El cultivo de tomate (Solanum lycopersicum) y chile (Capsicum annuum), representan una actividad de importancia económica a nivel mundial (Li et al., 2017). Históricamente, plantas de las familias Solanaceae y Cucurbitaceae se han visto afectadas por algunas especies del género Tobamovirus como: Tobacco mosaic virus (TMV) y Tomato mosaic virus (ToMV) (^{Dombrovsky y Smith, 2017}). En tomate, la resistencia a estos virus se introdujo por introgresión; sin embargo, la durabilidad de la resistencia se ve comprometida por la presión de selección de los patógenos (^{Dombrovsky y Smith, 2017}; ^{Maayan et al., 2018}). La importancia de los tobamovirus se debe a su fácil dispersión, principalmente por medios mecánicos (^{Dombrovsky et al., 2017}); también a través de semillas contaminadas, las partículas virales de los tobamovirus son extremadamente estables preservando su infectividad durante varios años (^{Dombrovsky y Smith, 2017}). Recientemente, se reportó la presencia del Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) en México, afectando tomate y chile (^{Cambrón-Crisantos et al., 2018}). Las plantas enfermas desarrollaron menor cantidad de flores y frutos; necrosis del pedúnculo y cáliz del fruto. Además, en frutos se observaron áreas amarillas, rugosidades y áreas necróticas (^{Salem et al., 2015}).

Para la identificación de tobamovirus, se han reportado oligonucleótidos para su detección universal, los cuales fueron diseñados tomando una matriz de alineamiento de regiones conservadas en los ORF1 que codifican la RdRP de 32 tobamovirus (^{Li et al., 2018}); sin embargo, hasta el momento no hay reportes de oligonucleótidos específicos para la detección de ToBRFV; por lo que el objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método de detección específico para ToBRFV, incluyendo el diseño de un par de oligonucleótidos específicos para la amplificación de una región codificante de la RdRP viral (ORF1) del ToBRFV por Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcripción Reversa (RT-PCR), considerando, específicamente las regiones nucleotídicas de los motifs estructurales o catalíticos; así como, la estandarización del método de detección.

El diseño del par de oligonucleótidos específicos para ToBRFV consideró los genomas completos de las especies más representativas del género Tobamovirus, reportados por el Centro Nacional de Información Biotecnológica, (National Center for Biotechnology Information, NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), como: Tobacco mosaic virus (TMV, Virgaviridae) (NC_001367.1, FR878069.1, HE818443.1 y V01408.1), Tomato mosaic virus (ToMV, Virgaviridae) (NC_002692.1, KY967227.1, MF002490.1 y AF332868.1), Tomato mottle mosaic virus (ToMMV, Virgaviridae) (NC_022230.1, FX898034.1, KR824950.1 y KF477193.1), adicionalmente, se consideraron los genomas de dos aislamientos de ToBRFV (Virgaviridae), Tomato brown rugose fruit virus aislado Israelí TBRFV-IL (KX619418.1) y Tomato brown rugose fruit virus aislado de Jordania (KT383474.1). Con el programa BioEdit versión 7.0.5.3 (^{Hall, 1999}) se hizo un alineamiento global de los genomas utilizando el algoritmo Clustal W para generar la primer matriz e identificar regiones variables entre ellos (Figura 1). La región seleccionada se usó para obtener las secuencias de los oligonucleótidos, éstas se analizaron in silico usando el servidor OligoAnalyzer versión 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/Analyzer/Home/Instructions) para predecir sus propiedades fisicoquímicas (Anexo 1). Los oligonucleótidos fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT).

