Las enfermedades fúngicas causan pérdidas considerables en la producción agrícola. Botrytis cinerea, causante de pudrición gris (moho gris), es un patógeno que puede infectar hasta 1,000 especies de planta a través de hojas, peciolos, raíces, frutos, flores, semillas, y frutos postcosecha (^{Rupp et al., 2017}). Colletotrichum gloeosporioides, de la familia de los Ascomicetos, es un fitopatógeno que causa antracnosis en plantas y frutos. Es uno de los más importante patógenos postcosecha ya que resulta en infecciones del fruto asintomáticas, latentes, o largamente inactivas, con síntomas que aparecen hasta que el fruto madura (^{Rodríguez-López et al., 2009}) cuando los conidios responden a señales químicas, ceras cuticulares y etileno, producidas por el hospedero. Se han probado diversos métodos para prevenir y controlar fitopatógenos, desde productos químicos, productos naturales renovables con atractivas propiedades como biocompatibilidad, biodegradabilidad, actividad antimicrobiana y seguridad, hasta los aceites esenciales y extractos de plantas con actividad microbicida (^{Zhong et al., 2014}). Guazuma ulmifolia (Malvaceae), conocida como guacimo, mutamba, caulote o equiche, es un árbol tropical de tamaño mediano distribuido desde el norte de México hasta América del Sur (^{Maurino dos Santos et al., 2018}). Por sus propiedades antibacterianas, antifúngicas y antiinflamatorias, la corteza, los frutos y las hojas se usan para tratar diversas enfermedades (^{Maldini et al., 2013}). Asimismo, el follaje y los frutos se utilizan como forraje para ganado y caballos. Aunque la corteza, las hojas y los extractos de fruto tienen propiedades antimicrobianas, los informes científicos se han centrado en la corteza y sus propiedades medicinales, atribuidas a su alto contenido de procianidinas (taninos condensados) (^{Lopes et al., 2009}). Hay pocos reportes para control de fitopatógenos con extractos de G. ulmifolia, no obstante las restricciones en el uso de agroquímicos y el fomento del control biológico, que incluye extractos de plantas con propiedades fungicidas. Por ello, el objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos de fruto y corteza de G. ulmifolia contra B. cinerea y C. gloeosporioides.

Recolección de plantas. En abril de 2015 se recolectó el material, corteza y frutos de árboles silvestres en el área “Bosque de la Primavera” en Tala Jalisco (20° 29’ 00” N de latitud y 103° 29’ 30” W longitud) a una altura de 1320 metros sobre el nivel del mar. El muestreo se efectuó sobre 5 árboles seleccionados al azar. De cada uno se tomó aproximadamente 3 kg de frutos maduros y 1 kg de corteza de diferentes partes del tallo, sin evidencia de enfermedades. Una muestra compuesta se secó al medio ambiente en el laboratorio a ~25 °C, se pulverizó en un molino de cuchillas (Retsch-GMBH) y se mantuvo refrigerada hasta su uso. El “Bosque de la Primavera” es un área natural protegida ubicada al oeste del área metropolitana de Guadalajara, México, de aproximadamente 30500 hectáreas de roble, roble-pino y bosque tropical caducifolio. La precipitación anual fluctúa entre 800 y 1000 mm y la temperatura anual de 20.6±6.5 °C (^{Huerta-Martínez e Ibarra-Montoya, 2014}).

Obtención de extractos crudos. Los materiales molidos y secos (100 g, peso seco) se extrajeron con 500 mL de hexano, para eliminar el material lipídico (interfiere con los análisis de metabolitos), por 2 horas con agitación en un matraz y baño de hielo (4 °C). Las pruebas de extracción fueron con solventes de diferentes polaridades (hexano, diclorometano y metanol) para encontrar el más eficiente, auxiliándose de cromatografía en capa fina (TLC) para este fin. Los resultados indicaron que el diclorometano fue el mejor solvente de extracción. El fruto y corteza se extrajeron con diclorometano durante 48 horas y 28 °C con agitación continua (150 rpm), relación de disolvente a muestra seca de 5:1 (v/w), en incubadora (LabTech modelo LSI-3016R). El material se filtró con papel Whatman No. 4 y el material extraído se concentró en un rotoevaporador Buchi a presión reducida y 40 °C. El rendimiento del extracto, en mg g^-1, se determinó dividiendo los sólidos secos obtenidos entre el peso del material vegetal seco inicial.

