SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.36 issue1Selection in vitro of mycoparasites with potential for biological control on Coffee Leaf Rust (Hemileia vastatrix) author indexsubject indexsearch form
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Journal

Article

Indicators

Related links

  • Have no similar articlesSimilars in SciELO

Share


Revista mexicana de fitopatología

On-line version ISSN 2007-8080Print version ISSN 0185-3309

Rev. mex. fitopatol vol.36 n.1 Texcoco Jan./Apr. 2018

http://dx.doi.org/10.18781/r.mex.fit.1710-2 

Notas fitopatológicas

Identificación morfológica y molecular de especies de Mortierella asociados a rizosfera de manzanos con síntomas de enfermedades radiculares

Yericka Mares-Ponce de León1 

Laila Nayzzel Muñoz-Castellanos1 

María Fernanda Ruiz-Cisneros2 

Daniel Alonso Pérez-Corral2 

José de Jesús Ornelas-Paz2 

Carlos Horacio Acosta-Muñiz2 

David Ignacio Berlanga-Reyes2 

Claudio Rios-Velasco2  * 

1 Universidad Autónoma de Chihuahua, Facultad de Ciencias Químicas, Campus Universitario #2, Circuito Universitario, Chihuahua. CP. 31125, Chihuahua, Chihuahua, México.

2 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Campus Cuauhtémoc. Avenida Río Conchos S/N. Parque Industrial, CP. 31570, Cuauhtémoc, Chihuahua, México.

Resumen:

Se aislaron especies de Mortierella en Agar Dextrosa Papa y agar V8, así como peras maduras y hojas de azalea, como sustratos trampa. Se obtuvieron 419 aislados de Mortierella, de muestras de suelo en Chihuahua, México, los cuales se clasificaron en 21 grupos de acuerdo con sus caracteres morfológicos. Mortierella se aisló con mayor frecuencia cuando se emplearon peras, obteniendo 143 aislados (34.1%), seguido del agar V8-antibióticos con 133 aislados (31.7%) y las hojas de azalea, con 95 aislados (22.7%). Se identificó molecularmente un aislado de cada uno de los 21 grupos, 12 correspondieron a Mortierella alpina, uno a M. gamsii, uno a M. capitata y seis a Mortierella sp. y uno perteneció al orden Mortierelliales. Adicionalmente se probó la patogenicidad putativa de los 21 aislados de Mortierella identificados, en porta injertos de manzana G30 bajo condiciones de invernadero y ninguno fue patogénico. Estas especies no habían sido reportadas previamente en México. El estudio demostró que existen especies de Mortierella en la rizosfera de manzanos en Chihuahua, México. Estas podrían producir ácidos grasos poliinsaturados y ejercer efectos elicitores en cultivos hortofrutícolas confiriéndoles resistencia a múltiples patógenos.

Palabras clave: Mortierellales; diversidad; sustratos trampa; medio de aislamiento; patogenicidad

Se estima que solo un 5% de las especies fúngicas existentes han sido registradas y descritas (Hawksworth, 2001). Mortierelliales es uno de los órdenes más abundantes y diversos de los hongos basales y hay cerca de 100 especies descritas en 13 géneros de la familia Mortierellaceae (Yadav et al., 2014), género al cual corresponde el hongo Mortierella. La mayoría de las especies de este género producen ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) al convertir el exceso de azúcares y otras fuentes de carbón en lípidos bajo diferentes condiciones de fermentación (Rayaroth et al., 2016). En varios estudios se ha demostrado que algunas especies de Mortierella pueden acumular ácidos araquidónico, gamma-linolénico, eicosapentaenoico y docosahexaenoico en el micelio (Ho et al., 2007; Dedyukhina et al., 2014). Estos compuestos están involucrados en la inducción de resistencia a fitopatógenos en plantas de importancia agrícola (Zlotek and Wojcik, 2014). Asimismo, estos PUFA son ampliamente utilizados como suplementos alimenticios y fármacos que mejoran la respuesta inmunológica en los seres humanos, lo cual confiere importancia tecnológica al género Mortierella como fuente alternativa de dichos compuestos (Dedyukhina et al., 2014). Sin embargo, existe información escasa u obsoleta acerca de la diversidad de los Mortierellales. La identificación de las especies de Mortierella se ha basado principalmente en sus caracteres morfológicos (Watanabe, 2010). Además, la identidad de las especies de estos hongos mediante técnicas moleculares ha recibido poca atención, sobre todo en México, donde actualmente existe un gran interés por encontrar microorganismos antagónicos para el control de fitopatógenos. Por tanto, el objetivo del presente estudio fue aislar e identificar especies nativas de Mortierella asociadas con manzanos con síntomas aparentes de enfermedades radiculares.