Para el proceso de estandarización se utilizaron como control positivo de ToBRFV, siete plantas de tomate y una de chile con síntomas putativos a ToBRFV, recolectadas en el Estado de Michoacán (^{Cambrón-Crisantos et al., 2018}); resguardadas y almacenadas a -70 °C en las instalaciones del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF) de la Dirección General de Sanidad Vegetal, del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. La nervadura central de las hojas fue separada de un ancho de 0.5 cm aproximadamente para formar una muestra compuesta, la cual se picó finamente. La Extracción de RNA total, se realizó a partir de 100 mg de nervadura con el Kit SV Total RNA Isolation System Start-Up^® (Promega^TM), siguiendo las especificaciones del fabricante; la pureza y concentración del RNA se cuantificó por espectrofotometría (Nano Drop 2000^®, Thermo Scientific^TM). Como control negativo se utilizaron diez plantas infectadas individualmente con virus de genoma de ARN monocatenario de sentido positivo: Rattail cactus necrosis-associated virus (RCNaV, Virgaviridae), Tobacco mosaic virus (TMV, Virgaviridae), Tomato mosaic virus (ToMV, Virgaviridae), Pepper mild mottle virus (PMMoV, Virgaviridae), Cucumber mosaic virus (CMV, Bromoviridae) y Papaya meleira virus (PMeV, Totiviridae); así como con genoma DNA Pepper golden mosaic virus (PepGMV, Geminiviridae) y Okra yellow mosaic Mexico virus (OYMMV, Geminiviridae).

Figura 1 Región seleccionada para el diseño de los oligonucleótidos específicos para detectar a ToBRFV. A) Se consideraron los genomas de los Tobamovirus TMV, ToMV, ToMMV y ToBRFV. 

La síntesis de cDNA del control positivo, se hizo con oligonucleótidos aleatorios (Random Hexamer, Invitrogen™), siguiendo las indicaciones del fabricante, bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo a 42 °C por 30 min, 1 ciclo a 99 °C por 5 min y finalmente a 12 °C durante 5 min. En la PCR se usaron los oligonucleótidos específicos diseñados en el presente trabajo (ToBRFV-FMX y ToBRFV-RMX) (Cuadro1), que amplifican un fragmento de 475 pb, que codifica una región de la RdRP. La mezcla de reacción consistió en 18.9 µL de agua grado biología molecular (Invitrogen), 2.5 µL de Buffer 10X (Invitrogen), 0.75 µL de MgCl₂ (50 mM) (Invitrogen), 0.25 µL dNTP (10 mM) (Invitrogen), 0.75 µL del primer ToBRFV-FMX (10 µM), 0.75 µL del primer ToBRFV-RMX (10 µM), 0.1 µL de Platinum^TM Taq DNA polimerasa (Invitrogen) y 1 µL del templado de cDNA, en un volumen final de 25 µL. El programa de amplificación fue: 1 ciclo de 95 °C por 5 min, 30 ciclos a 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s y 72 °C por 40 s con una extensión final a 72 °C por 7 min. Posteriormente, el producto de la PCR del fragmento de la RdRP viral (Control plasmídico positivo) se clono en el vector de clonación pGEM ^®-T Easy (Promega), la ligación del inserto de 474 pb se llevó acabo en un volumen total de 5 μL de mezcla de reacción, los componentes fueron: 2.5 μL de 2X Buffer de ligación, 0.5 μL vector pGEM ^®-T Easy, 0.5 μL de DNA Ligasa T4 2X, 1 μL del producto a clonar y 0.5 μL de agua, manteniendo la mezcla a 15 °C durante 20 h. Posteriormente, se transformaron células One Shot Mach1-T1 E. coli (Invitrogen), quimiocompetentes. Para ello se utilizaron 150 µL de células competentes, mezcladas con los 5 µL de la reacción de ligación, esta se incubó en hielo por 30 min y se dio un choque térmico a 42 °C durante 2 min, después, el tubo se colocó en hielo durante 2 min. Se adicionaron 350 µL de medio LB y se incubó a 37 °C por 45 min. Finalmente, se cultivó en placas con medio LB, 40 µL de ampicilina, 40 µL de IPTG y 40 µL de Xgal (20 mg mL^-1) a 37 ˚C durante 16 h. La construcción pGEM/RdRP-ToBRFV (CP-1, ~3490 nt) obtenida de esta clonación se usó como control positivo para la estandarización de la RT-PCR del fragmento de la RdRP. Posteriormente, los fragmentos clonados se secuenciaron por la metodología Sanger en el Laboratorio de Biología Molecular del CNRF, con el equipo Applied Biosystems modelo 3130.