Cultivo de patógenos y preparación de inóculos. Las cepas de C. gloeosporioides y B. cinerea fueron proporcionadas amablemente por el Laboratorio de Fitopatología en el CUCBA de la Universidad de Guadalajara, donde se aislaron de papaya y fresa enfermas, respectivamente, y se identificaron por sus características morfológicas y fisiológicas según los protocolos correspondientes. Cultivos puros de estas cepas se dispersaron, por separado, en 5 mL de solución salina estéril (NaCl, 0,85% p/v) o agua destilada, y la concentración de los microorganismos se ajustó con solución salina o agua a 1 - 2.5 x 10⁶ células mL^-1, utilizando una cámara de recuento de células de Neubauer (^{Moro et al., 2017}).

Tamizaje Fitoquímico. Antes de las pruebas de los bioensayos, se aplicaron pruebas para la identificación cualitativa de los compuestos fitoquímicos con actividad biológica (flavonoides, taninos, terpenoides, alcaloides, saponinas, glucósidos, etcétera) presentes en los extractos, utilizando para ello procedimientos establecidos (^{Harbone, 1998}).

TLC-Bioautografía (TLC-B). Los métodos de TLC-B son aquellos en los que se detectan cualitativamente compuestos bioactivos por medio de pruebas biológicas (antimicrobianas o enzimáticas) aplicadas sobre extractos químicos (^{Choma y Jesionek, 2015}). Los extractos de plantas se fraccionaron por medio de TLC en sus diferentes constituyentes fitoquímicos, para lo cual se aplicaron ~10 μL de extracto en una placa de TLC (10 x 10 cm, gel de sílice, Merk, 60F₂₅₄), con una fase móvil de tolueno:acetato de etilo (85:15), visualizando la separación de los compuestos con luz UV (254 y 365 nm, Handfield UV Lamp, UVGL-58), y se registró el valor Rf (factor de retardo). Se utilizó la placa desarrollada para analizar la actividad biológica de los compuestos mediante bioautografía directa, usando extracto de té verde como control positivo. Las placas TLC se secaron y después se asperjaron con la suspensión fúngica correspondiente (1 x10⁶ células mL^-1) hasta humedecerla, incubándolas durante 24 horas a 37 °C y después de esto se impregnaron con violeta de p-yodonitrotetrazolio (Sigma, 2 mg mL^-1, 6 h, 35 °C). La sal de tetrazolio (INT) es un aceptor de electrones; los microorganismos biológicamente activos lo reducen a formazán, el cual es un compuesto de color rojo, y se vuelven incoloros cuando se inhibe el crecimiento de los hongos (^{Eloff et al., 2008}). Las áreas de color rojo púrpura revelan microbios activos y las áreas blancas indican la inhibición de la actividad fúngica. Para la evaluación de la actividad antioxidante se asperjaron las placas de TLC con una solución 0.2% del compuesto de DPPH (2, 2, difenilo-1-picrilhidrazilo en metanol, Sigma^®), que es un radical libre. Las placas de TLC se calentaron y los compuestos antioxidantes se visualizaron mediante el desarrollo de manchas blancas amarillentas sobre el fondo púrpura del DPPH (^{Belaqziz et al., 2017}).

