los ensayos de campo, la aplicación de los productos biológicos solos y combinados, mejoró la emergencia a los 28 DDS y el crecimiento de las plantas a los 165 DDS. Esto resultó en mayor rendimiento de vainas y granos, aumento de la proporción de granos con mayor tamaño sin afectar el grado de madurez. Al final del ciclo, las aplicaciones de biológicos evaluadas disminuyeron un 14% la incidencia de T. frezzi, respecto al Testigo y al fungicida. El efecto biocontrolador y estimulante de T. harzianum y B. subtilis en el crecimiento del maní, sugiere que su aplicación resultaría beneficiosa al cultivo y puede considerarse como estrategia tecnológica para adicionar al momento de la siembra.