De junio a julio de 2015, se muestrearon tres huertas de manzanos (Malus x domestica Borkh. Rosales: Rosaceae) en las cuatro zonas productoras de manzana más importantes: Cuauhtémoc, Guerrero, Bachiniva y Namiquipa, Chihuahua, México (Cuadro 1). Se recolectaron muestras de suelo (500-600 g) de la rizosfera de cinco árboles con síntomas aparentes de enfermedades radiculares causadas por hongos y oomicetos en cada huerto (Ruiz-Cisneros et al., 2017).

Cuadro 1 Localidad donde se recolectaron muestras de suelo rizosférico en huertos de manzana en Chihuahua, México, en 2015. 

Localidad Huerto Localización geográfica Altitud
Cuauhtémoc Campo 2A N28°26’40”; O106°59’18” 2,130
Campana 4 ½ N28°33’49”; O106°54’24” 1,995
Picacho N28°29’28”; O 106°40’08” 2,020
Guerrero Alberto Gameros N28°31’58”; O 107°26’57” 2,096
Alberto Gameros PIG30 N28°31’58”; O 107°26’57” 2,096
Efraín Sandoval N28º32’59”; O 107º27’10” 2,099
Namiquipa Carlos Márquez N29°11’20”; O 107°25’14” 1,877
San Rafael N29°12’19”; O 107°25’22” 1,858
El Terrero N29°18’84”; O107°44’21” 2,037
Bachiniva La Cienega N28°46’52”; O 107°15’21” 2,009
Santa Rosa N28°50’17”; O 107°14’12” 1,989
Los 40 N28°48’07”; O 107°16’06” 1,990

Para aislar las cepas de Mortierella se utilizaron dos medios de cultivo (Agar Dextrosa Papa y agar V8). Los medios agar-dextrosa-papa (PDA; BD Bioxon) y agar V8 [jugo V8, carbonato de calcio (CaCO3) - agar] contenían antibióticos [oxitetraciclina, 0.01 g/L; rifampicina, 0.03 g/L; pimaricina, 0.01 g/L, y 66.8 µL/L de un formulado fungicida con hymexazol (Summit Agro, México]. El aislamiento de cepas de Mortierella en agar V8 se llevó a cabo con y sin frutos de pera (Pyrus communis L.) y hojas de azalea (Rhododendron simsii Planch.) como sustratos trampa. Para el aislamiento en PDA y agar V8 sin sustratos trampa, se prepararon diluciones seriadas (1:10) en tubos de ensayo con 9 mL de agua estéril de peptona (peptona al 0.1% y NaCl al 0.85% en agua destilada), a las que se agregó 1 g de suelo previamente tamizado para generar diluciones de 103, 104 y 105. Utilizando la técnica de difusión, las alícuotas (50 µL) de cada suspensión se distribuyeron por triplicado en cajas de Petri de 90 mm que contenían uno de los medios. Posteriormente, las cajas de Petri se incubaron a 28 ± 1 °C por 72 h en una cámara ambiental sin luz (Precision Scientific, Winchester, VA, EUA). Para aislar las cepas de Mortierella utilizando frutos de pera como sustrato trampa, se colocaron 200-250 g de suelo húmedo en vasos de plástico de 1 L con tapa que contenían una pera previamente lavada con NaClO al 1.5% por 1 min. Los vasos fueron incubados a 26 ± 1 °C en oscuridad por 72 h. En seguida, los frutos se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y se secaron en papel de estraza en una campana de bioseguridad (Envirco Corporation, Albuquerque, EUA). Los frutos fueron incubados de manera individual a 26 ± 1 °C por 48 h. Se extirparon tres secciones (5 mm2) de la epidermis dañada del fruto (zona de transición), o de la epidermis con micelio, y se colocaron en cajas de Petri que contenían agar V8 con antibióticos. Las cajas se incubaron a 26 ± 1 °C por 72 h. Para el aislamiento con hojas de azalea como sustrato trampa, se utilizaron hojas jóvenes y frescas que fueron sometidas al mismo tratamiento que los frutos de pera. Las hojas se cortaron en círculos de 5 mm de diámetro. Los círculos se colocaron en cajas de Petri (60 × 15 mm) que contenían 10-15 g de suelo húmedo y se incubaron a temperatura ambiente por 24 h. Los círculos de las hojas se desprendieron de la caja, se lavaron con agua destilada estéril y se secaron en papel de estraza. Los círculos se colocaron en los cuatro puntos cardinales y en el centro de las cajas de Petri que contenían agar V8 con antibióticos y se incubaron a 28 ± 1 °C por 72 h. Estos experimentos se hicieron por triplicado.