La estandarización del método se realizó siguiendo las condiciones de reacción señaladas previamente. Para determinar la temperatura de anillamiento óptima, se analizaron seis temperaturas de anillamiento con diferencia de 4 °C (47, 51, 55, 59, 63 y 67 °C), a partir de seis controles a una sola concentración (100 ng µL^-1): un control plasmídico positivo a ToBRFV (CP-1), dos controles biológicos infectados con ToBRFV, To-P-100-2 y Ch-P-100-1, correspondientes a tomate y chile, respectivamente; un control matriz por cultivo (CM-Ch-100-3 y CM-To-100-1) y uno de reactivos (NTC). El intervalo de trabajo se realizó y determinó a partir del control plasmídico positivo a ToBRFV (CP-1) a una concentración de 1000 ng µL^-1, se hicieron diluciones seriadas para obtener tres concentraciones de trabajo (100, 10 y 1 ng µL^-1) (Figura 2A). El límite de detección inferior, se estableció a partir de la última dilución del intervalo de trabajo (1 ng µL^-1) se hicieron diluciones seriadas, para obtener tres concentraciones de trabajo (0.1, 0.01 y 0.001 ng µL^-1) (Figura 2B). La especificidad se verificó utilizando controles negativos de: RCNaV, TMV, ToMV, PMMoV, CMV, y PMeV, así como con genoma DNA como PepGMV y OYMMV (Figura 2C).

A) Temperatura de anillamiento: M= Marcador molecular, 1= 47 °C, 2= 51 °C, 3= 55 °C, 4= 59 °C, 5= 63 °C, 6= 67 °C y 7= NTC.

B) Intervalo de trabajo y límite de detección inferior: M= Marcador molecular, 1= 1 000 ng μL-1, 2= 100 ng μL-1, 3= 10 ng μL-1, 4= 1 ng μL-1, 5= NTC, 6= 0.1 ng μL-1, 7= 0.01 ng μL-1, 8= 0.001 ng μL-1 y 9= NTC.

C) Especificidad: M= Marcador molecular, 1= RCNaV, 2= TMV, 3= CMV, 4= ToMV, 5= PMMoV, 6= PMeV, 7= PepGMV, 8= OYMMV, 9= NTC, 10= CP-1, 11= CM-Ch-100-3, 12= CM-To-100-1.

Figura 2 Estandarización de la RT-PCR para la detección específica de ToBRFV.  

Con los resultados de la estandarización se realizó la detección de ToBRFV a partir de las muestras vegetales recolectadas en el Estado de Michoacán y almacenadas a -70 °C; la síntesis de cDNA se realizó como se señaló anteriormente. En la PCR se usaron los oligonucleótidos específicos diseñados en el presente trabajo, los cuales amplifican un fragmento de 475 pb que codifica una región de la RdRP. La mezcla de reacción consistió en 18.9 µL de agua grado biología molecular (Invitrogen), 2.5 µL de Buffer 10X (Invitrogen), 0.75 µL de MgCl₂ (50 mM) (Invitrogen), 0.25 µL dNTP (10 mM) (Invitrogen), 0.75 µL del primer ToBRFV-FMX (10 µM), 0.75 µL del primer ToBRFV-RMX (10 µM), 0.1 µL de Platinum^TM Taq DNA polimerasa (Invitrogen) y 1 µL del templado de cDNA, en un volumen final de 25 µL. La amplificación se realizó a 95 °C por 5 min, seguida de 30 ciclos a 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s y 72 °C por 40 s con una extensión final a 72 °C por 7 min. Los ocho productos amplificados fueron visualizados en un gel de agarosa (Invitrogen) al 1.5%, y se clonaron en el vector pGEM ^®-T Easy. Los plásmidos con el inserto fueron secuenciados por la metodología Sanger en el Laboratorio de Biología Molecular del CNRF, utilizando el equipo Applied Biosystems modelo 3130; las secuencias obtenidas fueron ensambladas y editadas para obtener tamaños de 400 pb y comparadas en la base de datos del NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Para esta sección se utilizaron las ocho muestras utilizadas por Cambrón et al. (2018).