Inhibición del Crecimiento Micelial (ICM). El agar de crecimiento fue preparado mediante la mezcla de Agar PDA líquido (auxiliándose de un homogeneizador marca DragonLab) con 1% (v/v), Tween 80 (surfactante para mejorar la emulsificación) y suficiente extracto para alcanzar concentraciones en el 1-20 mg mL^-1 (rango amplio para encontrar varios datos de inhibición); el agar se depositó en cajas Petri (90 mmØ) y se dejó solidificar; luego se colocó un disco de 7 mm de diámetro impregnado con conidiósporas a una concentración controlada (1 x10⁶ células mL^-1), en el centro de las placas. Se utilizaron PDA como control negativo y benomilo (1 mg mL^-1) como control positivo. Benomilo [1-[(butilamino)carbonil]-1H-benzimidazol-2-il] es un derivado azol comúnmente utilizado para el control químico de estos hongos. Las placas se incubaron a 28 °C y el crecimiento de la colonia se midió cada 24 h con la ayuda de una regla, hasta que el micelio en el control negativo alcanzó el borde de la placa. Las pruebas se realizaron por triplicado y el porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente fórmula (^{Zhong et al., 2014}):

La concentración letal, (LC₅₀) y (LC₉₅) se calculó a partir de la curva de % de inhibición micelial vs concentración de extracto.

Estudio de Microscopía. Se observaron las muestras de los hongos tratados con los extractos de corteza y fruto de guacimo (10 mg mL^-1)^, benomilo y PDA, para lo cual se depositaron en portaobjetos, se dispersaron homogéneamente con agua destilada, y fueron observados con un microscopio óptico (Zeiss modelo KF2) provisto de una cámara (Axio Cam ERC5S).

Análisis estadístico. Para el método de Inhibición del crecimiento micelial se aplicó un diseño aleatorizado, con los factores experimentales: Parte de la planta (fruto y corteza); hongos (C. gloeosporioides y B. cinerea); tiempo de tratamiento (72 h, 144 h, 240 h, 312 h), y la concentración del extracto (1 mg mL^-1, 10 mg mL^-1, 20 mg mL^-1). La variable de respuesta fue la inhibición del crecimiento radial (%). Los datos se analizaron mediante ANOVA multifactorial (nivel de confianza del 95%, P<0.05), para evaluar la significación estadística de los factores; y la prueba de Tukey para determinar los valores que difieren. Se empleó el software estadístico Statgraphics Centurion XVII (^©2014 Statpoint Technologies, Inc.) para el análisis de datos.

En resultados, el rendimientos de los extractos para el fruto fue de 20.1 mg g^-1 de material original base seca (bs) en hexano, 52.5 mg g^-1 bs en diclorometano y 76.4 mg g^-1 bs en metanol, mientras que para corteza fue de 56.7 mg g^-1bs en hexano, 122.4 mg g^-1 bs en diclorometano y 66.0 mg g^-1bs en metanol. Estos valores son más altos que los 2 mg g^-1 y 47 mg g^-1 reportados para la corteza de guacimo extraídas por maceración con hexano y metanol, respectivamente (^{Camporese et al., 2003}). El diclorometano fue el extractante más eficiente, según lo indicado por la cantidad de metabolitos evidenciados en la prueba TLC. El tamizaje evidenció la presencia en los extractos de guacimo de alcaloides, flavonoides, taninos, triterpenos, saponinas y cumarinas, destacando los flavonoides, triterpenos y cumarinas, debido a su actividad biológica. Estos resultados coinciden con los previamente reportados para fruto de G. ulmifolia, que mencionan la presencia de fenoles, taninos, saponinas, flavonoides y terpenoides (^{Singanan et al., 2018}). Algunas de estas biomoléculas son características de plantas medicinales y tienen propiedades antioxidantes, terapéuticas y medicinales que pueden inhibir o eliminar el crecimiento de patógenos, con poca o ninguna toxicidad para las células hospederas, y son candidatos para aplicaciones antimicrobianas (^{Mujeeb et al., 2014}). Los resultados de TLC-Bioautografía sobre B. cinerea se muestran en la Figura 1. El comportamiento de C. gloeosporioides y B. cinerea fue similar y por brevedad, solo se discute el último. La placa de TLC (A) en la Figura 1 muestra la separación de los compuestos presentes en los extractos de corteza y frutos de guacimo, observados como manchas redondas y distintas entre sí. La placa (B) muestra la actividad antioxidante de cada punto que se encuentra en la placa (A) contra el radical DPPH (TLC-DPPH); en esta placa una mancha amarillenta indica actividad antioxidante. Las placas C y D muestran la actividad antimicrobiana contra B. cinerea (prueba de bioautografía TLC-directa) de los extractos de G. ulmifolia y el té verde, usado como control positivo, respectivamente. La actividad antimicrobiana se aprecia como manchas más claras. Se observa que las zonas activas coinciden con las del té verde, por lo que es probable que contengan el mismo tipo de flavonoides y en comparación se deduce que esta es la zona de extractos antioxidantes y antifúngicos. Los valores de Rf para los puntos son aproximadamente 0.30-0.45. El tamaño e intensidad de las manchas se incrementan con el nivel de bioactividad. Una observación cuidadosa de las placas de TLC indicaría que la bioactividad es mayor en los extractos del fruto en relación a los de la corteza.