Las colonias con morfología típica de Mortierella se aislaron y purificaron en los medios agar V8 o PDA sin antibióticos, aplicando la técnica de cultivo monospórico, y se incubaron a 28 ± 1 °C sin luz por 120 h.

Los aislados putativos de Mortierellales fueron agrupados según sus caracteres morfológicos macroscópicos y después se tomó un aislado de cada grupo para su identificación (Watanabe, 2010), de acuerdo con los caracteres microscópicos observados en un microscopio óptico (Carl Zeiss, Germany).

La extracción de ADN genómico (ADNg) se realizó de acuerdo con el método de Raeder y Broda (1985) y Ruiz-Cisneros et al. (2017). El ADNg se utilizó para amplificar la región espaciadora interna transcrita (ITS) del gen 18S ADNr con iniciadores universales ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTA-ACAAGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3’) (White et al., 1990). La amplificación se llevó a cabo de acuerdo a la metodología descrita por Ruiz-Cisneros et al. (2017). Los productos de PCR fueron examinados por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Posteriormente, los productos fueron secuenciados por Macrogen Company (Rockville, MD, EUA). Las secuencias obtenidas se compararon con la base de datos del NCBI mediante el algoritmo de BLAST (Altschul et al., 1990) para verificar el porcentaje de identidad correspondiente a las especies analizadas. Además, se construyó un árbol filogenético, por el método de máxima verosimilitud, a fin de observar el agrupamiento de los hongos Mortierellales, para lo cual se utilizó el software Mega versión 6.0 (Tamura et al., 2013).

La patogenicidad de los 21 aislados de Mortierella se probó en porta injertos de manzana G30 (una de las que más se producen en México) en condiciones de invernadero, según el método de Ruiz-Cisneros et al. (2017) con modificaciones. Se evaluaron 10 porta injertos G30 (de 1 año de edad) por cada aislado de Mortierella, junto con diez árboles de testigo (sin inóculo). Dos meses después de la plantación, cada árbol fue inoculado con 10 mL de inóculo de Mortierella no cuantificado. El inóculo, de 6-7 días de edad, se sembró en jugo de verduras V8 [jugo V8 (Campbell’s™) y carbonato de calcio (CaCO3)], y se mantuvo a 28 °C con agitación orbital constante a 140 rpm (Orbit 1900, Labnet International Inc.). Posteriormente, los porta injertos inoculados se mantuvieron dos meses más en condiciones de invernadero y durante este periodo fueron monitoreados cada semana.

Se obtuvieron 119 aislados de Mortierella de las muestras de suelo evaluadas (Cuadro 1, Figura 1a-b). El uso de frutos de pera como sustrato trampa nos permitió obtener el mayor número de aislados (143 aislados, 34.1%), seguido del medio de V8-agar-antibióticos (133 aislados, 31.7%) y del método en que se utilizaron hojas de azalea como sustrato trampa (95 aislados, 22.7%). El método menos eficaz de aislamiento fue el medio de PDA-antibióticos (48 aislados, 11.5%) (Figura 1a). El alto número de microorganismos aislados utilizando frutos de pera pudo haber sido consecuencia de una mayor área de contacto de los frutos con el suelo y de una exposición más prolongada. Las hojas de azalea y frutos maduros de pera se han utilizado como sustratos trampa para aislar otros organismos con resultados favorables. A diferencia de nuestros resultados, Yadav et al. (2014) aislaron Mortierella alpina en el medio PDA de manera eficiente.