Finalmente, para confirmar la identidad del amplicón se realizó un análisis evolutivo, mediante la agrupación de las secuencias para hacer un alineamiento local utilizando el programa MEGA versión 7.0.26 y el algoritmo MUSCLE (Kumar et al., 2016). Para realizar este análisis, se construyó una matriz con secuencias de Tobacco mosaic virus (TMV), Tomato mosaic virus (ToMV) y Tomato mottle mosaic virus (ToMMV). Para obtener la raíz del árbol se usaron como grupo externo dos secuencias correspondientes a Pepper mild mottle virus aislado Huludao (PMMV) (MG515725.1) y Tobacco mild green mosaic virus aislado Xiamen (ToMGMV) (JX534224.2). Se usó el método Maximum Likelihood (ML) basado en el modelo de Tamura-Nei, con 1500 repeticiones de bootstrap. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas utilizando el enfoque Maximum Composite Likelihood (MCL) y seleccionando la topología con un valor de verosimilitud log superior (Figura 3).

El análisis in silico de los oligonucleótidos ToBRFV-FMX y ToBRFV-RMX mostró ser específico para ToBRFV, tomando como base los genomas de varios miembros del género Tobamovirus. De acuerdo a las propiedades fisicoquímicas predichas, los oligonucleótidos son estables a las condiciones de PCR. El amplicón obtenido de ~475 pb por RT-PCR con los oligonucleótidos diseñados en este trabajo, amplifican solamente en el control positivo a ToBRFV y no en las muestras infectadas de virus con genoma de RNA monocatenario de sentido positivo (incluidos varios tobamovirus) o virus de DNA, demostrando ser específicos. Por su parte, el análisis evolutivo de las secuencias nucleotídicas correspondientes al fragmento de la RdRP de las ocho muestras recolectadas en Michoacán, México, sugiere la relación evolutiva entre TMV, ToMV y ToBRFV. ^{Luria et al. (2017}) mencionaron una relación evolutiva entre TMV y ToBRFV, los resultados del análisis en este trabajo con un fragmento del ORF1 codificante de la RdRP, coinciden con lo reportado por ^{Cambrón-Crisantos et al. (2018}), donde se usó un producto de PCR de 1052 pb con los oligonucleótidos F-3666 y R-4718, reportados por Luria et al. (2017), mostrando altos valores nodales en el árbol generado. La estandarización en este trabajo, mostró que 55 °C es la temperatura óptima de anillamiento de los oligonucleótidos diseñados, al obtener solo el amplicón de 475 pb. Se estableció para esta metodología que el intervalo de trabajo va de 1 ng µL^-1 a 1000 ng µL^-1, por su parte el límite de detección inferior va de 0.001 ng µL^-1 a 0.1 ng µL^-1.

Figura 3 Análisis evolutivo de ToBRFV y virus relacionados con el género Tobamovirus basados en el alineamiento de la región correspondiente a RdRP viral. Las secuencias incluidas en el análisis se representan con el acrónimo del virus y los números de acceso a GenBank. Los valores nodales soportan la relación evolutiva de las secuencias analizadas. 

Los oligonucleótidos diseñados en este trabajo, permiten identificar de manera específica la presencia de ToBRFV en material vegetal, aportando así una metodología para la detección oportuna, en menor tiempo y con mayor especificidad, en comparación con el uso de oligonucleótidos generales para el género Tobamovirus, sin generar falsos positivos con otros virus de genoma de ARN monocatenario de cadena sencilla (+ssRNA).