Figura 1 Pruebas biológicas cualitativas para extractos crudos de corteza y fruto de G. ulmifolia contra B. Cinerea. Fase móvil de tolueno/acetato de etilo (85/15). A) Placas de gel de sílice para TLC; B) TLC-DPPH. Actividad antioxi dante de extractos de G. ulmifolia. Método de revelado: Vanillina; C) TLC-Bioautografía Directa. Actividad anti fúngica de los extractos de G. ulmifolia y D) Te Verde- Bioautografía directa. Actividad Antifúngica de extractos de Té Verde (Comparativo). 

El Cuadro 1 muestra la inhibición del crecimiento micelial. Todas las variables experimentales fueron estadísticamente significativas (ANOVA, P <0.05). Los extractos crudos de corteza y fruto de G. ulmifolia inhibieron el crecimiento de B. cinerea y C. gloeosporioides en diferentes grados. La inhibición más alta (91.5 ± 1.4%) se observó en C. gloeosporioides con 20 mg mL^-1 de extracto de fruto y 13 días de tratamiento, similar en este punto al efecto del benomilo (1 mg mL^-1). Significa que se necesita una importante cantidad de extracto crudo por planta para igualar el efecto del benomilo o de otros fungicidas químicos.

Sin embargo, el beneficio de usarlos consiste en un control biológico seguro e inocuo, entre otros. En contraste, los extractos de corteza inhibieron menos que los extracto de fruto. Bajo las mismas condiciones descritas (13 días, 20 mg mL^-1) C. gloeosporioides fue inhibido en 48.0 ± 1.6%, por extractos de corteza, lo cual es casí 50% inferior al 91.5% que se obtuvo con fruto. Asimismo, B. cinerea fue más susceptible que C. gloeosporioides (más resistente) a los extractos; Por ejemplo, en 13 días de tratamiento y 10 mg mL^-1, los extractos de fruto inhibieron el crecimiento de B. cinerea y C. gloeosporioides en 85.5 ± 2.1% y 45.8 ± 10.0%, respectivamente, lo cual es indicativo de esta tendencia. Los resultados de este estudio indican que los extractos reprimieron el crecimiento del micelio fúngico, con los mejores efectos al aplicarlo a concentraciones de ³10 mg mL^-1, obteniendo inhibición máxima con 20 mg mL^-1 (Cuadro 1). La inhibición fue débil y con comportamiento errático cuando se aplicó a 1 mg mL^-1. No hay trabajos previos sobre el efecto de extractos crudos de G. ulmifolia contra estos patógenos; sin embargo, si hay informes sobre los efectos de otros extractos de plantas contra ellos. El extracto de metanol de Piscidia piscipula aplicado a 2 mg mL^-1 y 5 días ocasionó 52.3% ICM sobre C. gloeosporioides (^{Peraza-Sanchez et al., 2005}), resultado mejor que el nuestro. También, los extractos crudos hidroalcohólicos de la hoja del jaboncillo (Sapindus saponaria), en 7 días de tratamiento inhibieron 70% el crecimiento micelial de C. gloeosporioides al aplicarlo a 50 mg mL^-1 y 80% al aplicarlo a 100 mg mL^-1, mientras que concentraciones menores de 50 mg mL^-1 no tuvieron efecto (^{Passos Marinho et al., 2018}). Extractos alcohólicos de las hojas de las vides silvestres (Vitis) aplicados a 12% de concentración ocasionaron 70% ICM de B. cinerea (^{Apolonio-Rodríguez et al., 2017}), menor que nuestros resultados. La actividad antimicrobiana y medicinal de los extractos de corteza, partes aéreas y frutos de G. ulmifolia se atribuye a la presencia de flavonoides del subgrupo flavan-3-ols (^{Lopes et al., 2009}); compuestos tales como la catequina, epicatequina, flavanocoumarinas y las procianidinas y proantocianidinas derivadas