Figura 1 Aislados de Mortierella asociados con la rizosfera de manzanos enfermos en cuatro de las principales localidades productoras de manzana en el estado de Chihuahua, México; a) número de aislados obtenidos por sustrato; b) número de aislados obtenidos por localidad. 

El número de aislados de Mortierella que se obtuvo en cada región se muestra en la Figura 1b. El mayor número de aislados (136, 32%) se obtuvo en la región de Cuauhtémoc. Webster y Weber (2007) demostraron que la frecuencia de aislamiento de cada hongo varía mucho, dependiendo del método de aislamiento, el medio de cultivo, la temperatura y otros factores durante el procesamiento de las muestras. La evidente variación en la abundancia de Mortierella en los huertos evaluados podría ser resultado de múltiples factores, como la ubicación geográfica, el tipo de suelo, el tipo de porta injertos, la edad de los árboles, las condiciones climáticas, el nivel de tecnificación, el contenido de materia orgánica, la vegetación existente, entre otros. Bosso et al. (2017) encontraron especies de Mortierella en suelo con diferentes usos y atribuyeron la alta presencia de Mortierella al posible control de fitopatógenos, ya que este género podría tener propiedades supresoras de enfermedades (Dedyukhina et al., 2014; Zlotek y Wojcik, 2014).

Se diferenciaron e identificaron 419 aislados de Mortierellales, de acuerdo con sus caracteres macro- y microscópicos distintivos, como el crecimiento radial en forma de flor de las colonias jóvenes de color blanco (Figura 2). Sin embargo, al crecer, algunas de las colonias cambiaron de color blanco a amarillo. El micelio de los aislados era hialino y cenocítico, pero en algunas, se observó la presencia de hifas septadas conforme maduraban (Watanabe, 2010). Se observaron también estructuras microscópicas típicas de la reproducción asexual de este género, lo mismo que estructuras de resistencia en forma de clamidosporas catenuladas e intercalares en la mayoría de los aislados (Figura 2, Cuadro 2; Watanabe, 2010). No se observaron estructuras de reproducción sexual como cigosporas. Park et al. (2001) demostraron que este tipo de estructura es poco común y suele estar rodeada de micelio cenocítico, y que los cambios morfológicos de Mortierella dependen de las condiciones de cultivo y del genotipo del aislado.

Figure 2 Morfología de Mortierella spp., a-c) características macroscópicas de M. alpina, M. alpina y Mortierella sp. sembradas en un medio de cultivo PDA; d-f) caracteres microscópicos, d) esporangiosporas hialinas y ovaladas, e) clamidospora intercalar, f) esporangios terminales. 

Cuadro 2 Principales caracteres microscópicos de aislados de Mortierella asociados con la rizosfera de manzanos enfermos en el estado de Chihuahua, México. 

Código del
aislado
Identificación molecular Forma de los
esporangios
Tamaño
(µm)
Esporangióforo
(µm)
Clamidospora
(µm)
Esporangiosporas
(forma)
G11 Mortierella sp. (TR065) Ovalado 5 43 Ausente
G3-2 M. alpina (FCF20120803) Esférico 5 50 Intercalar (5-10)
G17 M. alpina (ATT234) Esférico 5-7 35-50 Intercalar (5)
G18 M. alpina (C051D16) Ovalado 10 50 Intercalar (5-7)
G21 Mortierella sp. (FMR13-4) Ovalado 8-12 20 Intercalar (5)
G26 Mortierella sp. (MEL2385001) Esférico 5-10 40-55 Catenulada (7-10)
G29-1 M. alpina C08ID17 Esférico 10-15 30-50 Intercalar (7-10)
G61 M. alpina MUT: 5194 Ovalado 5-7 20-30 Intercalar (5)
G31 M. alpina strain xds08088 Esférico 5-10 50-60 Ausente
G12 M. alpina voucher RIFA 12B Esférico 10-7 40-70 Intercalar (8-10)
G54 M. alpina A03ID2 Esférico 10-7 30-50 Intercalar (5-7) Ovalada
G52 M. alpina ATCC16266 Esférico 7-10 30-50 Intercalar (5-7)
G14 M. alpina A01ID1 Ovalado 5-10 40-50 Ausente Ovalada
G44 Mortierella sp. FMR23-12 Esférico 10-15 30-40 Intercalar (5-10)
G16 M. gamsii aurium 1205 Esférico 5-10 20-40 Intercalar (7-10)
G2 Uncultured Mortierellales Esférico 5-10 30-50 Intercalar (5-10) Ovalada
G9 Mortierella sp. 11MA04 Esférico 5-10 20-40 Intercalar (7-10)
G25 M. capitata Ovalado 10 30-40 Catenulada (5-7)
G32 Mortierella sp. (FMR23-12) Esférico 5 40-50 Intercalar (5-10)
G35 Mortierella sp. F0210-20S2 Esférico 7-10 40-50 Intercalar (10-15)
G43 Mortierella sp. SD006 Ovalado 8-10 30-40 Ausente

Los fragmentos de ADNg obtenidos después de la amplificación de las muestras del hongo, con los iniciadores ITS4 e ITS5, mostraron mayor homogeneidad. De acuerdo con los caracteres morfológicos y las secuencias obtenidas de los productos de PCR, se determinó que 12 de los 21 aislados de Mortierellales pertenecían a Mortierella alpina, seis a Mortierella sp., uno a Mortierella gamsii, uno a Mortierella capitata y uno al orden de los Mortierellales (Figura 3). Todos los aislados mostraron de 99 a 100% de identidad y máxima verosimilitud con las puntuaciones moleculares y las claves taxonómicas, que corresponden a cada aislado y según las secuencias disponibles en la base de datos del GenBank (NCBI) (Altschul et al., 1990). Melo et al. (2014) encontraron M. alpina en tejidos de musgo antártico Schistidium antarctici, y demostraron que la presencia de Mortierella es muy frecuente. Estas diferencias podrían derivarse de la fuente de las muestras, ya que, en nuestro estudio, las muestras de suelo fueron recolectadas en agroecosistemas disturbados por actividades antropogénicas, principalmente por el uso intensivo de plaguicidas para el control de plagas agrícolas y el manejo de enfermedades. Nicola et al. (2017) descubrieron que Mortierella es un hongo que por lo general coloniza las raíces de las plantas y que normalmente se le asocia con enfermedades de replanteo de manzana. En nuestro estudio detectamos este proceso de replanteo en algunos huertos donde recolectamos las muestras.

Figura 3 Árbol de máxima verosimilitud de aislados de Mortierella obtenidos en la rizosfera de árboles de manzana enfermos en Chihuahua, México, con base en los resultados de BLAST utilizando las secuencias de la región ITS4 e ITS5 de cada aislado. La barra de escala representa las sustituciones de un nucleótido y los puntos de la rama numérica indican valores de soporte como porcentaje con base en 1,000 repeticiones de bootstrap (se muestran únicamente los valores > 50%). 

El árbol de máxima verosimilitud mostró diferencias genéticas entre los aislados de Mortierella. Según O’Donnell et al. (2001), algunos géneros, e incluso algunas especies, del orden Mucorales son polifiléticos, tal como se puede observar en el árbol filogenético de los diferentes aislados. Los aislados de Mortierellales no fueron patogénicos en los porta injertos de manzana G30. Bosso et al. (2017) demostraron que estas especies de hongos pueden ser consideradas antagonistas debido a su capacidad de producir diferentes sustancias que pueden ayudar en la defensa de las plantas como inductores de resistencia sistémica.

En Chihuahua existen varias especies de Mortierella asociadas con la rizosfera de los manzanos que muestran síntomas aparentes de enfermedades radiculares. El método más eficaz para el aislamiento de Mortierella incluyó el uso de frutos de pera como sustrato trampa.

Literatura citada

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW and Lipman DJ. 1990. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, 215:403-410. https://dx.doi.org/10.1016/S0022-2836(05)80360-2 [ Links ]

Bosso L, Lacatena F, Varlese R, Nocerino S, Cristinzio G and Russo D. 2017. Plant pathogens but not antagonists change in soil fungal communities across a land abandonment gradient in a Mediterranean landscape. Acta Oecologica, 78:1-6. https://doi.org/10.1016/j.actao.2016.11.002 [ Links ]

Dedyukhina EG, Chistyakova TI, Mironov AA, Kamzolova SV, Morgunov IG and Vainshtein MB. 2014. Arachidonic acid synthesis from biodiesel-derived waste by Mortierella alpina. European Journal of Lipid Science and Technology, 116:429-437. https://doi.org/10.1002/ejlt.201300358 [ Links ]