de ellas, con propiedades antioxidantes y antiinflamatorias (^{Maldini et al., 2013}). Los valores de concentración letal (CL, mg mL^-1) se calcularon considerando los mejores datos de inhibición en el cuadro 1, y son los siguientes: 1. C. gloeosporioides: Fruto (CL₅₀ = 10.57, CL₉₅ = 20.94); Corteza (CL₅₀ = 16.54, CL₉₅ = 34.13), 2. B. cinerea: Fruto (CL₅₀ = 5.24, CL₉₅ = 11.09); Corteza (CL₅₀ = 10.6, CL₉₅ = 22.6). En la figura 2 se aprecian las características morfológicas de los hongos estudiados. La anatomía de C. gloeosporioides y B. cinerea ha sido previamente reportada. En la Figura 2A se muestra C. gloeosporioides. Sus características principales (^{Rodríguez-López et al., 2009}) son hifas septadas cuyo color es de gris claro a gris oscuro. Los conidios son hialinos, cilíndricos y separados del pedicelo por un tabique transversal. Para B. cinerea (Figura 2B), se establece (^{Miclea Raluca Vasilica et al., 2012}) hifas septadas y cilíndricas, hialina al principio y más tarde se vuelven marrón o negro. Se multiplican por división citoplásmica. Los conidios son globulares o elípticos, formando cadenas exógenas (blastosporas). El tratamiento de los hongos con extractos de guacimo ocasionó alteraciones en su morfología, a nivel de micelios deformados, ondulados, plegados, con porciones planas o vacías (^{Xu et al., 2007}), con coagulación citoplásmica, que se muestran como pequeñas vesículas en el micelio (Figura 2C). Los compuestos fenólicos no polares, como los que se encuentran en el guacimo, podrían actuar sobre la membrana citoplasmática, causando su desintegración y pérdida de trifosfato de adenosina, lo que resulta en la muerte celular (^{Hassani et al., 2012}). Los conidios mostraron cambios en su forma original (Figura 2E). La pared celular de estos elementos puede sufrir daños, con numerosas protuberancias que eventualmente llevan a su colapso, lo que podría inhibir su germinación (^{Sharma y Tripathi, 2008}). De igual manera, C. gloeosporioides tratado con benomil (bencimidazol) mostró hifas vacías con grandes estructuras anómalas (Figura 2F). Benomilo es un fungicida comercial que se ha utilizado durante muchos años para controlar la antracnosis antes de la cosecha de frutos.

Figura 2 Cambios microscópicos observados en B. cinerea y C. gloeosporioides después de la exposición a extractos de fruto y corteza de G. ulmifolia. Microscopio de luz, 100x. A) Morfología de C. gloeosporioides; B) morfología B. cinerea; C) C. gloeosporioides tratado con extractos de fruto de G. ulmifolia: Observar hifas con estructura deformada y citoplasma coagulado; D) B. cinerea tratado con extracto de fruto de G. ulmifolia; E) C. gloeosporioides tratado con extracto de corteza de G. ulmifolia y F) C. gloeosporioides tratado con Benomilo. 

La tendencia observada en este trabajo fue que el extracto del fruto fue más efectivo que el extracto de corteza en la inhibición micelial y podría ser una buena fuente de compuestos biológicamente activos con posibles usos terapéuticos y fungicidas. Aunque el fruto es la parte más accesible de la planta, comestible, dulce y apetecible y es consumida por la población, no ha sido ampliamente investigada. Otra tendencia fue que C. gloeosporioides fue más resistente que B. cinérea, sin embargo, se necesitan pruebas más específicas y evaluación de la patogenicidad y/o virulencia para confirmar este desempeño.