Hawksworth DL. 2001. The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited. Mycological Research, 105:1422-1432. https://doi.org/10.1017/S0953756201004725 [ Links ]

Ho SY, Jiang Y and Chen F. 2007. Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) content of the fungus Mortierella alpina isolated from Soil. Journal of Agricultural of Food Chemistry, 55:3960-3966. https://doi.org/10.1021/jf0700071 [ Links ]

Melo IS, Santos SN, Rosa LH, Parma MM, Silva LJ, Queiroz SCN and Pellizari VH. 2014. Isolation and biological activities of an endophytic Mortierella alpina strain from the antarctic moss Schistidium antarctici. Extremophiles, 18:15-23. https://doi.org/10.1007/s00792-013-0588-7 [ Links ]

Nicola L, Turco E, Albanese D, Donati C, Thalheimer M, Pindo M, Cavalieri ID and Pertot I. 2017. Fumigation with dazomet modifies soil microbiota in apple orchards affected by replant disease. Applied Soil Ecology, 113:71-79. https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2017.02.002 [ Links ]

O’Donnell KL, Lutzoni FM, Ward TJ and Benny GL. 2001. Evolutionary relationships among Mucoralean fungi (Zygomycota): Evidence for family polyphyly on a large scale. Mycologia, 93:286-296. https://doi.org/10.2307/3761650 [ Links ]

Park EY, Koike Y, Cai HJ, Higashiyama K and Fujikaya S. 2001. Morphological diversity of Mortierella alpina: Effect of consumed carbon to nitrogen ratio in flask culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 6:161-166. https://doi.org/10.1007/BF02932544 [ Links ]

Raeder U and Broda P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology, 1:17-20. http://dx.doi.org/10.1111/j.1472-765X.1985.tb01479.x [ Links ]

Rayaroth A, Tomar RS and Mishra RK. 2017. Arachidonic acid synthesis in Mortierella alpina: Origin, evolution and advancements. Proceedings of the National Academy of Sciences, India, Section B: Biological Sciences, 87:1053-1066. https://doi.org/10.1007/s40011-016-0714-2 [ Links ]

Ruiz-Cisneros MF, Rios-Velasco C, Berlanga-Reyes D.I, Ornelas-Paz JJ, Acosta-Muñiz CH, Romo-Chacón A, Zamudio-Flores PB, Pérez-Corral DA, Salas-Marina MÁ, Ibarra-Rendón JE, and Fernández-Pavía SP. 2017. Incidence and causal agents of root diseases and its antagonists in apple orchards of Chihuahua, Mexico. Revista Mexicana de Fitopatología, 35:437-462. https://doi.org/10.18781/R. MEX.FIT.1704-3 [ Links ]

Tamura K, Glen S, Peterson D, Filipski A and Sudhir K. 2013. MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30:2725-2729. https://doi.org/10.1093/molbev/mst197 [ Links ]

Watanabe T. 2010. Pictorial atlas of soil and seed fungi: Morphologies of cultured fungi and key to species (3rd ed.):153-155. CRC Press. [ Links ]

Webster J and Weber R. 2007. Introduction to fungi. Cambridge University PresWhite TJ, Bruns, T, Lee SB and Taylor JW. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ and White TJ, Eds. PCR protocols: A guide to methods and applications, Academic Press, New York, 315-322. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-372180-8.50042-1 [ Links ]

Yadav DR, Kim SW, Babu AG, Adhikari M, Kim C, Lee HB and Lee YS. 2014. First report of Mortierella alpina (Mortierellaceae, Zygomycota) isolated from crop field soil in Korea. Mycobiology, 42:401-404. https://doi.org/10.5941/MYCO.2014.42.4.401 [ Links ]

Zlotek U and Wójcik W. 2014. Effect of arachidonic acid elicitation on lettuce resistance towards Botrytis cinerea. Scientia Horticulturae, 179:16-20. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2014.08.026 [ Links ]

Recibido: 09 de Octubre de 2017; Aprobado: 13 de Diciembre de 2017

* Autor para correspondencia: claudio.rios@ciad.mx.

Creative Commons License Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons